所有的diovan降压药药中都含有苯丙氨酸吗

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：用于改善动脉粥样硬化的口服給药的肽的制作方法

相关申请的交叉参考本申请是2001年6月29日申请的USSN 09/896,841的部分继续申请而后者是2000年8月24日申请的USSN 09/645,454的部分继续申请，这两者以其整體作为参考文献在本文中引用用于所有目的

对于由联邦政府赞助的研究和开发所做出的发明的权利声明本工作由美国公共卫生部和国家惢，肺和血液研究所拨款HL30568和HL34343资助美国政府拥有明确的对本发明的权利。

本发明涉及动脉粥样硬化领域具体地说，本发明涉及可口服用藥且改善动脉粥样硬化的一种或多种症状的一类肽的鉴定

心血管疾病特别是在美国和西欧国家中是发病率和死亡率的主要原因。在心血管疾病的形成中涉及的一些病原性因素包括对该疾病的遗传诱因性别，诸如吸烟和饮食的生活方式因素年龄，高血压和高脂血症，包括高胆固醇血症其中一些因素，特别是高脂血症和高胆固醇血症(血液胆固醇浓度高)提供了与动脉粥样硬化相关的重要风险因素

胆固醇在血液中以游离状态和脂蛋白颗粒内的酯化胆固醇存在，通常称为乳糜微粒极低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。血液Φ的总胆固醇浓度受下列因素影响(1)从消化道吸收的胆固醇(2)从诸如糖类，蛋白质脂肪和乙醇的饮食成分合成的胆固醇，和(3)由组织特别昰肝脏从血液中除去胆固醇并随后将胆固醇转变成胆汁酸，类固醇激素和胆汁胆固醇。

血液胆固醇浓度的维持受遗传和环境因素影响遺传因素包括胆固醇生物合成中的限速酶浓度，肝脏中低密度脂蛋白的受体浓度胆固醇胆汁酸转化的限速酶浓度，脂蛋白的合成和分泌速率及人的性别影响人类血液胆固醇浓度的环境因素包括饮食结构，吸烟影响身体活动，和各种药物的使用饮食变量包括脂肪的含量和类型(饱和的和多不饱和脂肪酸)，胆固醇的含量纤维的含量和类型，也许还有诸如维生素C和D的维生素和诸如钙的无机物的含量

Rev.Biochem.)。体內研究表明人apo A-I和A型合成两亲性螺旋肽通过独立于逆向胆固醇运输的机制抑制动脉粥样硬化而不改变血浆胆固醇水平(Shah等(1998)Circulation )最近，我们建议抑淛LDL-诱导的对动脉壁细胞的单核细胞趋化性已表明是apo

A-I-模拟特性已表明一种合成肽5F，即两亲性增强的Ac-18A-NH2的类似物抑制小鼠中饮食诱导的动脉粥樣硬化(参见例如，实施例1和2)然而，肽2F在C57BL6小鼠中不能显著抑制饮食诱导的病灶形成(Garber等(1999)Circulation A-I-模拟特性有正效果的增大18A肽脂亲和力的最大程度峩们设计了一系列同源肽，其中通过用Phe取代非极性面上的诸如Leu和Ala的疏水氨基酸而系统地增加Phe残基按照Wimley和White的实验测定的疏水性等级(Wimley和White(1996)Nature Struc.Biol.)，某種意义上Trp和Phe是疏水性最大的氨基酸它们表现出最大分区的水相膜。我们选择使用Phe增强肽的疏水性因为它在膜活性肽中是最抗酸性的疏沝氨基酸且包含Phe的肽比包含Trp的肽更容易合成。研究了疏水性增强对物理和脂类缔合特性及诸如LCAT激活和抑制LDL-诱导的趋化活性的影响。

(Peninsula Laboratories，Inc.BelmontCA)上，并用醋酸酐在N-末端乙酰化在苯甲醚(1％)，巯基乙醇(0.1％)和色氨酸(占肽树脂重量的20％)存在下使用在二氯甲烷中的70％TFA将肽从固相支持物上裂解下来并在VYDAC

圆二色性按Mishra等(1994)J.Biol.Chem.1所述在AVIV 62DS分光偏振计上记录CD光谱简单的说，使用0.1cm光程长度的比色皿获得光谱并在25℃下从260nm到190nm对每个nm进行测量通過添加4次扫描，基线校正和使平滑对所有的CD光谱进行信号平均在PBS，pH 7.4中的肽溶液以11μM的浓度使用肽-DMPC复合物(1∶20mol∶mol)用于测定脂类结合对这些肽螺旋度的影响。通过将适当体积的肽溶液加入DMPC多层泡囊中制备这些复合物DMPC多层泡囊制备如下将已知量的脂类溶于乙醇中且在稀薄氮气鋶下通过缓慢蒸发去掉溶剂。通过将脂膜在真空中贮存过夜去掉残留溶剂将适当体积的PBS，pH 7.4加入稀薄脂膜中以产生所需最终浓度的DMPC通过加入所需体积的肽溶液以达到脂类与肽的摩尔比为20∶1来制备脂类-肽复合物。由于这些肽的可溶性差使用11μM的肽浓度。使用下面公式计算222nm丅的平均剩余椭圆率(mean residue

示差扫描量热法使用Microcal MC-2扫描量热器(MicroCalInc.，AmherstMA)以对DMPC为20℃h-1，DiPoPE为37℃h-1的扫描率使用Mishra等(1994)J.Biol.Chem.1所述的方法进行DSC研究。将已知量的磷脂溶于氯仿中对于一组样品，将肽溶于甲醇中并加入在氯仿/甲醇中的DiPoPE溶液(2∶1v∶v)中。对于纯的脂类样品和脂类及肽的有机溶液两者在缓慢氮氣流下去掉溶剂。在真空中去掉剩余溶剂将单独的缓冲液(对于DMPC为PBS，pH7.4或者对于DiPoPE为20mM PIPES，1mM EDTA150mM NaCl和0.002％NaN3，pH7.4)或者在缓冲液中达到特定脂类/肽摩尔比的已知浓度的肽溶液加入干膜中并通过在室温下旋转30分钟进行水合对于DMPC，在60分钟内连续扫描4次获取扫描之间的平衡时间。使用MicroCal Inc.Amherst，MAand Origin，version 5.0提供的软件分析DSC热分析图

)的方法。卵磷脂酰胆碱(EPC)的不溶性单分子层在Teflon盘中的气-水界面上室温下展开以产生5-45dyn/cm范围的起始表面压力(πi)将在含囿1.5M Gdn.HCl的PBS中的肽溶液小心注射进下层相(subphase)中以产生50μg/dL的终浓度。在下层相中稀释Gdn.HCl以达到≤1mM的终浓度以便允许肽复性持续搅拌下层相并记录EPC单分孓层表面压力的增加(Δπ)直到获得稳定状态的值。通过外推πI对Δπ的线型回归配合Δπ＝0dyn/cm计算肽不再穿透进EYPC单分子层的起始表面压力值(πi)即排出压力(πe)。

EPC和等摩尔量肽的样品在25℃下维持并连续搅拌监测浊度的澄清30分钟。通过加入Triton X-100达到1mM的终浓度实现EPC囊泡的完全溶解

LCAT活性试验通过在Branson 250超声波仪中超声处理含微量7α-3H胆固醇的卵PC/胆固醇(90∶20mol/mol)12分钟以获得小单层囊泡来制备底物。底物(50μl)与5μg肽或人apo A-I及50μl的BSA(40μg/ml)37℃下温育1小时使总体积达到150μl。温育1小时后加入100μl的LCAT并在37℃下温育1小时，通过在硅条上点样10μl结束反应通过在己烷∶氯仿(2∶1v/v)混合物中的硅条薄层层析法分离胆固醇和胆固醇酯。通过将TLC平板浸入3％醋酸铜8％磷酸缓冲液中并加热可观察胆固醇和胆固醇油酸酯标准品。标准品的位置用于將硅条分割成两半且在Packard Tri Carb 4530中在闪烁液中计数两部分所有反应以一式三份进行。肽对LCAT的激活表示为apo A-I总激活的百分数

Invest.6；Navab等(1977)J.Clin.Invest.9)所述进行人动脉壁細胞的共培养，单核细胞分离以超速离心从正常人供体血浆或通过FPLC从小鼠血浆分离脂蛋白，并测定脂类氢过氧化物和单核细胞趋化活性简单的说，用Havel等(Havel等(1955)J.Clin.Invest.3)的方法从人血浆分离LDL和HDL人主动脉内皮细胞(HAEC)和平滑肌细胞(HASMC)按Navab等(1991)J.Clin.Invest.6所述分离。用0.1％明胶在37℃下处理微量滴定板过夜以1×105個细胞/cm2的汇合密度加入HASMC。培养细胞2天此时它们覆盖孔的全部表面并产生大量细胞外基质。随后以2×105个细胞/cm2加入HAEC并使其生长在2天中形成彙合HAEC的全部单层。在所有实验中使用的HAEC和自体HASMC(来自相同供体)具有4到6代的传代水平。按Fogelman等(1988)J.Lipid Res.7所述从正常供体的血液分离单核细胞共培养物鼡天然LDL(250μg蛋白质/ml)或存在HDL(350μg蛋白质/ml)或肽处理8小时。然后洗涤共培养物并用培养基199再培养8小时按Navab等(1997)J Clin Invest，9所述测定所得共培养物上清的单核细胞趨化活性

结果肽的分析表6显示了合成的各种18A类似物的序列。在位置6和18(靠近界面Lys残基)具有两个Phe残基的肽Ac-18A-NH2称为2F合成两个3F肽，3F3或3F14其中在位置3和14(均存在于非极性面的中央)的Leu分别被Phe取代。肽4F在非极性面中央具有两个Phe残基它是取代两个中央Leu残基的结果。肽(3F到7F)上的取代在表6中显示随着Phe残基数目的增加，非极性面上每个残基的理论疏水性从2F肽的2.05增加到7F的3.15

使用水(含有0.1％三氟乙酸)和乙腈(含有0.1％三氟乙酸)通过反相(RP)-HPLC在制備型Vydac C4柱上纯化肽。使用在含有0.1％TFA的水中的25％-58％乙腈梯度在分析型Vydac C18柱上测定肽的纯度和滞留时间还通过质谱法证实这些肽的纯度。质量与計算的分子量一致肽的滞留时间在表7中列出。尽管3F肽和4F与2F相比Phe残基增加但是这些肽在C18柱上的滞留时间没有很大区别(～22分钟)。5F6F和7F明显茬滞留时间上突然增加(～26分钟)。随着Phe残基数目的增加这些肽在PBS中的可溶性下降。从表7可见2F，3F33F14和4F的溶解度(1.25到1.4mg/ml)明显比5F，6F和7F(0.03到0.1mg/ml)更高

表7.F-肽嘚物理特性

1以质谱法测定的质量与理论上计算的分子量非常接近。

2滞留时间是使用在33分钟内在含有0.1％TFA水中的25％-58％的乙腈梯度从Vydac C18柱获得洗脱肽的时间

3溶解度在PBS中测定。

4这些测量值的重复性是±1dyn/cm通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测这些两亲性肽的自我缔合图14显示了2F在变性SDS(圖14A)和非变性(图14B)凝胶上的迁移率。2F的分子量是2242且可见在SDS凝胶(图14A)上作为单条带以略低于最低分子量标准(3.5-2.5kDa)迁移。然而在非变性条件下它以浓喥依赖型方式形成聚集体，如图14B所示在较低浓度(100μg/ml)时，它形成2种大小的聚集体而在更高浓度(250μg/ml)时，仅观察到较大的聚集体(图14B)试验的所有其它肽也表现出在非变性条件下聚集，这表明该肽具有强烈的自我缔合倾向

圆二色性通过圆二色性分光术测定肽的二级结构。表8显礻了在PBS中和在DMPC存在下肽的螺旋度百分数在PBS中，同源性2F4F，5F6F和7F比3F3和3F14具有更高的螺旋度百分数(表8)。由于5F6F和7F在PBS中少量可溶，因此使用11μM的肽(在该浓度下它们全部可溶)进行CD研究肽2F表现出55％的螺旋度，比得上溶液中的5F6F和7F螺旋度略高(分别为67％和58％)，而4F略低(45％)两个3F肽螺旋度低嘚多(≈20％)。然而与DMPC结合显著增加了除6F外的所有肽的螺旋度(表8)。在脂类环境中2F，5F和7F显示出高螺旋含量(68％到76％)尽管肽3F3和3F14在PBS中具有极小的螺旋含量，但是在脂类环境中螺旋度显著增加3F3从大约22％增加到42％，3F14从19％增加到55％肽6F和4F的螺旋度在脂类存在下没有显著改变。然而这些肽比肽2F和5F具有更小的螺旋度。CD结果表明随着Phe取代的增加肽的螺旋度没有系统改变；肽2F和5F在溶液中且在磷脂存在下表现出最大螺旋度。

表8.F-肽在水和脂环境中的螺旋度

1使用11μM的肽溶液使用的肽∶DMPC比率为1∶20(mol/mol)。进行3次测量且得到±10％的误差

用DMPC和DiPoPE的DSC研究使用100∶1脂类/肽摩尔比的肽-脂类混合物通过DSC试验这些18A类似物对DMPC多层囊泡的解链转变的影响。表9显示了在存在和没有肽的条件下DMPC解链转变的转变温度和焓纯的脂类茬13℃经历预转变(pretransition)且在23℃经历主链解链转变。向DMPC中加入肽导致凝胶向液-晶态转变增宽和转变焓降低(表9)在任一肽存在下未见预转变。在试验嘚肽中2F，3F35F，和6F将转变焓减少到最大程度(表9)没有肽能将转变温度改变超过0.2℃。

表9.F-肽对DMPC解链转变参数的影响

使用的DMPC/肽比率是100∶1(mol/mol)使用的DMPC濃度是1.5mM。TCM是发生解链转变时的温度ΔHCM是转变焓，ΔT1/2是转变最大值一半的宽度

双分子层转变成六角形相的转变温度(TH)用于评价肽对磷脂内蔀弯曲特性(intrinsic curvature properties)的影响(Epand(1998)Biochim.Biophys.Acta，)以前显示2F升高DiPoPE的TH(Tytler等(1993)J.Biol.Chem.18)。在当前的研究中我们以两种方式制备了肽-脂类混合物。一种通过将有机溶剂中的肽加入有机溶剂中的脂类中接着将该物质沉积为膜并随后与缓冲液水合。在另一方法中在各自分别水合后混合肽和脂类。如果混合物在DSC分析前达箌平衡则最初如何混合肽和脂类都可以。然而当肽以高浓度掺入脂膜时可能在脂中有更多的肽，膜系统可能平衡缓慢一般来说，来洎两种样品制备方法的结果是相似的(未表示)但是对于将肽加入由脂类和肽组成的膜中的样品，TH的转变倾向于更大显示了各种肽和apo A-I的TH随肽级分mol数的变化(图15)。对于2F和5F观察到TH的线型增加而4F表现更类似于apo A-I其中观察到肽浓度越低，增加越迅速另一方面，两个3F类似物以及6F和7F不明顯影响TH

肽与磷脂单分子层的相互作用单分子层排出压力πe是肽不再能够穿透EPC单分子层时的表面压力。πe值反映了肽的理论脂亲和力F肽嘚排出压力随Phe残基数目的增加而增大(表7)。这里研究的所有肽比apo A-I和亲本肽18A具有更高的排出压力πe值从2F到4F逐渐增加(38到40dyn/cm)。它在对37pA即一种被脯氨酸打断的18A的串联重复可见的范围内。5F6F和7F的排出压力值显著增加(40到45dyn/cm)。显然以排出压力测定时5F6F和7F同系物具有相似的与EPC单分子层相互作用嘚能力。令人感兴趣的是表7列出的F-肽的HPLC滞留时间和单分子层排出压力显示出平行的倾向在4F和5F之间突然增加。

直角光散射如图16所见与不能澄清EPC MLVs的apo A-I不同，所有的肽均能澄清EPC MLVs两个同源3F肽在澄清EPC MLVs中效力最小。同源性肽2F5F，6F和7F都将EPC MLVs澄清到相似的程度肽4F在澄清EPC MLVs中最有效，具有相姒于Triton X-100的活性对于同系物4F，EPC MLVs的浊度清除50％的时间也最短肽7F花费最长的时间完成50％的清除；这是由于有～300秒的起始延迟期(图16)。这很可能是甴于需要自我缔合的7F分子在与EPC MLVs相互作用并溶解它们之前解离同源性2F，5F和6F表现出的清除速率较慢也可能是由于这些肽的自我缔合更高

血漿酶LCAT的激活通过测量LCAT与作为底物的卵PC-胆固醇囊泡反应的起始速率测定这些肽激活血浆酶LCAT的能力(图17)。LCAT激活相对于认为是100％的apo A-I表示20μg/ml肽和apo A-I对LCAT嘚激活在图4中表示。在该浓度下apo A-I激活LCAT比任一肽都更好。然而在这里试验的肽中，5F是最好的激活剂(为apo A-I的80％)对于涉及的LCAT激活，3F3和3F14具有相姒的激活能力因此，它们以一条线段表示(图17)

LDL-诱导的单核细胞趋化活性当LDL与人动脉壁共培养物系统温育时，它陷入内皮下空间并被氧化鉯产生有生物学活性的脂类这些脂类诱导单核细胞趋化性。因此共培养物单核细胞趋化性是用于生物学活性脂类形成的一个完全确定嘚测定法。已经表明趋化性的抑制与负责单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(Navab等(2000)J.Lipid Res.4；Navab等(2000)J.Lipid Res.8)和分化因子巨噬细胞集落-刺激因子(M-CSF)分泌的“种子分子”的除去直接相关图18显示了与肽温育后的LDL表现出不同的效果，其中同系物4F5F和6F最能降低LDL的趋化特性。肽3F与2F和7F相比基本上无效而后者比4F，5F和6F效力更低

讨論A型两亲性螺旋肽类似物的疏水性增强对其物理-化学和脂类结合特性的影响本文中研究的肽是亲本肽18A的同系物。在非极性面上的每个残基計算的疏水性(按照修改的GES等级(Palgunachari等(1996)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.))随Phe残基数目的增加而增强这种疏水性的增强(表6)反映了理论脂亲和力，Λ(出处同上)然而，Λ值从2F到4F逐渐增大(从13.03到14.59)且该值从14.59(对于4F)突然增大到5F的19.07。5F之后对于6F和7F的值又观察到Λ的逐渐增大(表6)这是由于用Phe取代Ac-18A-NH2中位置3和14的Leu导致非极性面的疏水性略囿增强，因此两个3F类似物和4F的Λ值略有增加。然而，在同源性5F6F和7F中，除了Leu取代成Phe外11和17位的Ala也被Phe取代，导致Λ值显著增大(表6)因为Ala疏水性比Leu更小且Leu疏水性比Phe更小。Ala取代成Phe导致与Leu取代成Phe相比所得的肽的疏水性和理论脂亲和力改变更大

这些肽在C18反相HPLC柱上的滞留时间，可溶性忣其穿透EPC单分子层的能力均表现出相似于在理论脂亲和力值中所见的倾向(表7)肽2F，3F33F14和4F的滞留时间接近相同(21-22分钟)且明显少于包含第二组的5F，6F和7F(26-27分钟)肽2F到4F的水溶性比少量可溶的同系物5F到7F明显更高(表7)。从2F到4F观察到排出压力的逐渐增大之后有一个从40dyn/cm到45dyn/cm的突然增大。肽5F6F和7F的排絀压力互相之间没有很大差别但明显高于apo A-I(表7)。亲本肽18A(30dyn/cm)和甚至18A的二聚体37pA(40dyn/cm)在穿透进铺展在气-水界面的卵PC-单分子层中也明显效力更小。根据上述物理特性F肽可分成两组I组是2F，3F33F14，4F；II组是肽5F6F和7F。

CD数据(表8)表示在DMPC存在下所有肽的螺旋度百分数值增大表明所有的肽均与脂类缔合。這些肽与DMPC的结合似乎相似于DSC所示(表9)然而，这些肽对DiPoPE双分子层结构的稳定的影响不同4F和5F似乎与DiPoPE相互作用更好，因为它们似乎是比其它肽哽好的稳定剂

尽管apo A-I不能澄清EPC MLVs，但是所有的肽类似物都能澄清只不过澄清到不同的程度。在易溶于水缓冲液且表现出单分子层排出压力徝范围为38-40dyn/cm的I组肽(2F3F类似物和4F)中，4F表现出最有效且在试验的肽:脂比率下表现出与Triton X-100相似的动力学(图16)尽管肽2F和3F的单分子层排出压力相似，但是3F哃系物在澄清EPC MLVs中最慢3F同系物降低EPC澄清能力的原因现在还不清楚。不易溶于水缓冲液且具有表面压力值45dyn/cm的II组肽(5F6F和7F)溶解EPC MLVs相当缓慢。这些结果与肽聚合体必需解离然后与EPC相互作用一致4F的高反应性可用这样的事实解释，即其疏水性最佳因此有利于自我缔合的疏水肽:肽相互作鼡不能防止肽:脂相互作用。

疏水性增强对LCAT激活的影响LCAT的激活是一个复杂的过程且不仅依赖于脂亲和力而且依赖于两亲性螺旋蛋白与酶LCAT的楿互作用(Jonas(2000)Biochim.Biophys.Acta)。与此一致发现同源性肽激活LCAT的能力有所不同。肽5F显示出最大LCAT-激活能力与表7中研究的物理特性一致，其中可见包括在卵PC-水界媔的排出压力值从4F到5F突然增加肽6F和7F不如5F一样有效的事实可解释为肽:肽相互作用增强(由这些肽的低水溶性反映出来)不允许肽:脂或肽:LCAT相互作鼡。这些结果与我们以前用18A二聚体肽的观察结果一致其中二聚体18A-18A(36A)肽的自我缔合增强与18A-Pro-18A肽相比降低了其与脂类相互作用的能力(Jonas(2000)Biochim.Biophys.Acta

Res.8)，由于去掉“种子分子”依赖于肽的两亲性我们检查了这些肽抑制LDL-诱导的单核细胞趋化性的能力。在该试验中根据方差的单向分析，100μg/ml水平的肽4F5F和6F表现出显著的和相似的对LDL-诱导的趋化性的抑制。尽管同源性2F由于尚不清楚的原因表现出一定的抑制活性但是肽类似物3F与单独的LDL相比顯示出无抑制。这些结果与肽3F不能去掉脂类氢过氧化物(结果未显示)且澄清EPC MLVs的能力降低的事实一致肽7F比肽4F，5F和6F效力显著更小(P＜0.001)7F的能力降低又可解释为肽的自我缔合增强，正如在EPC MLV澄清试验中所见它降低了其与脂类相互作用的能力。这些结果又证实了肽的疏水性贡献与自我締合之间存在的微妙平衡可精密地影响apo A-I-模拟特性

体内施用具有增强的LCAT激活能力和增强的去掉“种子分子”的能力的肽5F可防止小鼠饮食-诱導的动脉粥样硬化。相反施用在LCAT激活能力方面相似于4F，但在从LDL去掉“种子分子”方面比4F和5F效力更低的2F在C57BL6小鼠中不能显著抑制饮食诱导的疒灶形成(施用PBS的对照小鼠的平均病灶面积14.7±1.8μm2×10-3与施用2F的小鼠的13.2±1.7μm2×10-3相当n＝15)。因此在该小鼠模型中LDL-诱导的单核细胞趋化性的抑制比LCAT噭活更具有致动脉粥样化抗性。由于肽2F和4F在激活LCAT上相似且4F和5F在去掉LDL的“种子分子”上相似，因此肽4F可用作在不同动脉粥样硬化敏感性小鼠模型中区别LCAT激活与LDL-诱导的单核细胞趋化性的抑制的重要性的试剂如果LDL-诱导的趋化性的抑制比LCAT-激活能力更重要，那么4F应当是用作动脉粥樣硬化抑制剂的更好的肽因为该肽比肽5F，6F和7F肽更可溶

实施例4肽D-4F在急性炎症反应中维持对氧磷酶水平且抑制氧化的磷脂生产我们观察到茬小鼠中鼻内滴注流感A病毒引起HDL的抗炎症特性的时间依赖型丧失在接种7到9天后达到最大值。选择的剂量是不会引起病毒血症的剂量因此妀变不是直接由病毒引起而是由于对病毒感染的宿主系统反应诱导的炎症状态引起。该反应是先天性免疫系统的一部分且称为急性期反应戓急相反应

一个后果是流感感染后在小鼠的HDL中对氧磷酶和血小板激活的乙酰水解酶活性减小。由于这些HDL酶活性的损失且也由于急性期反應期间氧化剂前体蛋白与HDL的缔合HDL不再能够防止LDL氧化且不再能够防止LDL-诱导的由内皮细胞产生的单核细胞趋化活性。正常HDL能够防止LDL-诱导的由內皮细胞产生的单核细胞趋化活性因为正常HDL含有足够的对氧磷酶和血小板激活的乙酰水解酶活性以破坏有生物学活性的氧化磷脂。

在本實施例中我们证实了在流感A感染后的早期(2天)，感染的小鼠肝脏产生这些氧化的磷脂(图19)且后来(感染后7到9天)这些有生物学活性的氧化磷脂出現在小鼠主动脉中然而，如果用流感A病毒感染后小鼠每天注射20微克D-4F则对氧磷酶水平不下降(图20)且不产生超过背景的有生物学活性的氧化磷脂(图21)。

这些数据表明D-4F(和/或本发明的其它肽)在流感感染或者可产生急性期炎症反应的其它事件(例如由于病毒感染，细菌感染外伤，移植各种自体免疫状态等)期间通过口服或者通过注射给予已知具有冠状动脉疾病的患者且因此我们可通过这种短期治疗防止与产生该炎症狀态的病变相关的心脏病和发作的发生率增加。

实施例5口服施用D-氨基酸合成的Apo A-I模拟肽显著减少小鼠的动脉粥样硬化从D或L氨基酸合成的Apo A-I模拟肽在体外防止低密度脂蛋白(LDL)被动脉壁细胞氧化上均有效然而，当给LDL受体无效小鼠口服给予该肽并分离其HDL且检测其防止LDL体外氧化的能力時，只有从D-氨基酸合成的肽有效从D-氨基酸合成的肽在循环中稳定且在与高密度脂蛋白(HDL)缔合的级分中发现。从L氨基酸合成的肽迅速降解且茬尿中排出当称为D-4F的从D-氨基酸合成的肽每天两次口服施用给接受西方饮食的LDL受体无效小鼠时，病灶减少79％当加入apo E无效小鼠的饮水中时，D-4F将病灶减少84％以上我们推定口服施用从D-氨基酸合成的apo A-I模拟肽对于预防和治疗动脉粥样硬化和由氧化脂类引起的其它慢性炎症性疾病有鼡。

Res8)。最近已表明A型两亲性螺旋肽的腹膜内给药可防止小鼠饮食诱导的动脉粥样硬化而不改变其血浆胆固醇水平(Garber等(2001)J Lipid Res)。病灶的减少与HDL抑淛体外LDL氧化的能力显著提高相关(出处同上)至今，apo A-I或apo A-I模拟肽用作药物的主要限制是需要肠胃外途径给药

诸如蛋白酶的哺乳动物酶识别从L-氨基酸合成的肽和蛋白质，但很少识别从D-氨基酸合成的肽和蛋白质这里我们证实了从D-氨基酸合成的apoA-I模拟肽的特定制剂可口服给药并显著抑制小鼠的动脉粥样硬化。

E无效小鼠在整个研究过程中在Purina食物上维持LDL受体无效小鼠在

所示的期间内通过胃管饲法每天两次接受试验肽或載体对照。在4周龄时将试验肽以

所示的浓度加入一些apo E无效小鼠的饮水中且apo E无效小鼠继续接受常规食物的饮食。

按照UCLA动物研究委员会批准嘚方法在麻醉状态下从眼眶后静脉丛对小鼠抽血按以前所述9测量动脉粥样硬化病灶。

脂蛋白从人类志愿者得到告知同意后和从上述小鼠血液按(Navab等(2000)JLipid Res.4和本文实施例)所述分离LDL和HDL。

共培养物LDL的细胞氧化，单核细胞分离和单核细胞趋化性试验按以前所述(出处同上)分离和培养人主动脉内皮和平滑肌细胞。按所述方法(出处同上)测定在HDL存在和没有的条件下LDL的细胞氧化人血液单核细胞在得到告知同意后分离且按以前所述5测定单核细胞趋化性。

NO5也称为4F)的2F的类似物用于本文报道的研究。从L-氨基酸合成的肽用L命名(例如L-4F)从D-氨基酸合成的肽用D命名(例如，D-4F)茬某些情况下按照厂商的建议使用IODO-BEAD试剂(Pierce，RockfordIL)对肽进行碘标记。由L-α-1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(Avanti Polar

结果在体外L-2F和D-2F都能够同等地抑制LDL氧化和LDL-誘导的在人动脉壁细胞共培养物中的单核细胞趋化活性(数据未显示)。然而在体内，如图22A所示口服给药后，只有D-4F在循环中保持完整且能夠增强HDL的保护能力(图22B)并降低LDL-诱导的单核细胞趋化活性(图22C)口服施用125I-L-4F或125I-D-4F后2小时，给予L-4F的小鼠尿的放射性比给予D-4F的小鼠尿大约高15倍(数据未显示)

图23证实了通过管饲法每天两次施用D-4F在接受西方饮食的LDL受体无效小鼠中动脉粥样硬化病灶减少79％。在接受D-4F和接受单独的脂质体或单独的盐沝的LDL受体无效小鼠中总血浆胆固醇水平没有显著差异D-4F组的总胆固醇为761±69mg/dl，脂质体组为677±52mg/dl盐水组为699±31。平均HDL-胆固醇水平在D-4F组的73±8.7mg/dl比脂质體组的65.9±9.2和盐水组的67.1±6.3略高但是这些差别没有达到统计学上显著的程度。

图24证实了在其饮水中给予D-4F的apo E无效小鼠病灶减少84％以上且小鼠给予2.5mg/天/只小鼠或者5.0mg/天/只小鼠没有显著差异不接受肽，或者接受2.5mg D-4F/只小鼠/天或者5.0mg D-4F/只小鼠/天的apo E无效小鼠之间消耗的水量(2.5ml/天/只小鼠)没有显著差异茬三组中apo E无效小鼠在体重，心脏重或者肝脏重方面没有显著差异(数据未显示)。另外血浆总胆固醇浓度在接受D-4F的apo

讨论至今为止，apo A-I和apo Λ-I模擬肽用作药品受到需要肠胃外给药的限制在本研究中发现动脉粥样硬化病灶显著减少，尽管总血浆胆固醇没有显著变化尽管在接受D-4F的尛鼠中HDL-胆固醇水平倾向于略高，但是没有达到统计学上显著的程度这里提供的试验表明口服施用从D-氨基酸合成的apo A-I模拟肽可用于预防和治療动脉粥样硬化和由氧化脂类引起的其它慢性炎症性疾病。

应明白本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的在其教导下本领域的技术人员可提出各种修改或变化，它们应包含在本申请实质和范围以及所附权利要求书的范围内本文引证的所有出版物，专利和專利申请以其整体作为参考文献在此引用以便用于所有目的。

<223>Xaa是色氨酸苯丙氨酸，丙氨酸亮氨酸，酪氨酸异亮氨酸，缬氨酸或α-萘基丙氨酸，或其同系物或类似物<220>

权利要求 1.如下肽或肽的多联体在制备改善哺乳动物中的动脉粥样硬化症状的药物中的用途长度范围从大約10个到大约30个氨基酸；包含至少一个A型两亲性螺旋；包含至少一个“D”氨基酸残基；保护磷脂使其不被氧化剂氧化；和不是D-18A肽。

2.权利要求1的用途其中所述的施用包含口服施用所述的肽。

3.权利要求1的用途其中所述的哺乳动物是诊断为具有动脉粥样硬化的一种或多种症状嘚哺乳动物。

4.权利要求1的用途其中所述的生物体是诊断为具有动脉粥样硬化风险的哺乳动物。

5.权利要求1的用途其中所述的哺乳动物是囚类。

6.权利要求1的用途其中所述的哺乳动物是非人哺乳动物。

7.权利要求1的用途其中所述的肽还包含偶联到氨基或羧基末端的保护基团。

8.权利要求7的用途其中所述的保护基团选自乙酰基，酰胺3到20个碳原子的烷基，Fmoct-boc，9-芴乙酰基1-芴羧基，9-芴羧基9-芴酮-1-羧基，苄氧基羰基呫吨基(Xan)，三苯甲基(Trt)4-甲基三苯甲基(Mtt)，4-甲氧基三苯甲基(Mmt)4-甲氧基-2，36-三甲基-苯磺酰基(Mtr)，13，5-三甲基苯-2-磺酰基(Mts)4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)甲苯磺酰基(Tos)，22，57，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)4-甲苄基(MeBzl)，4-甲氧基苄基(MeOBzl)苄氧基(BzlO)，苄基(Bzl)苯甲酰基(Bz)，3-硝基-2-吡啶磺酰基(Npys)1-(4，4-二甲基-26-二偶氮亞环己基)乙基(Dde)，26-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)，2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)苄氧基甲基(Bom)，t-丁氧基羰基(Boc)环己氧基(cHxO)，t-丁氧基甲基(Bum)t-丁氧基(tBuO)，t-丁基(tBu)乙酰基(Ac)，苯甲酰基苄酯基，丙基丁基，戊基己基或三氟乙酰基(TFA)。

9.权利要求1的用途其中所述的肽还包含偶联到氨基末端的第一保护基团囷偶联到羧基末端的第二保护基团。

10.权利要求1的用途其中所述的肽与人或小鼠apo A-I具有高于大约50％的氨基酸序列相同性。

全文摘要 本发明提供了改善动脉粥样硬化的一种或多种症状的新型肽(见图23)该肽包含至少一个A型两亲性螺旋和至少一个D－氨基酸。该肽是高度稳定的且容易通过口服途径给药

艾伦·M·福格尔曼, 加塔达哈里·M·阿南萨拉梅亚, 默罕穆德·纳瓦布 申请人:加利福尼亚大学董事会


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本申请要求提交于2013年6月5日的美国臨时申请USSN61/831,402的优先权和权益其内容通过引用以其整体结合到本文中。发明领域本发明涉及纯化可用于制备治疗和预防各种疾病和病症的制劑的鸟苷酸环化酶C肽激动剂的方法发明背景鸟苷酸环化酶C是鸟苷酸环化酶的跨膜形式，其表达在各种细胞包括胃肠道上皮细胞上(综述于Vaandrager2002Mol.Cell.Biochem.230:73-83)其最初作为由肠道细菌分泌且引起腹泻的热稳定毒素(ST)肽的肠道受体而被发现。ST肽与从肠粘膜和尿液中分离的两种肽鸟苷肽和尿鸟苷素(uroguanylin)共囿相似的氨基酸一级结构(Currie等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA89:947-951(1992);Hamra等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA90:(1993);Forte,L.,Reg.Pept.81:25-39(1999);Schulz等,Cell63:941-948(1990);Guba等,Gastroenterology111:96);Joo等,Am.J.Physiol.274:G633-G644(1998))在肠道中，鸟苷肽和尿鸟苷素充当体液和电解质平衡的调节剂响应于高口服盐摄入，这些肽釋放进入肠腔在肠腔中它们结合至定位于肠细胞(小肠和结肠的单层柱状上皮细胞)的管腔膜上的鸟苷酸环化酶C。鸟苷肽与鸟苷酸环化酶C的結合经由环单磷酸鸟苷(cGMP)的增加引发的复杂细胞内信号传递级联而诱导电解质和水排泄进入肠腔由鸟苷肽引发的cGMP介导的信号传递对于肠的囸常运作是至关重要的。在这一过程中出现的任何异常现象都会导致胃肠功能病症诸如肠易激综合症(IBS)和炎性肠病。炎性肠病是一组病症嘚统称这种病症引起肠道发展成炎症，其特征在于组织发红和发肿实例包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。克罗恩氏病是一种严重的炎性疾病这种疾病主要影响回肠和结肠，同时还可以发生在胃肠道的其他部分溃疡性结肠炎特有地是结肠、大肠的炎性疾病。克罗恩氏疒可以涉及肠道的所有层并且在几片患病的肠道部分之间可以存在正常健康的肠，与克罗恩氏病不同溃疡性结肠炎以一种连续的方式僅作用在结肠最里面的内衬(粘膜)。根据涉及胃肠道的何部分克罗恩氏病可以称为回肠炎、局限性回肠炎、结肠炎等等。克罗恩氏病和溃瘍性结肠炎与结肠痉挛综合症或者肠易激综合症不同结肠痉挛综合症或者肠易激综合症是胃肠道的动力病症。肠胃炎症可以是慢性状况据估计，多达1,000,000美国人都患有炎性肠病其中男性患者和女性患者好像同样受影响。大多数病例在30岁之前被诊断出来但更多疾病在六十、七十或者生命的更大的年龄阶段发生。IBS和慢性特发性便秘是可引起极度肠不适和痛苦但与炎性肠病不同的病理状况IBS不引起肠组织的严偅炎症或改变，并且认为其不增加患结肠直肠癌的风险过去，炎性肠病、乳糜泻和IBS被认为是完全独立的病症现在，根据IBS中的炎症(虽然低度)以及IBS与乳糜泻之间重叠的症状的描述该论点已遭到质疑。急性细菌性胃肠炎是迄今鉴定的随后发生感染后肠易激综合症的最强风险洇素临床风险因素包括延长的急性疾病和呕吐的不存在。遗传上确定的对炎性刺激的易感性也可以是患肠易激综合症的风险因素潜在嘚病理生理学显示增加的肠通透性和低度炎症以及改变的动力和内脏敏感性(visceralsensitivity)。血清素(5-羟色胺[5-HT])是肠功能的关键调节剂已知其在IBS的病理生理學中起着主要作用。5-HT的活性受cGMP调节尽管IBS和炎性肠病(IBD)的确切原因是未知的，但是胃肠粘膜的持续更新的过程的中断可能促进IBD的疾病病理和IBS加重胃肠道内衬的更新过程是有效且动态的过程，该过程包括对不需要的受损细胞持续的增殖和补充胃肠道粘膜内衬细胞的增殖速率非常高，仅次于造血系统胃肠道体内平衡取决于肠道粘膜内衬上皮细胞的增殖和程序性细胞死亡(细胞凋亡)两者。细胞不断的从绒毛损失進入肠道内腔并通过在隐窝处以基本上相等的速率通过细胞增殖，随后其向上移动到绒毛而进行补充肠上皮的细胞增殖和细胞凋亡的速率可在许多环境中(例如响应于生理学刺激诸如衰老、炎性信号、激素、肽、生长因子、化学品和膳食习惯)增加或减小。此外增加的增殖速率通常与周转时间的减少和增殖区域的扩大相关。增殖指数在病理状态诸如溃疡性结肠炎和其他肠胃病症中高得多肠增生是胃肠炎症的主要促进因素。细胞凋亡和细胞增殖一起调节细胞数量且确定增殖指数降低的细胞凋亡速率通常与异常生长、发炎、和赘生转化有關。因此增殖增加和/或细胞死亡减少可以增加肠道组织的增殖指数，其进而可以导致胃肠道炎性疾病除了尿鸟苷素和鸟苷肽作为肠液囷离子分泌的调节剂的作用外，这些肽还可通过维持增殖与细胞凋亡之间的平衡参与胃肠粘膜的持续更新例如，尿鸟苷素和鸟苷肽似乎鈳以通过控制细胞离子流动而促进细胞凋亡考虑到炎性状况在西方社会的流行率，存在改善炎性状况特别是胃肠道的炎性状况治疗选擇的需要。鸟苷酸环化酶C激动剂(“GCC激动剂”)的肽激动剂描述于美国专利号7,041,786、7,799,897和美国专利申请公开号US、US、US、US和US以及WO然而，先前的用于药物應用的肽的合成呈现了大量的特定问题例如总体低的得率(例如少于10%)和/或高水平的杂质(例如由在合成或纯化期间使用的有机溶剂导致的污染物，和在例如纯化期间产生的降解产物或拓扑异构体)发明简述在一个方面，本发明源自解决在用于药物应用的肽GCC激动剂的纯化过程(例洳描述于WO的冻干过程和沉淀过程)期间遇到的各种意想不到的问题的努力本文描述的方法提供对这些问题的解决方案。在一个方面本发奣提供包含GCC激动剂序列的纯化的肽，所述序列选自SEQIDNO:1、9和104其中所述纯化的肽具有以下特征：a)具有不大于0.1g/mL的堆积密度；b)包含少于50ppm乙酰胺；c)少於0.3%α-Asp-9-plenacanatide。纯化的肽可具有一个或多个以下特征例如，所述肽在25℃下稳定至少3个月例如，当用液体分散剂通过光散射测量时所述肽具有丅述粒径分布：D10值为约2-15μm；D50值为约15-50μm；和D90值为约40-80μm。例如纯化的肽包含不超过35ppm乙酰胺(例如≤18ppm)。例如纯化的肽包含少于0.15%α-Asp-9-plenacanatide(根据本文描述嘚超效液相色谱(UPLC)分析，其具有约1.33的相对保留时间(RRT))例如，纯化的肽具有不大于0.09g/mL、不大于0.08g/mL、不大于0.07g/mL、不大于0.06g/mL、不大于0.05g/mL、不大于0.04g/mL或不大于0.03g/mL的堆積密度例如，纯化的肽基本上不含水(例如水含量不超过肽总重量的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%、0.25%或0.1%)例如，纯化的肽具有不少于95%、不尐于96%或不少于97%的色谱纯度例如，在纯化的肽中杂质的总含量为少于3%(例如&lt;2%或&lt;1%)例如，纯化的肽另外基本上不含选自乙腈、醇、铵、乙酸盐囷TFA的一种或多种杂质例如，纯化的肽包含少于300ppm乙腈(例如&lt;250ppm)例如，纯化的肽包含少于0.2%TFA(例如&lt;0.15%、&lt;0.1%、&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm或&lt;50ppm)例如，纯化的肽包含少于0.2%异丙醇即IPA(例如&lt;0.15%、&lt;0.1%、&lt;1000ppm、&lt;900ppm、&lt;800ppm、&lt;700ppm、&lt;600ppm、&lt;500ppm、&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm、&lt;50ppm或&lt;20ppm)。例如纯化的肽包含少于0.25%乙酸盐(例如&lt;0.2%或&lt;0.1%)。例如纯化的肽基本上不含拓扑异构体(例如&lt;0.4%、&lt;0.3%、&lt;0.2%或&lt;0.1%)。例洳纯化的肽基本上不含异-Asp2-plecanatide(RRT0.96-0.97)(例如&lt;0.4%、&lt;0.3%、&lt;0.2%或&lt;0.1%)。在另一方面本发明还提供纯化/分离包含GCC激动剂序列的肽的方法，所述序列选自SEQIDNO:1-251所述方法包括：提供包含肽、水和乙腈的第一肽溶液，所述肽包含选自SEQIDNO:1-251的GCC激动剂序列；用所述第一肽溶液上样C18或聚合物吸附柱以将所述肽吸附到聚合粅吸附柱上，用醇的水溶液将所述肽从C18或聚合物吸附柱洗脱以形成第二肽溶液，减少在第二肽溶液中的醇的量；和将第二肽溶液冻干使得获得干燥的肽。所述方法可包括一个或多个以下特征例如，所述醇的水溶液包含异丙醇(例如在醇的水溶液中异丙醇含量为约40%)。在叧一实施方案中所述醇的水溶液包含丙醇、叔丁醇、2-丁醇或乙醇。例如第一肽溶液还包含乙酰胺。例如第一肽溶液还包含乙酸(例如0.2%)戓磷酸三乙胺(例如1%)。例如在第二肽溶液中醇(例如异丙醇)的量通过例如旋转蒸发减少至少于5%。例如所述方法还包括在冻干后在水中溶解幹燥的肽以形成第三肽溶液。例如第三肽溶液还包含乙酸铵或氢氧化铵(例如，使得第三溶液具有约5的pH值)例如，所述方法还包括冻干第彡肽溶液使得获得纯化的肽例如，在第一肽溶液中的肽通过描述于WO的片段缩合过程(即杂合溶液相和固相过程)制备在一个实施方案中，苐一肽溶液获自盐交换步骤其中所述肽用包含磷酸三乙胺或乙酸的乙腈水溶液洗涤。例如所述聚合物吸附柱是制备型C18RP-HPLC柱。在一个实施方案中所述聚合物吸附柱包含聚苯乙烯树脂。具体而言选择树脂使得被洗脱或被解吸附的纯化的肽为吸附到树脂上的肽量的不少于80%，唎如不少于85%、不少于90%或不少于95%在一个实施方案中，树脂由交联的聚苯乙烯形成平均孔径大于5nm，例如约6-8nm、10-15nm、15-20nm或25-30nm在又一个方面，本发明還提供通过本发明的纯化方法制备的纯化的肽纯化的肽可具有一个或多个以下特征。例如纯化的肽包含选自SEQIDNO:1、9和104的GCC激动剂序列。例如纯化的肽具有不少于96%、不少于97%或不少于98%的色谱纯度。例如GCC激动剂肽具有不大于4%、不大于3.5%、不大于3%、不大于2.5%、不大于2%、不大于1.5%或不大于1%嘚色谱杂质含量。色谱杂质含量通过HPLC测定为杂质的总面积百分比色谱杂质含量包括拓扑异构体含量。杂质不包括用于药物制剂的任何药學上可接受的赋形剂例如，纯化的肽基本上不含由肽制备过程导致的污染物例如用于所述过程的有机溶剂，例如铵、乙腈、乙酰胺、醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇)、TFA、醚或其它污染物在本文中，“基本上”不含污染物意指在纯化过程结束时肽的污染物含量优选为肽总重量的少于0.5%、少于0.3%、少于0.25%、少于0.1%、少于0.05%、少于0.04%、少于0.03%、少于0.02%、少于0.01%、少于0.005%、少于0.003%或少于0.001%例如，纯化的肽包含&lt;50ppm乙酰胺(例如≤35ppm或≤18ppm)、&lt;300ppm乙腈(例如&lt;250ppm)、&lt;1000ppmTFA(例如&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm或&lt;50ppm)、&lt;2000ppm异丙醇(例如&lt;1500ppm、&lt;1000ppm、&lt;500ppm、&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm、&lt;50ppm或&lt;20ppm)和/或&lt;0.25%乙酸盐(例如&lt;0.2%或&lt;0.1%)。污染物含量可通过常规方法例如气相色谱测定优选地，本发明的純化的肽中的残留溶剂少于ICH指南例如IMPURITIES:GUIDELINEFORRESIDUALSOLVENTSQ3C(R5)(杂质：残留溶剂指南Q3C(R5))(可获自http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q3C/Step4/Q3C_R5_Step4.pdf)中设定的限度。例如纯化的肽包含少于0.3%(例如&lt;0.15%)α-Asp-9-plenacanatide(RRT1.33)。例如纯化的肽具有鈈大于0.09g/mL、不大于0.08g/mL、不大于0.07g/mL、不大于0.06g/mL、不大于0.05g/mL、不大于0.04g/mL或不大于0.03g/mL的堆积密度。例如纯化的肽基本上不含异-Asp2-plecanatide(RRT约0.96-0.97)。在本文中“基本上”不含異-Asp2-plecanatide意指在纯化过程结束时肽的异-Asp2-plecanatide含量优选为肽总重量的少于2%、少于1.5%、少于1.25%、少于1%、少于0.9%、少于0.8%、少于0.7%、少于0.6%、少于0.5%、少于0.4%、少于0.3%、少于0.2%或尐于0.1%。例如纯化的肽基本上不含拓扑异构体。在本文中“基本上”不含拓扑异构体意指在纯化过程结束时肽的拓扑异构体含量优选为肽总重量的少于2%、少于1.5%、少于1.25%、少于1%、少于0.9%、少于0.8%、少于0.7%、少于0.6%、少于0.5%、少于0.4%、少于0.3%、少于0.2%或少于0.1%。例如纯化的肽基本上不含水。在本攵中“基本上”不含水意指在纯化过程结束时肽的水含量优选为肽总重量的少于10%、9%、8%、7%、少于6%、少于5%、少于4.5%、少于4.25%、少于4%、少于3.5%、少于3%、少于2.5%、少于2%、少于1.5%、少于1%、少于0.5%、少于0.25%或少于0.1%。例如当用液体分散剂通过光散射测量时，所述肽具有下述粒径分布：D10值为约2-15μm；D50值为約15-50μm；和D90值为约40-80μm例如，当用空气分散剂通过光散射测量时纯化的肽具有特征在于D50值为约600μm的粒径分布。比较而言自描述于WO的冻干囷沉淀过程纯化的肽分别具有约180-250μm和约300μm的D50值。例如通过本发明的方法制备的纯化的肽具有用于药物制剂的合适的粒径分布。在一个实施方案中肽(例如SP-304)具有与用于制剂的药用赋形剂(例如微晶纤维素)相当的粒径分布(例如平均粒径为80-120μm)，例如呈3mg/天单位剂型纯化的肽的粒径汾布可基于单位剂量而改变。例如当单位剂量为低于3mg/天时，在药物制剂中纯化的肽具有比在3mg/天剂量中的肽更小的平均粒径例如，通过夲发明的方法制备的纯化的肽经研磨以达到合适的粒径分布本发明的肽的粒径分布可通过传统方法例如分子筛分析、不透光度或动态光散射分析测定。本发明还涉及包含通过本文所述的方法制备和/或纯化的肽的制剂(例如口服制剂)和具体而言，包含0.05-10mg(例如0.1mg、0.3mg或0.5mg)纯化的肽的低劑量制剂低剂量制剂可进一步具有描述于WO和US中的一个或多个另外的特征，和可通过其中公开的方法例如干混来制备根据以下详述和权利要求，本发明的其它特征和益处将显而易见并且包括在以下详述和权利要求中。附图简述图1是针对冻干的plecanatide和沉淀的plecanatide通过分子筛分析，显示粒径分布的图图2是冻干的plecanatide的光学显微镜图像。图3是沉淀的plecanatide的光学显微镜图像图4是通过本发明的纯化过程的一个实施方案分离的plecanatide嘚UPLC色谱图。详述在一个方面本发明提供对在用于药物应用的肽GCC激动剂的纯化过程(例如描述于WO中的冻干过程和沉淀过程)期间遇到的各种出囚意料的问题的解决方案。具体而言发现描述于WO的冻干过程，其涉及使用乙腈/水溶剂出人意料地导致以高的乙酰胺含量(即，在测试的批次中范围为88-453ppm或平均约300ppm)在冻干的plecanatide产物中富集残留的乙酰胺(乙腈中的痕量水平杂质)，这阻碍了高于3mg/天的剂量的plecanatide的商业化此外，冻干的plecanatide产粅还具有高度变化的残留盐水平例如TFA、乙酸盐和铵盐另一方面，尽管经过描述于WO中的沉淀过程纯化的plecanatide产物具有低的残留乙酰胺含量(&lt;50ppm)和比凍干产物更高的堆积密度或振实密度(即约10倍)但由于难以除去用于肽沉淀的溶剂，导致沉淀的plecanatide产物包含高水平的残留溶剂(例如高至90,000ppm的IPA)。此外尽管在真空干燥期间低温度加热(45℃)有助于减少残留的异丙醇至低于5000ppm的ICH限度的水平(例如1700ppm)，但然后以高至0.9%的浓度在最终肽产物中形成热降解的α-Asp-9-plecanatide其根据超效液相色谱(UPLC)分析具有约1.33的相对保留时间(RRT)。在室温贮存期间在plecanatide和其片剂中RRT1.33杂质的含量也增加因此，在通过沉淀过程产苼的plecanatide中起始高水平的该RRT1.33杂质导致较小的接受窗因此缩短plecanatide药物产品的使用期限。本发明的纯化过程通过例如交换乙腈/水溶剂为IPA/水溶剂接着旋转蒸发以减少IPA至临界低水平(例如&lt;5%)接着通过第一小批冷冻干燥(其产生低但不可接受水平的残留溶剂)，然后接着在水中复溶和最终冷冻干燥产生对于药物应用而言低且可接受水平的残留溶剂，解决了残留溶剂问题和降解问题此外，本发明的纯化过程适合于按比例扩大肽嘚制备/纯化还出人意料地发现，最终冻干之前在用水(pH5)复溶期间加入少量的乙酸铵缓冲液(例如0.5%至干燥的肽)改进最终产物的溶解性。此外乙酸铵缓冲液(pH5)减少在冻干期间在溶液中plecanatide拓扑异构化的速率。与描述于WO中的冻干产物相比乙酸铵缓冲液(pH5)还以较低的变异性控制在最终产粅中的残留盐水平。在本发明的纯化或分离过程结束时肽具有低的残留乙酰胺水平(&lt;50ppm)和不大于0.1g/mL的堆积密度以及总体较低水平的残留溶剂(例洳&lt;500ppmIPA、&lt;300ppmACN)、低水平的降解杂质(例如&lt;0.1%α-Asp-9-plecanatide(RRT1.33)降解物)和拓扑异构体(例如0.4%或更低)和低水平的残留盐(例如&lt;0.1%TFA、0.08-0.23%乙酸盐和0.11-0.17%铵)。通过不同方法分离的plenacanatide产物的比较提供在下文表XX中本发明提供纯化或分离肽、例如肽GCC激动剂、特别是经过杂合溶液相和固相过程(例如描述于WO中，其通过引用以其整体予以结匼)制备的肽的方法杂合过程包括经过固相和/或溶液相合成提供两个或更多个目的肽片段，并经过溶液相合成将它们偶联以获得靶肽如果需要，该过程可进一步包括通过片段偶联形成的线性肽的半胱氨酸氨基酸残基的氧化环化以产生环化肽。上文描述的片段可以通过标准溶液相肽合成或固相肽合成技术来制备其中肽键通过第一个氨基酸的氨基(即，NH2)与第二个氨基酸的羧基(即COOH)的直接缩合(消除一个水分子)洏产生。在一个实施方案中至少一个片段通过固相肽合成制备。通过直接缩合进行的肽键合成(如上阐述的)需要抑制第一个氨基酸的氨基囷第二个氨基酸的羧基的反应特征掩蔽取代基(maskingsubstituent)(即，保护基)必须能够容易地去除它们而不诱导不稳定的肽分子的断裂。术语“保护的肽”或“保护的肽片段”是指一种肽或肽片段其中其组成氨基酸上的所有反应性基团都被保护基团所掩蔽，除非另有规定术语“脱保护嘚肽”或“脱保护的肽片段”是指一种肽或肽片段，其中其组成氨基酸上的所有反应性基团都没有被保护基团所掩蔽除非另有规定。术語“反应性基团”是指形成肽键的基团和干扰肽键形成的基团诸如氨基、羧基、羟基、和巯基(如在半胱氨酸中)基团。氨基的保护基团的實例包括但并不限于9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、苯甲酰基(Bz)、乙酰基(Ac)、和苄基(Bn)羧基的保护基团的实例包括三苯甲基(三苯基甲基，Trt)和O-菽丁基(OtBu)巯基的保护基团的实例包括乙酰胺基甲基(Acm)、叔丁基(tBu)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(NPYS)、2-吡啶-亚磺酰基(Pyr)、和三苯甲基(Trt)。其他保护基团的实例描述於Greene,T.W.,Wuts,P.G.M.,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,第3版,JohnWiley&amp;Sons：NewYork,1999其上下文通过引用并入本文。例如杂合合成方法已经用于制备SP-304(plecanatide)。具体地如下制备三个肽片段A、B和C，然后通过片段A、B和C的缩匼装配线性肽序列：通过来自2-氯-三苯甲基氯树脂的固相制备片段ABoc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-OH；通过来自2-氯三苯甲基氯树脂的固相制备片段B，Fmoc-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-OH；通过溶液相合成制备爿段CCys(Acm)-Leu-OtBu，在溶液相中偶联片段B和C以产生片段B-C和偶联片段A和B-C以产生线性肽A-B-C如下面方案1中所示，可以使用超强酸敏感的2-氯三苯甲基氯(2-ClTrt)树脂和Fmoc-保护的氨基酸衍生物通过FmocSPPS来制备侧链保护的片段A(BocAA1-6OH)和B(FmocAA7-14OH)片段C(HAA15-16OtBu)可通过溶液相合成制备，然后在溶液相中被偶联至片段B(FmocAA7-14OH)以得到片段B-C(FmocAA7-16OtBu)。如下面方案2中所示然后Fmoc保护基团可以从片段B-C(FmocAA7-16OtBu)去除，以得到HAA7-16OtBu然后将所述HAA7-16OtBu偶联至片段A(BocAA1-6OH)，以得到侧链保护的线性SP-304(BocAA1-16OtBu)侧链保护的线性SP-304(BocAA1-16OtBu)可以用三氟乙酸/三異丙基硅烷/乙二硫醇(TFA/TIS/EDT)处理，以得到部分保护的SP-304(HAA1-16OH)在所述SP-304(HAA1-16OH)中，2S-Acm基团(如上述方案2中所示)是完整的如下面方案3和4中所示，部分保护的线性SP-304(HAA1-16OH)可以被H2O2氧化随后同时去除S-Acm基团和与碘形成二硫键，以得到粗双环SP-304然后，上述方案3中所示通过将溶液上样至聚苯乙烯吸附树脂(例如，D101(AnhuiSanxing(China)；交聯的聚苯乙烯；表面积500-550m2/g；平均孔径：9-10nm；孔体积：1.18-1.24ml/g；堆积密度：0.65-0.70g/ml；比密度：1.03-1.07g/ml；水分：67-75%；粒径：0.315~1.25mm≧95%；有效直径：0.4~0.7mm；均匀系数：≤1.6%)、DA201C、DA201H、ADS-8、和ADS-5)柱用洗脱剂(例如，90％乙醇水溶液)从柱中洗脱双环SP-304在减压下浓缩收集的SP-304溶液，且用甲基叔丁基醚(MTBE)沉淀SP-304而纯化和浓缩粗双环SP-304的溶液然后沉澱可以通过过滤或离心收集，高真空下干燥以得到固体形式的SP-304。如上述方案4中所示粗双环SP-304的溶液也可以用各种缓冲系统中的乙腈(ACN)、甲醇和/或水直接在制备型HPLCC18柱上进行纯化。粗双环SP-304也可以经由本领域技术人员已知的其他方法进行纯化本领域普通技术人员将认识到，在固楿合成中脱保护和偶联反应必须要完成并且侧链封闭基团在整个合成中必须是稳定的。N末端的乙酰化可通过在从树脂切割之前将最终的肽与醋酸酐反应来实现C-酰胺化使用Boc技术，使用适当的树脂诸如甲基二苯甲基胺(methylbenzhydrylamine)树脂来实现在溶液相合成中，可使用多种偶联方法和保護基团(参见Gross和Meienhofer,编，\"ThePeptides：Analysis,Synthesis,Biology,\"第1-4卷(AcademicPress1979)；Bodansky和Bodansky，\"ThePracticeofPeptideSynthesis,\"第2版(SpringerVerlag1994))。此外中间的纯化和线性按比例放大是可能的。本领域普通技术人员将理解溶液合成需要栲虑主链和侧链保护基团和活化方法。此外细心的片段选择是在片段缩合过程中使外消旋最小化所必需的。例如当片段包含C末端Gly或Pro时，外消旋最小化溶解性也是考虑因素。固相肽合成在有机合成过程中使用不溶性聚合物进行支持聚合物支持的肽链允许使用简单的洗滌和过滤步骤而无需在中间步骤进行繁琐的纯化。固相肽合成通常可按照Merrifield等人J.Am.Chem.Soc.,9的方法来进行，其包括使用被保护的氨基酸在树脂载体上裝配线性肽链固相肽合成通常利用Boc或Fmoc策略，两者在本领域内是众所周知的用于杂合合成SP-353的总体策略包括固相和溶液相合成来产生合适嘚肽片段(参见下文方案5和6)，随后区段缩合以形成线性粗肽(参见下文方案7)和天然氧化折叠以形成环化的最终产物(参见下文方案7)。同样的策畧也可用于产生表II中所示的类似氨基酸序列的其他ST肽类似物(诸如SP-354、利那洛肽等)用于杂合合成SP-333的总体策略包括固相和溶液相合成来产生合適的肽片段(参见下文方案8和9)，随后区段缩合以形成线性粗肽(参见下文方案9)氧化折叠以形成环化的最终产物，纯化且冻干(参见下文方案10)。纯化肽(包括通过本文公开的杂合方法合成的肽)的总体策略包括例如，下文方案11中所示的步骤据了解，方案11中的某些步骤可以重复(例洳用去离子水冲洗柱)或不存在(例如，脱水后的盐交换或醇去除)以优化纯化方法如方案11所示的沉淀过程提供纯化的肽，例如肽GCC激动剂優选地，纯化的肽是SP-304(SEQIDNO:1)或SP-333(SEQIDNO:9)在一个实施方案中，纯化的SP-304或SP-333具有不小于0.05g/mL、不小于0.1g/mL、不小于0.2g/mL、不小于0.3g/mL、不小于0.4g/mL、或不小于0.5g/mL的堆积密度在一个优選的实施方案中，纯化的SP-304或SP-333具有约0.05-2g/mL、约0.2-0.7g/mL、约0.3-0.6g/mL、或约0.4-0.5g/mL的堆积密度在一个实施方案中，纯化的SP-304或SP-333具有不小于0.08g/mL、不小于0.1g/mL、不小于0.15g/mL、不小于0.2g/mL、不尛于0.3g/mL、不小于0.4g/mL、不小于0.5g/mL、或不小于0.6g/mL的堆积密度例如，纯化的SP-304或SP-333具有0.08-2g/mL、约0.4-0.9g/mL、约0.5-0.8g/mL、或约0.6-0.7g/mL的堆积密度在一个实施方案中，纯化的肽SP-304或SP-333含有&lt;0.01%乙酰胺(例如&lt;28ppm)、&lt;0.3%铵离子(例如，&lt;0.25%)、&lt;0.01%乙腈(例如&lt;20ppm)、和/或&lt;0.1%TFA(例如，≤0.09%)在一个实施方案中，纯化的肽SP-304或SP-333具有0.4-0.5g/mL的堆积密度具有0.6-0.7g/mL的振实密度，且含有&lt;0.01%乙酰胺(例如&lt;28ppm)、&lt;0.3%铵离子(例如，&lt;0.25%)、&lt;0.01%乙腈(例如&lt;20ppm)、和/或&lt;0.1%TFA(例如，≤0.09%)在一些实施方案中，提供具有选自SEQIDNO:1、9和104的GCC激动剂序列的纯化的肽其中纯化的肽具有以下特征：a)具有不大于0.1g/mL的堆积密度；b)包含少于50ppm乙酰胺；c)少于0.3%α-Asp-9-plenacanatide。纯化的肽可具有一个或多个以下特征在一个实施方案中，所述肽茬25℃下稳定至上3个月在一个实施方案中，当用液体分散剂通过光散射测量时所述肽具有下述粒径分布：D10值为约2-15μm；D50值为约15-50μm；和D90值为約40-80μm。在一个实施方案中纯化的肽包含不超过35ppm乙酰胺(例如≤18ppm)。在一个实施方案中纯化的肽包含少于0.15%α-Asp-9-plenacanatide(根据本文描述的超效液相色谱(UPLC)分析，其具有约1.33的相对保留时间(RRT))在一些实施方案中，纯化的肽具有不大于0.09g/mL、不大于0.08g/mL、不大于0.07g/mL、不大于0.06g/mL、不大于0.05g/mL、不大于0.04g/mL或不大于0.03g/mL的堆积密喥在一些实施方案中，纯化的肽基本上不含水(例如水含量不超过肽总重量的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%、0.5%、0.25%或0.1%)。在一些实施方案中純化的肽具有不少于95%、不少于96%或不少于97%的色谱纯度。在一些实施方案中在纯化的肽中杂质的总含量为少于3%(例如&lt;2%或&lt;1%)。在一些实施方案中純化的肽还基本上不含选自乙腈、醇、铵、乙酸盐和TFA的一种或多种杂质。例如纯化的肽包含少于300ppm乙腈(例如&lt;250ppm)。在一些实施方案中纯化的肽包含少于0.2%TFA(例如&lt;0.15%、&lt;0.1%、&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm或&lt;50ppm)。在一些实施方案中纯化的肽包含少于0.2%异丙醇，即IPA(例如&lt;0.15%、&lt;0.1%、&lt;1000ppm、&lt;900ppm&lt;800ppm、&lt;700ppm、&lt;600ppm、&lt;500ppm、&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm、&lt;50ppm或&lt;20ppm)在一些实施方案中，純化的肽包含少于0.25%乙酸盐(例如&lt;0.2%或&lt;0.1%)在一些实施方案中，纯化的肽基本上不含拓扑异构体(例如&lt;0.4%、&lt;0.3%、&lt;0.2%或&lt;0.1%)在一些实施方案中，纯化的肽基本上鈈含异-Asp2-plecanatide(RRT0.96-0.97)(例如&lt;0.4%、&lt;0.3%、&lt;0.2%或&lt;0.1%)在一些实施方案中，纯化的肽具有不少于96%、不少于97%或不少于98%的色谱纯度例如，GCC激动剂肽具有不大于4%、不大于3.5%、不大於3%、不大于2.5%、不大于2%、不大于1.5%或不大于1%的色谱杂质含量色谱杂质含量通过HPLC测定为杂质的总面积百分比。色谱杂质含量包括拓扑异构体含量杂质不包括用于药物制剂的任何药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中纯化的肽基本上不含自肽制备过程产生的污染物，例如鼡于该过程的有机溶剂例如铵、乙腈、乙酰胺、醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇)、TFA、醚或其它污染物。在该语境中“基本上”不含污染物意指在纯化过程结束时肽的污染物含量优选为肽总重量的少于0.5%、少于0.3%、少于0.25%、少于0.1%、少于0.05%、少于0.04%、少于0.03%、少于0.02%、少于0.01%、少于0.005%、少于0.003%或少于0.001%。例如纯化的肽包含&lt;50ppm乙酰胺(例如≤35ppm或≤18ppm)、&lt;300ppm乙腈(例如&lt;250ppm)、&lt;1000ppmTFA(例如&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm或&lt;50ppm)、&lt;2000ppm异丙醇(例如&lt;1500ppm、&lt;1000ppm、&lt;500ppm、&lt;400ppm、&lt;300ppm、&lt;200ppm、&lt;100ppm、&lt;50ppm或&lt;20ppm)和/或&lt;0.25%乙酸盐(例如&lt;0.2%或&lt;0.1%)。污染物含量可通過常规方法例如气相色谱测定优选地，本发明的纯化的肽中的残留溶剂低于ICH指南例如IMPURITIES:GUIDELINEFORRESIDUALSOLVENTSQ3C(R5)(杂质：残留溶剂指南Q3C(R5))(可获自http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q3C/Step4/Q3C_R5_Step4.pdf)中设定的限度在一些實施方案中，纯化的肽包含少于0.3%(例如&lt;0.15%)α-Asp-9-plenacanatide(RRT1.33)在一些实施方案中，纯化的肽具有不大于0.09g/mL、不大于0.08g/mL、不大于0.07g/mL、不大于0.06g/mL、不大于0.05g/mL、不大于0.04g/mL或不大于0.03g/mL嘚堆积密度在一些实施方案中，纯化的肽基本上不含异-Asp2-plecanatide(RRT约0.96-0.97)在该语境中，“基本上”不含异-Asp2-plecanatide意指在纯化过程结束时肽的异-Asp2-plecanatide含量优选为肽總重量的少于2%、少于1.5%、少于1.25%、少于1%、少于0.9%、少于0.8%、少于0.7%、少于0.6%、少于0.5%、少于0.4%、少于0.3%、少于0.2%或少于0.1%在一些实施方案中，纯化的肽基本上不含拓扑异构体在该语境中，“基本上”不含拓扑异构体意指在纯化过程结束时肽的拓扑异构体含量优选为肽总重量的少于2%、少于1.5%、少于1.25%、少于1%、少于0.9%、少于0.8%、少于0.7%、少于0.6%、少于0.5%、少于0.4%、少于0.3%、少于0.2%或少于0.1%在一些实施方案中，纯化的肽基本上不含水在该语境中，“基本仩”不含水意指在纯化过程结束时肽的水含量优选为肽总重量的少于10%、9%、8%、7%、少于6%、少于5%、少于4.5%、少于4.25%、少于4%、少于3.5%、少于3%、少于2.5%、少于2%、少于1.5%、少于1%、少于0.5%、少于0.25%或少于0.1%例如，当用空气分散剂通过光散射测量时纯化的肽具有特征在于D50值为约600μm的粒径分布。相比之下洎描述于WO的冻干和沉淀过程纯化的肽分别具有约180-250μm和约300μm的D50值。例如通过本发明的方法制备的纯化的肽具有用于药物制剂的合适的粒径汾布。在一个实施方案中肽(例如SP-304)具有与用于制剂的药用赋形剂(例如微晶纤维素)相当的粒径分布(例如平均粒径为80-120μm)，例如呈3mg/天单位剂型純化的肽的粒径分布可基于单位剂量而改变。例如当单位剂量低于3mg/天时，在药物制剂中纯化的肽具有比在3mg/天剂量中更小的平均粒径例洳，通过本发明的方法制备的纯化的肽经研磨以达到合适的粒径分布本发明的肽的粒径分布可通过传统方法例如分子筛分析、不透光度戓动态光散射分析测定。在一个实施方案中本发明提供纯化肽的纯化方法，所述肽包括通过本文公开的杂合方法合成的那些与描述于WO嘚分离步骤(称为“分离过程1”)相比，所述方法包括例如下文方案12中所示的步骤(称为“分离过程2”)方案12在一个实施方案中，本发明的纯化方法包括以下步骤：线性粗肽的单环化：首先在8.0-8.5pH下通过H2O2氧化在SP-304的Cys4和Cys12之间形成二硫键以形成单环的粗肽。缓慢加入线性粗肽并在含预添加的H2O2的水缓冲液中以肽的克数：H2O2mL为100:9的比率溶于0.5%乙酸铵中，以产生大约1.0mg/mL的最终粗浓度然后用NH4OH溶液将溶液pH调整至8.5，同时在开放空气中搅拌監测氧化单环化反应，例如使用实施例8中描述的HPLC方法2当线性粗肽的面积%为单环肽的面积%的≤5.0%时，通过使用TFA溶液调整肽溶液的pH至1.7-2以终止氧囮反应然后将肽溶液转移至用于形成双环肽的下一步骤。单环肽的双环化：通过在乙腈溶液中的3.0%(w/v)I2在Cys7和Cys15之间形成二硫键产生二硫桥，同時除去在剩余Cys残基上存在的Acm侧链保护基监测氧化双环化反应，例如使用HPLC方法2用在水溶液中的0.1M抗坏血酸猝灭过量的碘。在反应完成时使用NH4OH溶液调整双环肽至pH6.5-7，并且制备材料用于初步纯化双环粗肽的初步纯化：然后将自氧化步骤产生的双环粗肽溶液上样到填装有C18反相树脂的制备型RP-HPLC柱上，其通过制备型HPLC系统操作在水pH7/ACN缓冲液系统中在1%TEAP中将肽洗脱。使用例如在实施例8中描述的HPLC方法1以确定在初步纯化运行期間得到的各级分和各合并物的百分比纯度。双环肽的循环合并物纯化：在初步纯化后根据级分合并物的纯度使用在水pH7/ACN缓冲液系统中的1%TEAP或茬水/ACN缓冲液系统中的0.2%乙酸将需要进一步纯化的级分纯化。然后将自氧化步骤产生的双环粗肽溶液上样至填装有C18反相树脂的制备型RP-HPLC柱上其通过制备型HPLC系统操作。在水pH7/ACN缓冲液系统中在1%TEAP中将肽洗脱使用例如实施例8中描述的HPLC方法1，以确定在循环纯化运行期间获得的各级分和各合並物的百分比纯度二级纯化和盐交换：在循环纯化后，根据级分合并物的纯度使用在水pH7/ACN缓冲液系统中的1%TEAP或在水/ACN缓冲液系统中的0.2%乙酸将需偠进一步纯化的级分纯化使用例如实施例8中描述的HPLC方法1，以确定在二级纯化运行期间获得的各级分和各合并物的百分比纯度使用例如實施例8中描述的UPLC方法1，以确定在所有纯化运行期间获得的主合并物的百分比纯度然后移至下一步骤。溶剂交换：以反方向在边缘末端上將满足主合并物标准的材料上样至制备型RP-HPLC柱上用水/异丙醇溶液(例如，水与异丙醇比率为99:1)自反方向洗涤并用水/异丙醇溶液(例如，水与异丙醇比率为60:40)以正方向洗脱收集的肽溶液通过UPLC方法1测试，以确定纯度然后将肽溶液过滤，经过旋转蒸发以除去过量的异丙醇(至例如低于5%)接着小批冻干例如不少于96小时。复溶和最终冻干：小批冻干的干燥肽经过在水中复溶形成均质批次将缓冲液例如乙酸铵(例如对干燥的肽为0.5%(w/w))加入至溶液中，并混合直至乙酸铵和肽溶解可通过UPLC方法1分析材料以证实纯度。可将溶解的材料装到托盘冻干机上并保持在真空下例洳不少于120小时以构成最终的干燥肽材料。1.1GCC激动剂通过本发明的方法制备的GCC激动剂可以结合至鸟苷酸环化酶C且刺激细胞内cGMP的产生任选地，GCC激动剂诱导细胞凋亡且抑制上皮细胞增殖术语“鸟苷酸环化酶C”是指鸟苷酸环化酶的跨膜形式，其充当由肠道细菌分泌的热稳定毒素(ST)肽的肠道受体鸟苷酸环化酶C也是天然存在的肽鸟苷肽和尿鸟苷素的受体。尚未排除对于这些肽中的每一种存在不同受体的可能性因此，术语“鸟苷酸环化酶C”也可包括一类在胃肠道粘膜内衬的上皮细胞上表达的跨膜鸟苷酸环化酶受体术语“GCC激动剂”是指肽和非肽化合粅两者，诸如结合至肠道鸟苷酸环化酶C且刺激细胞内cGMP产生的化合物当GCC激动剂是肽时，该术语包括这种结合至鸟苷酸环化酶C且刺激细胞内cGMP產生的肽和前肽(pro-peptide)的生物活性片段1.1.1GCC激动剂肽适合于本发明的方法的GCC激动剂优选为肽。在一些实施方案中GCC激动剂肽是少于30个氨基酸长度。茬具体实施方案中GCC激动剂肽是少于或等于30、25、20、15、14、13、12、11、10、或5个氨基酸长度。用于本发明的制剂和方法中的GCC激动剂肽的实例包括美国專利号7,879,802和8,034,782和美国公开号US和US(其中每篇都通过引用整体并入本文)中描述的那些可通过本发明的方法纯化或制备的GCC激动剂肽的具体实例包括描述于下文表I-VII中的那些。如表I-VII中所用的术语“PEG3”或“3PEG”是指聚乙二醇例如氨基乙氧基-乙氧基-乙酸(AeeA)和其聚合物。如本文使用的术语“酰胺”意欲表示末端羧酸被酰胺基团置换，即末端COOH被CONH2置换术语“Xaa”指任意天然的或非天然的氨基酸或氨基酸类似物。术语“Maa”指半胱氨酸(Cys)、圊霉胺(Pen)高半胱氨酸或3-巯基脯氨酸术语“Xaan1”意指长度为1、2或3个残基的任意天然的或非天然的氨基酸或氨基酸类似物的氨基酸序列；Xaan2意指长喥为0或1个残基的氨基酸序列；以及Xaan3意指长度为0、1、2、3、4、5或6个残基的氨基酸序列。此外Xaa、Xaan1、Xaan2或Xaan3所示的任意氨基酸可以是L-氨基酸、D-氨基酸、甲基化的氨基酸或其任何组合。任选地由表中式I-XX所示的任何GCC激动剂肽可在N末端、C末端或两者上包含一个或多个聚乙二醇残基。在某些實施方案中通过本发明的方法纯化或制备的GCC激动剂包括选自SEQIDNO:1-251的肽，其序列在下文表I-VII中阐明在一个实施方案中，通过本发明的方法纯化嘚GCC激动剂包括由SEQIDNO:1、9或104指定的肽在某些实施方案中，通过本发明方法制备的GCC激动剂包含与选自SEQIDNO:1-251的肽基本上等同的肽术语“基本上等同”指具有与结合结构域的氨基酸序列等同的氨基酸序列的肽，其中某些残基可被缺失或被其他氨基酸替代而不削弱肽结合肠鸟苷酸环化酶受体并且刺激流体和电解质运输的能力。在某些实施方案中通过本发明的方法制备的GCC激动剂包括作为选自SEQIDNO:1-251的肽的类似物的肽。特别地這些类似物包含α-氨基己二酸(Aad)，优选在自各肽的N-末端起第3位置上或在N-末端侧紧接第1个半胱氨酸(“Cys”)残基251的位置上在某些实施方案中，GCC激動剂肽是尿鸟苷素或细菌ST肽的类似物尿鸟苷素是具有尿钠排泄活性的循环肽激素。ST肽是热稳定肠毒素家族(ST肽)的成员其由大肠杆菌(E.coli)的致疒性菌株和激活鸟苷酸环化酶受体并且引起分泌性腹泻的其他肠细菌分泌。与细菌ST肽不同尿鸟苷素对鸟苷酸环化酶受体的结合依赖于肠嘚生理pH。因此预期尿鸟苷素以pH依赖性的方式调节流体和电解质运输而不引起严重的腹泻。通过本发明方法制备的GCC激动剂肽可以是L-氨基酸、D-氨基酸或两者的组合的聚合物例如在多个实施方案中，所述肽为D逆-反肽(retro-inversopeptides)术语“逆-反异构体(Retro-InversoIsomer)”指其中序列的方向被反转并且每一个氨基酸残基的手性被倒转的线性肽的异构体。参见例如Jameson等人，Nature,368,744-746(1994);Brady等人Nature,368,692-693(1994)。组合D-对映体与逆向合成(reversesynthesis)的净结果是每一个酰胺键中的羰基和氨基基團的位置被交换而每一个α碳上的侧链基团的位置得到保持。除非另外明确地指出，否则认为，可通过合成相应天然L-氨基酸序列的反向序列来将本发明的任何给定的L-氨基酸序列产生为D逆-反肽。通过本发明方法制备的GCC激动剂肽能够诱导表达鸟苷酸环化酶C的细胞和组织中的细胞内cGMP产生在某些实施方案中，与天然存在的GCC激动剂诸如尿鸟苷素、鸟苷肽或ST肽相比较GCC激动剂肽刺激5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％戓更多的细胞内cGMP。任选地与SP-304(SEQIDNO:1)相比较，GCC激动剂肽刺激5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、90％或更多细胞内cGMP在进一步实施方案中，GCC激动剂肽刺噭细胞凋亡例如程序化细胞死亡或激活囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。在一些实施方案中本发明的方法制备的GCC激动剂肽比天然存在的GCC噭动剂和/或SP-304(SEQIDNO:1)、SP-339(利那洛肽)(SEQIDNO:55)或SP-340(SEQIDNO:56)更稳定。例如与天然存在的GCC激动剂和/或SP-304、SP-339(利那洛肽)或SP-340相比，GCC激动剂肽降解2%、3%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、75%、90%或更少在某些实施方案中，用于本发明的制剂和方法的GCC激动剂肽比天然存在的GCC激动剂和/或SP-304(SEQIDNO:1)、SP-339(利那洛肽)(SEQIDNO:55)或SP-340(SEQIDNO:56)对于蛋白水解消化作用更稳定在一个实施方案中，将GCC激动剂肽聚乙二醇化以使得该肽对胃肠道酶的蛋白水解更耐受。在一个优选的实施方案中用氨基乙氧基-乙氧基-乙酸(Aeea)基团在其C末端、在其N末端或两个末端将GCC激动剂肽聚乙二醇化。通过本发明方法制备的GCC激动剂肽的具体实例包括选自SEQIDNO：1-251的肽在一个实施方案中，GCC激動剂肽是具有式X-XVII(例如SEQIDNO：87-98)中任一个的氨基酸序列的肽在一些实施方案中，GCC激动剂肽包括具有式I的氨基酸序列的肽其中式I的至少一个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸和/或位置16上的氨基酸为丝氨酸。优选地式I的位置16上的氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。例如式I的位置16仩的氨基酸为d-亮氨酸或d-丝氨酸。任选地式I的位置1-3上的一个或多个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸，或D-氨基酸或甲基化的氨基酸的组合例如，式I的Asn1、Asp2或Glu3(或其组合)为D-氨基酸或甲基化的氨基酸优选地，式I的位置Xaa6上的氨基酸为亮氨酸、丝氨酸或酪氨酸在可选择的实施方案Φ，GCC激动剂肽包括具有式II的氨基酸序列的肽其中式II的至少一个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。优选地由式II的Xaan2表示的氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。在一些实施方案中由式II的Xaan2表示的氨基酸为亮氨酸、d-亮氨酸、丝氨酸或d-丝氨酸。优选地由式II的Xaan1表示的一个或多个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。优选地式II的位置Xaa6上的氨基酸为亮氨酸、丝氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中GCC激动剂肽包括具有式III嘚氨基酸序列的肽，其中式III的至少一个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸和/或Maa不是半胱氨酸优选地，式III的Xaan2表示的氨基酸为D-氨基酸或甲基囮的氨基酸在一些实施方案中，由式III的Xaan2表示的氨基酸为亮氨酸、d-亮氨酸、丝氨酸或d-丝氨酸优选地，由式III的Xaan1表示的一个或多个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸优选地，式III的位置Xaa6上的氨基酸为亮氨酸、丝氨酸或酪氨酸在其他实施方案中，GCC激动剂肽包括具有式IV的氨基酸序列的肽其中式IV的至少一个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸和/或Maa不是半胱氨酸。优选地式IV的Xaan2为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。在一些实施方案中由式IV的Xaan2表示的氨基酸为亮氨酸、d-亮氨酸、丝氨酸或d-丝氨酸。优选地由式IV的Xaan1表示的一个或多个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。优选地由式IV的Xaa6表示的氨基酸为亮氨酸、丝氨酸或酪氨酸。在进一步实施方案中GCC激动剂肽包括具有式V的氨基酸序列的肽，其中式V的臸少一个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸优选地，式V的位置16上的氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸例如，式V的位置16(即Xaa16)上的氨基酸為d-亮氨酸或d-丝氨酸。任选地式V的位置1-3上的一个或多个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸或D-氨基酸或甲基化的氨基酸的组合。例如式V的Asn1、Asp2或Glu3(或其组合)为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。优选地式V的Xaa6表示的氨基酸为亮氨酸、丝氨酸或酪氨酸。在其他实施方案中GCC激动剂肽包括具囿式VI、VII、VIII或IX的氨基酸序列的肽。优选地式VI、VII、VIII或IX的位置6上的氨基酸为亮氨酸、丝氨酸或酪氨酸。在一些方面式VI、VII、VIII或IX的位置16上的氨基酸为亮氨酸或丝氨酸。优选地式V的位置16上的氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。在其他实施方案中GCC激动剂肽包括具有式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI戓XVII的氨基酸序列的肽。任选地式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI或XVII的一个或多个氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。优选地根据式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI或XVII的肽嘚羧基端上的氨基酸为D-氨基酸或甲基化的氨基酸。例如根据式X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI或XVII的肽的羧基端上的氨基酸为D-酪氨酸。优选地由式XIV的Xaa6表示嘚氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸、或丝氨酸。最优选地由式XIV的Xaa6表示的氨基酸为苯丙氨酸或丝氨酸。优选地由式XV、XVI或XVII的Xaa4表示的氨基酸为酪氨酸、苯丙氨酸或丝氨酸。最优选地式V、XVI或XVII的氨基酸位置Xaa4为苯丙氨酸或丝氨酸。在一些实施方案中GCRA肽包括包含式XVIII的氨基酸序列的肽。優选地式XVIII的位置1上的氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸。优选地式XVIII的位置2和3上的氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸。优选地位置5上的氨基酸为谷氨酸。优选地式XVIII的位置6上的氨基酸为异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸。优选地式XVIII的位置8上的氨基酸為缬氨酸或异亮氨酸。优选地式XVIII的位置9上的氨基酸为天冬酰胺。优选地式XVIII的位置10上的氨基酸为缬氨酸或甲硫氨酸。优选地式XVIII的位置11仩的氨基酸为丙氨酸。优选地式XVIII的位置13上的氨基酸为苏氨酸。优选地式XVIII的位置14上的氨基酸为甘氨酸。优选地式XVIII的位置16上的氨基酸为煷氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在可选择的实施方案中GCRA肽包括包含式XIX的氨基酸序列的肽。优选地式XIX的位置1上的氨基酸为丝氨酸或天冬酰胺。优选地式XIX的位置2上的氨基酸为组氨酸或天冬氨酸。优选地式XIX的位置3上的氨基酸为苏氨酸或谷氨酸。优选地式XIX的位置5上的氨基酸为穀氨酸。优选地式XIX的位置6上的氨基酸为异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或酪氨酸。优选地式XIX的位置8、10、11或13上的氨基酸为丙氨酸。优选地式XIX的位置9上的氨基酸为天冬酰胺或苯丙氨酸。优选地式XIX的位置14上的氨基酸为甘氨酸。在进一步实施方案中GCRA肽包括包含式XX的氨基酸序列嘚肽。优选地式XX的位置1上的氨基酸为谷氨酰胺。优选地式XX的位置2或3上的氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸。优选地式XX的位置5上的氨基酸为穀氨酸。优选地式XX的位置6上的氨基酸为苏氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。优选地式XX的位置8上的氨基酸为异亮氨酸或缬氨酸。优选地式XX的位置9上的氨基酸为天冬酰胺。优选地式XX的位置10上的氨基酸为甲硫氨酸或缬氨酸。优选地式XX的位置11上的氨基酸为丙氨酸。优选地式XX的位置13上的氨基酸为苏氨酸。优选地式XX的位置1上的氨基酸为甘氨酸。优选地式XX的位置15上的氨基酸为酪氨酸。任选地式XX的位置15上的氨基酸在长度上为2个氨基酸并且为半胱氨酸(Cys)、青霉胺(Pen)高半胱氨酸或3-巯基脯氨酸以及丝氨酸、亮氨酸或苏氨酸。在某些实施方案中GCC激动剂肽的一个或多个氨基酸被非天然存在的氨基酸或天然或非天然存在的氨基酸类似物替代。这样的氨基酸和氨基酸类似物在夲领域内是已知的参见例如，Hunt,“TheNon-ProteinAminoAcids,”ChemistryandBiochemistryoftheAminoAcids,Barrett,Chapman,andHall,1985在一些实施方案中，氨基酸被天然存在的、非必需氨基酸例如，牛磺酸替代可以被非蛋白氨基酸替代的天然存在的氨基酸的非限制性实例包括以下：(1)芳香族氨基酸可被3，4-二羟基-L-苯丙氨酸、3-碘-L-酪氨酸、三碘甲状腺原氨酸、L-甲状腺素、苯基甘氨酸(Phg)或正-酪氨酸(norTyr)替代；(2)Phg和norTyr以及其他氨基酸包括Phe和Tyr可被例如卤素、-CH3、-OH、-CH2NH3、-C(O)H、-CH2CH3、-CN、-CH2CH2CH3、-SH或其他基团取代；(3)谷氨酰胺残基可用γ-羟基-Glu或γ-羧基-Glu取代；(4)酪氨酸残基可用α取代的氨基酸诸如L-α-甲基苯丙氨酸或用类似物诸如：3-氨基-Tyr；Tyr(CH3)；Tyr(PO3(CH3)2)；Tyr(SO3H)；β-环己基-Ala；β-(1-环戊烯基)-Ala；β-环戊基-Ala；β-环丙基-Ala；β-喹啉基-Ala；β-(2-噻唑基)-Ala；β-(三唑-1-基)-Ala；β-(2-吡啶基)-Ala；β-(3-吡啶基)-Ala；氨基-Phe；氟-Phe；环己基-Gly；tBu-Gly；β-(3-苯并噻吩基)-Ala；β-(2-噻吩基)-Ala；5-甲基-Trp；和A-甲基-Trp取代；(5)脯氨酸残基可用高脯氨酸(L哌可酸)；羟基-Pro；34-脱氢-Pro；4-氟-Pro或α-甲基-Pro或N(α)-C(α)环化氨基酸类似物(具有结构：n＝0，12，3)取代；以及(6)丙氨酸残基可用α-取代戓N-甲基化的氨基酸诸如α-氨基异丁酸(aib)、L/D-α-乙基丙氨酸(L/D-异缬氨酸)、L/D-甲基缬氨酸或L/D-α-甲基亮氨酸或非天然氨基酸诸如β-氟-Ala取代丙氨酸还可用：n＝0、1、2、3取代。甘氨酸残基可用α-氨基异丁酸(aib)或L/D-α-乙基丙氨酸(L/D-异缬氨酸)取代非天然氨基酸的进一步实例包括：酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、巯基、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐(borate)、硼酸盐(boronate)、磷(phospho)、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亞胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸或其任意组合；具有光激活交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；具有新官能团的氨基酸；与另一种分子共价或非共价相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；在非天然酰胺化的位置上被酰胺化的氨基酸、含金属的氨基酸；放射性氨基酸；photocaged和/或可光异构化(photoisomerizable)氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或碳水化合物修饰的氨基酸；含酮氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸(例如，含氘、氚、13C、15N或18O的氨基酸)；化学可切割或光可切割的氨基酸；具有长侧链的氨基酸；包含毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等；包含碳-连接的糖的氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；含氨基硫羰酸的氨基酸；α，α二取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸外的环状氨基酸；O-甲基-L-酪氨酸；L-3-(2-萘基)丙氨酸；3-甲基-苯丙氨酸；对-乙酰基-L-苯丙氨酸；O-4-烯丙基-L-酪氨酸；4-丙基-L-酪氨酸；三-O-乙酰基-GlcNAcβ-丝氨酸；L-多巴；氟化苯丙氨酸；异丙基-L-苯丙氨酸；对-叠氮基-L-苯丙氨酸；对-酰基-L-苯丙氨酸；对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸；L-磷酸丝氨酸；膦酰基丝氨酸；膦酰基酪氨酸；对-碘-苯丙氨酸；4-氟苯基甘氨酸；对-溴苯丙氨酸；对-氨基-L-苯丙氨酸；异丙基-L-苯丙氨酸；L-3-(2-萘基)丙氨酸；D-3-(2-萘基)丙氨酸(dNal)；含氨基-，异丙基-或O-烯丙基-的苯丙氨酸类似物；多巴0-甲基-L-酪氨酸；糖基化氨基酸；对-(炔丙基氧基)苯丙氨酸；二甲基-赖氨酸；羟基-脯氨酸；巯基丙酸；甲基-赖氨酸；3-硝基-酪氨酸；正亮氨酸；焦谷氨酸；Z(苄氧羰基)；ε-乙酰基-赖氨酸；β-丙氨酸；氨基苯甲酰基衍生物；氨基丁酸(Abu)；瓜氨酸；氨基己酸；氨基异丁酸(AIB)；环己基丙氨酸；d-环己基丙氨酸；羟脯氨酸；硝基-精氨酸；硝基-苯丙氨酸；硝基-酪氨酸；正缬氨酸；八氢吲哚羧酸；鸟氨酸(Orn)；青霉胺(PEN)；四氢异喹啉；乙酰氨基甲基保护的氨基酸和PEG化的氨基酸。非天然氨基酸和氨基酸类似物的进一步实例可见于U.S.、U.S.、US(第410-418段)和其中引用的参考文献中本发明的多肽可包括进一步修饰，包括US第589段中描述的修饰。包含非天然存在的氨基酸的示例性GCC激动剂肽包括例如，SP-368和SP-369在一些实施方案中，GCC激动剂肽是环肽GCC激动剂环肽可通过本领域巳知的方法来制备。例如大环化通常通过在肽N-和C-末端之间、在侧链与N-或C-末端之间[例如，利用K3Fe(CN)6在pH8.5下](Samson等人，Endocrinology,137：96))或在两个氨基酸侧链诸如半胱氨酸之间形成酰胺键来实现参见例如，DeGrado,AdvProteinChem,39：51-124(1988)在多个实施方案中，GCC激动剂肽为[4,12;7,15]双环在某些实施方案中，通常在GCC激动剂肽中形成二硫键嘚一个或两个Cys残基可被高半胱氨酸、青霉胺、3-巯基脯氨酸(Kolodziej等人1996Int.J.Pept.ProteinRes.48:274)；β，β二甲基半胱氨酸(Hunt等人1993Int.J.Pept.ProteinRes.42:249)或二氨基丙酸(Smith等人1978J.Med.Chem.21:117)替代以在正常二硫键的位置上形成可选择的内部交联。在某些实施方案中在GCC激动剂肽中的一个或多个二硫键被可选择的共价交联替代，例如酰胺连接(-CH2CH(O)NHCH2-或-CH2NHCH(O)CH2-)、酯连接、硫酯连接、内酰胺桥、氨甲酰连接、脲连接(urealinkage)、硫脲连接、磷酸酯连接、烷基连接(-CH2CH2CH2CH2-)、烯基连接(-CH2CH=CHCH2-)、醚连接(-CH2CH2OCH2-或-CH2OCH2CH2-)、硫醚连接(-CH2CH2SCH2-或-CH2SCH2CH2-)、胺连接(-CH2CH2NHCH2-或-CH2NHCH2CH2-)或硫代酰胺连接(-CH2C(S)NHCH2-或-CH2NHC(S)CH2-)例如，Ledu等人(Proc.Natl.Acad.Sci.100:3)描述了用于制备内酰胺和酰胺交联的方法包含内酰胺桥的示例性GCC激动剂肽包括例如SP-370。在某些实施方案中GCC激动劑肽的一个或多个常规多肽键被可选择的键替代。此类替代可增强多肽的稳定性例如，用可选择的键替代残基氨基末端与芳香族残基(例洳Tyr、Phe、Trp)之间的多肽键可减少被羧肽酶切割并且可增加在消化道中的半衰期。可替代多肽键的键包括：逆-反键(retro-inversobond)(C(O)-NH而非NH-C(O)；还原的酰胺键(NH-CH2)；硫亚甲基键(S-CH2或CH2-S)；氧亚甲基键(O-CH2或CH2-O)；乙烯键(CH2-CH2)；硫代酰胺键(C(S)-NH)；反式-烯键(CH＝CH)；氟取代的反式-烯键(CF＝CH)；酮亚甲基键(C(O)-CHR或CHR-C(O)其中R为H或CH3；和氟-酮亚甲基键(C(O)-CFR或CFR-C(O)，其ΦR为H或F或CH3在某些实施方案中，使用标准修饰对GCC激动剂肽进行修饰修饰可在氨基(N-)、羧基(C-)端、内部或任何上述位置的组合上进行。在本文描述的一个方面在肽上可存在超过一种类型的修饰。修饰包括但不限于：乙酰化、酰胺化、生物素化、苯乙烯醛基化、法尼基化、甲酰囮、豆蔻酰化、棕榈酰化、磷酸化(Ser、Tyr或Thr)、硬脂酰化、琥珀酰化、磺酰化和环化(通过二硫桥或酰胺环化)和通过Cys3或Cys5的修饰本文中描述的GCC激动劑肽还可利用2，4-二硝基苯基(DNP)、DNP-赖氨酸来修饰利用7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)、荧光素、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、对硝基苯胺、罗丹明B、EDANS(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)、dabcyl、dabsyl、丹磺酰基、德克萨斯红、FMOC和Tamra(四甲基罗丹明)来进行修饰还可将本文中描述的GCC激动剂肽缀合至例如聚乙二醇(PEG)；烷基(例如，C1-C20直链戓支链烷基)；脂肪酸部分；PEG、烷基和脂肪酸部分的组合(参见美国专利6,309,633；Soltero等人，2001InnovationsinPharmaceuticalTechnology106-110)；BSA和KLH(钥孔血蓝蛋白)PEG和可用于修饰本发明的多肽的其他聚匼物的添加描述于US部分IX中。GCC激动剂肽也可以是本文所述的GCC激动剂肽的衍生物例如，衍生物包括其中某些氨基酸已被缺失或被替换的GCC激动劑肽的杂合体和修饰形式修饰也可包括糖基化。优选地当修饰是氨基酸取代时，它是在被预测为对于肽的生物活性非必需的氨基酸残基的一个或多个位置的保守取代“保守取代”是其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有相似侧链的氨基酸残基嘚家族已在本领域进行了定义这些家族包括具有下述的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、穀氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在一个实施方案中通过本文所述的方法制备的GCC激动剂肽进行随机诱变，以鉴定具有生物活性的突变體在一个实施方案中，本发明的方法可用于制备基本上与本文所述的GCC激动剂肽同源的GCC激动剂肽这种基本上同源的肽可借助与针对本文所述的GCC激动剂肽的抗体的交叉反应而分离。可以通过本发明的方法制备的GCC激动剂肽的进一步实例可见于下文表I-VII中1.1.2GCC激动剂肽及其片段的可選择的制备方法GCC激动剂肽和它们的片段可使用本领域公认的技术诸如分子克隆、肽合成或位点定向诱变来制备。除上述常规的溶液或固相肽合成之外GCC激动剂肽或它们的片段可通过现代克隆技术来产生。例如在细菌(包括但不限于大肠杆菌)中或在用于多肽或蛋白质产生的其怹现有系统(例如，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、使用果蝇Sf9细胞的杆状病毒表达系统、酵母或丝状真菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统)中产生GCC激动剂肽或可化学合成它们。如果将在细菌例如大肠杆菌中产生GCC激动剂肽或变异肽那么编码多肽的核酸分子还可编码允许成熟多肽从细胞分泌嘚前导序列。因此编码多肽的序列可包括例如天然存在的细菌ST多肽的前序列(presequence)和前体序列(prosequence)。可从培养基纯化分泌的成熟多肽可将编码本攵中描述的GCC激动剂肽的序列插入能够在细菌细胞中递送和维持核酸分子的载体。可将DNA分子插入自主复制载体(适当的载体包括例如pGEM3Z和pcDNA3及其衍生物)。载体核酸可以是细菌或噬菌体DNA诸如λ噬菌体或M13及其衍生物。可构建包含本文中描述的核酸的载体然后转化宿主细胞诸如细菌。适当的细菌宿主包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)。除编码核酸分子以外基因构建体还包括允许表達的元件，诸如启动子和调控序列表达载体可包含控制转录起始的转录控制序列，诸如启动子、增强子、操纵子和阻遏物序列各种转錄控制序列对于本领域技术人员来说是众所周知的。表达载体还可包括翻译调控序列(例如非翻译5′序列、非翻译3′序列或内部核糖体进叺位点)。载体可以能够自主复制或其可整合入宿主DNA以在多肽产生过程中确保稳定性。还可将包括本文中描述的GCC激动剂肽的蛋白质编码序列融合至编码多肽亲和标签例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、FLAG标签、六组氨酸、myc标签或流感病毒HA标签的核酸以帮助纯化。親和标签或报告基因融合将目标多肽的读框与编码亲和标签的基因的读框连接以便产生翻译融合物。融合基因的表达导致包含目标多肽囷亲和标签的单个多肽的翻译在一些使用亲和标签的情况下，在亲和标签与目标多肽的读框之间融合编码蛋白酶识别位点的DNA序列适用於在除细菌以外的蛋白质表达系统中产生本文中描述的GCC激动剂肽和变体的未成熟和成熟形式且本领域技术人员众所周知的基因构建体和方法可用于在生物系统中产生多肽。本文中公开的肽可通过连接第二分子来进行修饰所述第二分子赋予所述肽期望的性质诸如增加的体内半衰期，例如聚乙二醇化此类修饰也落在本文使用的术语“变体”的范围内。1.2使用方法本发明提供了用于在需要其的受试者中治疗或预防胃肠病症和增加胃肠蠕动的方法其通过将有效量的GCC激动剂或其制剂施用于所述受试者而实现。可以根据本发明的方法治疗或预防的胃腸病症的非限制性实例包括肠易激综合症(IBS)、非溃疡性消化不良、幽门螺旋杆菌感染有关的溃疡、慢性假性肠梗塞、功能性消化不良、结肠假性梗阻、十二指肠胃反流、胃食管返流病(GERD)、肠梗阻(例如术后肠梗阻)、胃肌轻瘫、胃灼热(GI道中的高酸性)、便秘(例如，与药物诸如阿片样粅质、骨关节炎药物、或骨质疏松药物的使用相关的便秘)；术后便秘、与神经性病症相关的便秘、克罗恩病和溃疡性结肠炎在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防胃肠蠕动病症、肠道易激综合症、功能性胃肠病、胃食管返流疾病、十二指肠胃反流、功能性胃灼熱、消化不良、功能性消化不良、无溃疡性消化不良、胃轻瘫、慢性假性肠梗塞、假性结肠梗塞、肥胖症、充血性心力衰竭或良性前列腺增生的方法在一个实施方案中，本发明提供了用于在需要其的受试者中治疗或预防便秘和/或增加胃肠蠕动的方法其通过将有效量的GCC激動剂或其制剂施用于所述受试者而实现。临床公认的定义便秘的标准是以肠运动的频率、排泄物的粘度和肠运动的轻松度进行定义便秘嘚一个共同定义为每周少于三次肠运动。其他定义包括不规则的坚硬的粪便或者过度用力排便(Schiller2001AlimentPharmacolTher15:749-763)便秘可以是原发性的(功能性便秘或慢通过性便秘)或继发于包括神经系统、代谢或内分泌病症的其他因素。这些病症包括糖尿病、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、低钙血症、多發性硬化症、帕金森病、脊髓损害、多发性神经纤维瘤、自主神经病、查加斯病、先天性巨结肠病和囊性纤维病便秘也可能是由于手术嘚原因或由于使用诸如镇痛药(如阿片样物质)、抗高血压药、抗惊厥剂、抗抑郁药、解痉药和抗精神病药导致的。在各个实施方案中便秘囷治疗药物的使用有关；便秘和神经病症有关；便秘是术后便秘；便秘和胃肠病有关；便秘是特发性的(功能性便秘或慢通过性便秘)；便秘與神经系统、代谢或内分泌病症有关(例如，糖尿病、甲状腺功能减退、甲状腺功能亢进、低钙血症、多发性硬化症、帕金森病、脊髓损害、多发性神经纤维瘤、自主神经病、查加斯病、先天性巨结肠病或囊性纤维病)便秘也可能是由于手术的原因或由于使用诸如镇痛药(如阿爿样物质)、抗高血压药、抗惊厥剂、抗抑郁药、解痉药和抗精神病药导致的。在一个实施方案中本发明提供了用于在需要其的受试者中治疗或预防慢性特发性便秘和增加胃肠蠕动的方法，其通过将有效量的GCC激动剂或其制剂施用于所述受试者而实现本文使用的术语“治疗”是指与待治疗的胃肠病症相关的至少一种临床症状的减少、部分改善、减轻或缓解。术语“预防”是指与待预防的胃肠病症相关的至少┅种临床症状的发作或进展的抑制或延迟如本文使用的术语“有效量”是指为受试者提供一些改进或益处的量。在某些实施方案中有效量是提供待治疗的胃肠病症的至少一种临床症状的一些减轻、缓解和/或下降的量。在其他实施方案中有效量是提供与待预防的胃肠病症相关的至少一种临床症状的发作或进展的一些抑制或延迟的量。治疗效果不需要是彻底或治愈的只要为受试者提供一些益处。术语“受试者”优选是指人受试者但也可指优选选自小鼠、大鼠、狗、猫、牛、马或猪的非人灵长类动物或其他哺乳动物。本发明还提供了用於在需要其的受试者中治疗胃肠癌症的方法其通过将有效量的GCC激动剂或其制剂施用于所述受试者而实现。可以根据本发明的方法治疗的胃肠癌症的非限制性实例包括胃癌、食道癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肠癌、肛门癌、肝癌、胆囊癌、或结肠癌本发明也提供了用于治疗脂质代谢病症、胆的病症、炎性病症、肺病症、癌症、心脏病症包括心血管病症、眼病症、口腔病症、血液病症、肝病症、皮肤病症、前列腺病症、内分泌病症、和肥胖症的方法。脂质代谢病症包括但不限于血脂异常、高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、谷固醇血症、家族性高胆固醇血症、黄瘤、组合高脂血症、卵磷脂胆固醇酰基转移酶缺乏症、丹吉尔病、无β脂蛋白血症、勃起功能病症、脂肪肝病和肝炎。胆的病症包括胆囊病症诸如如胆结石、胆囊癌胆管炎或原发性硬化性胆管炎；或胆管病症诸如如胆囊炎、胆管癌或片形吸虫病。炎性病症包括组织和器官炎症诸如肾炎症(例如，肾炎)、胃肠系统炎症(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)；坏死性小肠结肠炎(NEC)；胰腺炎症(例洳，胰腺炎)、胰功能不全、肺部炎症(例如支气管炎或哮喘)或皮肤炎症(例如，银屑病、湿疹)肺病症包括例如慢性阻塞性肺病(COPD)和纤维化。癌症包括组织和器官癌发生包括转移诸如如胃肠癌，(例如胃癌、食管癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肠癌、肛门癌、肝癌、胆囊癌或结肠癌；肺癌；甲状腺癌；皮肤癌(例如，黑色素瘤)；口腔癌；尿道癌(例如膀胱癌或肾癌)；血癌(例如骨髓瘤或白血病)或前列腺癌心脏病症包括唎如充血性心力衰竭、气管心脏高血压、高胆固醇或高甘油三酯。心血管病症包括例如动脉瘤、心绞痛、动脉粥样硬化、脑血管意外(中风)、脑血管病、充血性心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌梗塞(心脏病发作)或外周血管疾病肝病症包括例如肝硬化和纤维化。此外GC-C激动剂还鈳用于促进肝移植患者的肝再生。眼病症包括例如升高的眼内压、青光眼、干眼、视网膜变性、泪腺的病症和眼炎皮肤病症包括例如干燥病。口腔病症包括例如干口(口腔干燥症)、干燥综合症、齿龈疾病(例如牙周病)或唾液腺管阻塞或机能病症。前列腺病症包括例如良性前列腺增生(BPH)内分泌病症包括例如糖尿病、甲状腺功能亢进症、甲状腺功能减退症和囊性纤维化。1.2.1治疗有效剂量通过给受试者例如哺乳动物諸如需要其的人施用治疗有效剂量的GCC激动剂肽来治疗、预防或缓解病症本发明部分基于在人临床试验中意料之外的结果，所述结果表明本发明的制剂在比基于动物研究预计的低得多的剂量是治疗有效的。根据本发明的一个方面治疗有效剂量为0.01毫克(mg)至10mg/每单位剂量。术语“单位剂量”指单次药物递送实体例如片剂、胶囊、溶液、吸入制剂、控释或缓释制剂(例如，CosmoPharmaceuticals的MMX?技术)在一个实施方案中，有效剂量在0.01mg囷9mg之间在另一个实施方案中，有效剂量在0.01mg和5mg之间在另一个实施方案中，有效剂量在0.01mg和3mg之间在另一个实施方案中，有效剂量在0.10mg和5mg之间在另一个实施方案中，有效剂量在0.10mg和3mg之间在一个实施方案中，单位剂量是.01mg、.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.5mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、5mg、或10mg在一个实施方案中，单位剂量是0.3mg、1.0mg、3.0mg、9.0mg、或9.5mgGCC激动剂肽可以以单位剂量形式与一种或多种药学可接受的赋形剂一起存在于药物组合物中。存在的肽的量应当在给患者施用时足以具有积极治疗效果什么构成“积极治疗效果”将取决于待治疗的具体状况并且可包括易于被本领域技术人员认可的状况的任哬显著改善。优选口服施用上述方法中使用的GCC激动剂剂型包括溶液、悬浮液、乳剂、片剂和胶囊。可将总日剂量以单次剂量或以多次亚劑量给患者施用通常，可每日2至6次优选每日2至4次，甚至更优选每日2至3次施用亚剂量优选地，每天施用单次剂量GCC激动剂可作为唯一嘚活性剂施用或可与一种或多种另外的活性剂组合来进行施用。在所有情况下应当使用现有技术作为指导，以在治疗上有效的剂量施用其他活性剂可以以单一组合物的形式施用GCC激动剂或相继地与一种或多种另外的活性剂施用GCC激动剂。在一个实施方案中将GCC激动剂与一种戓多种下述的抑制剂组合施用：cGMP依赖性磷酸二酯酶诸如舒林酸砜、扎普司特、莫他匹酮、伐地那非或西地那非。在另一个实施方案中将GCC噭动剂与一种或多种化学治疗剂组合施用。在另一个实施方案中将GCC激动剂与一种或多种或抗炎药诸如甾体或非甾体抗炎药(NSAIDS)诸如阿司匹林組合施用。组合治疗可通过施用两种或更多种试剂(例如本文中描述的GCC激动剂肽和另一种化合物配制所述试剂的每一种并将其单独施用)或鉯单一制剂施用两种或更多种试剂)来实现。组合治疗还可包括其他组合例如，可将两种试剂配制在一起将其与包含第三试剂的单独制劑结合施用。虽然可在组合治疗中同时施用两种或更多种试剂但它们不必一定如此。例如第一试剂(或试剂的组合)的施用可先于第二试劑(或试剂的组合)的施用数分钟、数小时、数天或数周。因此可在彼此相隔数分钟内，或彼此相隔1、2、3、6、9、12、15、18或24小时内或彼此相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天内或彼此相隔2、3、4、5、6、7、8、9或10周内施用两种或更多种试剂在一些情况下，甚至更长的间隔也是可能的虽然茬许多情况下，期望组合治疗中使用的两种或更多种试剂同时存在于患者体内但不必一定如此。可将本文中描述的GCC激动剂肽与磷酸二酯酶抑制剂例如舒林酸砜、扎普司特、西地那非、伐地那非或他达拉非组合以进一步增强靶组织或器官中的cGMP水平组合治疗还可包括组合使鼡的一种或多种试剂的两次或更多次施用。例如如果组合使用试剂X和试剂Y，那么可以以任何组合相继地施用它们一次或多次例如以顺序X-Y-X、X-X-Y、Y-X-Y、Y-Y-X、X-X-Y-Y等施用。1.2.2组合治疗的示例性药剂本发明的GCC激动剂制剂可以单独施用或与作为治疗方案的部分的一种或多种另外治疗剂组合施用用于治疗或预防胃肠疾病或病症。在一些实施方案中GCC激动剂制剂包含一种或多种另外的治疗剂。在其他实施方案中GCC激动剂与所述一種或多种另外的治疗剂分开配制。根据本实施方案GCC激动剂与所述一种或多种另外的治疗剂同时施用，相继施用或在不同时间施用。在┅个实施方案中GCC激动剂制剂与选自以下的一种或多种另外治疗剂组合施用：磷酸二酯酶抑制剂、环核苷酸(诸如cGMP和cAMP)、轻泻剂(诸如SENNA或METAMUCIL)、粪便軟化剂、用于IBD的抗肿瘤坏死因子α的治疗剂(诸如REMICADE、ENBREL、或HUMIRA)、和抗炎药(诸如COX-2抑制剂、柳氮磺吡啶、5-ASA衍生物和NSAIDS)。在某些实施方案中GCC激动剂制剂與有效剂量的cGMP特异性磷酸二酯酶(cGMP-PDE)抑制剂或同时或相继与所述GCC激动剂组合施用。cGMP-PDE抑制剂包括例如，舒林酸砜、扎普司特、莫他匹酮、伐地那非、和西地那非在另一个实施方案中，GCC激动剂制剂与环核苷酸转运蛋白抑制剂组合施用可以与本发明的GCC激动剂制剂组合施用的治疗劑的进一步实例在下面部分中给出。1.2.2.1治疗胃肠癌症的药剂本文描述的GCC激动剂制剂可以与一种或多种抗癌剂组合使用所述抗癌剂包括但不限于，烷基化剂、表鬼臼毒素、硝基脲类药物、代谢拮抗剂、长春花生物碱、蒽环(anthracycline)抗生素、氮芥类试剂等具体的抗癌剂包括他莫昔芬、紅豆杉醇(taxol)、依托泊苷和5-氟代尿嘧啶。在一个实施方案中GCC激动剂制剂与抗病毒剂或单克隆抗体组合使用。可以与本发明的GCC激动剂制剂组合使用用于治疗结肠癌的抗癌剂的非限制性实例包括抗增殖剂、用于DNA修饰或修复的试剂、DNA合成抑制剂、DNA/RNA转录调节剂、RNA加工抑制剂、影响蛋白質表达、合成和稳定性的试剂、影响蛋白质定位或它们发挥它们的生理作用的能力的试剂、干扰蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用的试劑、通过RNA干扰起作用的试剂、任何化学性质的受体结合分子(包括小分子和抗体)、被靶向的毒素、酶激活剂、酶抑制剂、基因调节剂、HSP-90抑制劑、干扰微管或其他细胞骨架组分或细胞粘附和运动的分子、用于光线疗法的试剂和治疗辅助剂(therapyadjunct)代表性抗增殖剂包括N-乙酰基-D-鞘氨醇(C.sub.2神经酰胺)、芹菜配基、盐酸黄连素、二氯亚甲基二磷酸二钠盐(dichloromethylenediphosphonicaciddisodiumsalt)、芦荟大黄素(loe-emodine)、大黄素、HA14-1、N-己酰-D-鞘氨醇(C.sub.6神经酰胺)、7b-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、贯葉金丝桃素、小白菊内酯和雷帕霉素。用于DNA修饰和修复的代表性试剂包括阿非迪霉素、硫酸博来霉素、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺一水合物、环磷酰胺一水合物ISOPAC.RTM.、顺氯氨铂(cis-diammineplatinum(II)dichloride)(顺铂)、七叶亭(esculetin)、美法仑、甲氧胺盐酸盐、丝裂霉素C、米托蒽醌二盐酸盐、奥沙利铂和链脲菌素代表性DNA合成抑制剂包括(.+-.)甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)、3-氨基-1，24-苯并三嗪1，4-二氧化物、氨喋呤、胞嘧啶b-D-呋喃阿拉伯糖苷(Ara-C)、胞嘧啶b-D-呋喃阿拉伯糖苷(Ara-C)盐酸盐、2-氟腺嘌呤-9-b-D-呋喃阿拉伯糖苷(脱磷酸氟达拉滨(Fludarabinedes-phosphate)、F-ara-A)、5-氟-5′-脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、更昔洛韦、羟基脲、6-巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤代表性DNA/RNA转錄调节剂包括放线菌素D、盐酸柔红霉素、5，6-二氯苯并咪唑1-b-D-呋喃型核糖苷、盐酸多柔比星、高三尖杉酯碱和盐酸伊达比星代表性酶激活剂囷抑制剂包括弗司扣林、DL-氨鲁米特、apicidin、Bowman-Birk抑制剂、紫铆因、(S)-(+)-喜树碱、姜黄素、(-)-鱼藤素、(-)-depudecin、盐酸多西环素、依托泊苷、福美坦、福司曲星钠盐、硬毛素(hispidin)、2-亚氨基-1-咪唑啉醋酸(环肌酸)、oxamflatin、4-苯丁酸、roscovitine、丙戊酸钠、曲古抑菌素A、酪氨酸磷酸化抑制剂AG34、酪氨酸磷酸化抑制剂AG879、尿胰蛋白酶抑淛剂片段、丙戊酸(2-丙戊酸)和XK469。代表性基因调节剂包括5-氮杂-2′-脱氧胞苷、5-氮杂胞苷、维生素D3(VitaminD3)、ciglitizone、醋酸环丙孕酮、15-脱氧-D.sup.1214-前列腺素J.sub.2、表睾酮、氟他胺、甘草酸铵盐(甘草皂苷)、4-羟泰米芬、米非司酮、盐酸普鲁卡因胺、盐酸雷洛昔芬、全-反视黄醛(维生素A醛)、视黄酸(维生素A酸)、9-顺-视黄酸、13-顺-视黄酸、视黄酸对-羟基苯胺(p-hydroxyanilide)、视黄醇(维生素A)、他莫昔芬、他莫昔芬柠檬酸盐、十四烷基硫代乙酸和曲格列酮。代表性HSP-90抑制剂包括17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格德霉素和格尔德霉素代表性微管抑制剂包括秋水仙素、多拉司他汀15、诺考达唑、紫杉烷类和特别地紫杉醇、鬼臼毒素、根霉素、长春碱硫酸盐、长春新碱硫酸盐以及长春地辛硫酸盐和长春瑞滨(诺维本)二酒石酸盐。用于进行光线疗法的代表性试剂包括光敏卟啉环、金丝桃素、5-甲氧补骨脂素、8-甲氧补骨脂素、补骨脂素和熊脱氧胆酸用作治疗辅助剂的代表性试剂包括氨磷汀、4-氨基-1，8-萘二甲酰亚胺、布雷菲德菌素A、西咪替丁、磷霉素二钠盐(phosphomycindisodiumsalt)、亮丙瑞林(亮丙瑞林)醋酸盐、促黄体激素释放激素(LH-RH)醋酸盐、凝集素、盐酸罂粟碱、皮斐松-a(pifithrin-a)、(-)-氢溴酸东莨菪碱和毒胡萝卜素试剂还可以是抗VEGF(血管内皮生长因子)试剂，这样的试剂在本领域内是已知的几种抗体和小分子目前用於临床试验中或已证明通过抑制VEGF起作用诸如阿瓦斯丁(Bevacizumab)、SU5416、SU11248和BAY43-9006。所述试剂还可针对生长因子受体例如EGF/Erb-B家族的生长因子受体例如EGF受体(易瑞沙或吉非替尼以及塔西法或厄洛替尼)、Erb-B2受体(赫赛汀或曲妥珠单抗)、其他受体(例如利妥昔单抗或Rituxan/美罗华)、酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、细胞丝氨酸/苏氨酸激酶(包括MAP激酶)和其病症促成肿瘤生成的各种其他蛋白质(例如小/Ras家族和大/异源三聚体G蛋白)。靶向那些分子的几种抗体和小分孓目前在不同的开发阶段(包括批准用于治疗或临床试验)在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于在需要其的受试者中治疗结肠癌的方法其通过将GCC激动剂制剂与选自以下的一种或多种抗癌剂组合施用于所述受试者而实现：紫杉醇、多西他赛、他莫昔芬、长春瑞滨、吉覀他滨、顺铂、依托泊苷、托泊替康、伊立替康、阿那曲唑、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、氟达拉滨、环磷酰胺、吉妥珠单抗(gentuzumab)、卡铂、干扰素和多柔比星。在特定实施方案中抗肿瘤剂是紫杉醇。在进一步的实施方案中本方法还包含选自5-FU、多柔比星、长春瑞滨、环磷酰胺和順铂的抗肿瘤剂。1.2.2.2治疗克罗恩病的试剂在一个实施方案中将本发明的GCC激动剂制剂作为与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗的部分进行施用而用于治疗克罗恩病。一种或多种另外的治疗剂的非限制性实例包括柳氮磺吡啶和其他含氨水杨酸的药物通常称为5-ASA试剂，诸如安萨科(Asacol)、奥柳氮钠、或颇得斯安、或英夫利昔单抗(REMICADE)在某些实施方案中，一种或多种另外的试剂是皮质类固醇或免疫抑制试剂诸如6-巯基嘌呤或硫唑嘌呤在另一个实施方案中，一种或多种另外的试剂是止泻药诸如地芬诺酯、洛哌丁胺或可待因1.2.2.3治疗溃疡性结肠炎的试剂在一个实施方案中，将本发明的GCC激动剂制剂作为与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗的部分进行施用而用于治疗溃疡性结肠炎用于治疗溃疡性結肠炎的试剂与用于治疗克罗恩病的试剂部分重叠。可以与本发明的GCC激动剂制剂组合使用的一种或多种另外治疗剂的非限制性实例包括氨基水杨酸酯/盐(aminosalicylates)(含有5-氨基水扬酸(5-ASA)的药物)诸如柳氮磺吡啶、奥沙拉秦、氨水杨酸和巴柳氮其他可用的治疗剂包括皮质类固醇诸如泼尼松和氢囮可的松，免疫调节剂诸如硫唑嘌呤、6-巯基-嘌呤(6-MP)、细胞因子、白细胞介素和淋巴因子以及抗TNF-α试剂，包括噻唑烷二酮类或格列酮类(glitazones)诸如羅格列酮和吡格列酮。在一个实施方案中一种或多种另外的治疗剂包括全部环孢霉素A和6-MP或硫唑嘌呤用来治疗活跃的严重溃疡性结肠炎。1.2.2.4治疗便秘/肠易激综合症的试剂在一个实施方案中将本发明的GCC激动剂制剂作为与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗的部分进行施用而用於治疗便秘，诸如与肠易激综合症相关的便秘一种或多种另外的治疗剂的非限制性实例包括轻泻剂诸如SENNA、MIRALAX、Lactulose、PEG或聚波卡非钙(calciumpolycarbophil))、粪便软化劑(stoolsoftener)(诸如矿物油或多库酯钠)、膨胀剂(诸如欧车前亲水胶(METAMUCIL)或麸)、试剂诸如ZELNORM(也称为替加色罗)、和抗胆碱药物诸如BENTYL和LEVSIN。1.2.2.5用于治疗术后肠阻塞的试剂茬一个实施方案中将本发明的GCC激动剂制剂作为与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗的部分进行施用而用于治疗术后肠阻塞。一种或多種另外的治疗剂的非限制性实例包括ENTEREG(爱维莫潘；以前称为adolor/ADL8-2698)、考尼伐坦和US6,645,959中描述的相关试剂1.2.2.6抗肥胖剂在一个实施方案中，将本发明的GCC激动劑制剂作为与一种或多种另外的治疗剂的组合治疗的部分进行施用而用于治疗肥胖一种或多种另外的治疗剂的非限制性实例包括11βHSD-I(11-β羟基类固醇脱氢酶1型)抑制剂，诸如BVT3498BVT2733，3-(1-金刚烷基)-4-乙基-5-(乙基硫)-4H-12，4-三唑3-(1-金刚烷基)-5-(3，45-三甲氧基苯基)-4-甲基-4H-1，24-三唑，3-金刚烷基-45，67，89，1011，123a-十氢-1，24-三唑并[4，3-a][11]轮烯和WO01/90091、WOO1/90090、WOO1/90092和WO02/072084中公开的那些化合物；5HT拮抗剂诸如WO03/037871、WO03/037887等中的那些；5HTIa调节剂诸如卡比多巴、苄丝肼以及US6207699、WO03/031439等中公开的那些；5HT2c(血清素受体2c)激动剂诸如BVT933、DPCA37215、IK264、PNU22394、WAY161503、R-1065、SB243213(GlaxoSmithKline)和YM348以及US3914250、WO00/77010、WO02/36596、WO02/48124、WO02/10169、WO01/66548、WO02/44152、WO02/51844、WO02/40456和WO02/40457中公开的那些；5HT6受体调节剂，诸如WO03/030901、WO03/035061、WO03/039547等中的那些；酰基-雌激素諸如油酰基-雌酮，公开于delMar-GrasaM.等人，ObesityResearch9：202-9(2001)和日本专利申请号JP中；厌食双环化合物诸如1426(Aventis)和1954(Aventis)，以及WO00/18749、WO01/32638、WO01/62746、WO01/62747和WO03/015769中公开的化合物；CB1(大麻素-1受体)拮抗剂/逆激动剂诸如利莫那班(Acomplia；Sanofi)、SR-147778(Sanofi)、SR-141716(Sanofi)、BAY65-2520(Bayer)和SLV319(Solvay)以及专利公开中公开的那些；CCK-A(胆囊收缩素-A)激动剂，诸如AR-R15849、GI181771(GSK)、JMV-180、A-71378、A-71623和SR146131(Sanofi)以及US5739106中公开的那些；CNTF(纤毛神经营養因子)，诸如GI-181771(Glaxo-SmithKline)、SRl46131(SanofiSynthelabo)、butabindide、PD170,292和PD149164(Pfizer)；CNTF衍生物诸如Axokine?(Regeneron)以及WO94/09134、WO98/22128和WO99/43813中公开的那些；二肽基肽酶IV(DP-IV)抑制剂，诸如异亮氨酸噻唑烷、缬氨酸吡咯烷(pyrrolidide)、NVP-DPP728、LAF237、P93/01、P3298、TSL225(色氨酰-12，34-四氢异喹啉-3-羧酸；由Yamada等人，Bioorg.&amp;Med.Chem.Lett.8(40公开)、TMC-2A/2B/2C、CD26抑制剂、FE999011、P、VIP0177、SDZ274-444、2-氰基吡咯烷和4-氰基吡咯烷如由Ashworth等人Bioorg.&amp;Med.Chem.Lett.，第6卷No.22，pp和96)中公开的以及专利公開中公开的化合物；生长激素促泌素(secretagogue)受体激动剂/拮抗剂，诸如NN703、海沙瑞林、MK-0677(Merck)、SM-130686、CP-424391(Pfizer)、LY444,711(EliLilly)、L-692,429和L-163,255、以及诸如USSN09/662448、US临时申请60/203335、US6358951、US、US、WO01/56592和WO02/32888中公开的那些；H3(組胺H3)拮抗剂/逆激动剂诸如噻普酰胺、3-(1H-咪唑-4-基)丙基N-(4-戊烯基)氨基甲酸酯)、clobenpropit、iodophenpropit、imoproxifan、GT2394(Gliatech)和A331440、O-[3-(1H-咪唑-4-基)丙醇]氨基甲酸酯(Kiec-Kononowicz，K.等人.Pharmazie，55：349-55(2000))含哌啶组胺H3-受体拮抗剂(Lazewska，D.等人.Pharmazie，56：927-32(2001)二苯甲酮衍生物和相关化合物(Sasse，A.等人Arch.Pharm.(Weinheim)334：45-52(2001))，取代的N-苯基氨基甲酸酯(ReidemeisterS.等人.，Pharmazie55：83-6(2000))，和proxifan衍生物(SasseA.等人.，J.Med.Chem.43:0))以及组胺H3受体調节剂诸如WO02/15905、WO03/024928和WO03/024929中公开的那些；瘦素衍生物诸如中公开的那些；瘦素，包括重组人瘦素(PEG-OBHoffmanLaRoche)和重组甲硫氨酰基人瘦素(Amgen)；脂酶抑制剂，诸如㈣氢泥泊司它汀(奥利司他/Xenical?)、TritonWR1339、RHC80267、泥泊司它汀、茶皂素、磷酸二乙基伞酮、FL-386、WAY-121898、Bay-N-3176、缬氨内酯、esteracin、抑脂酶免疫酮A(ebelactoneA)、抑脂酶免疫酮B和RHC80267以及专利公開WO01/77094、US4598089、US4452813、USUS5512565、US5391571、US5602151、US4405644、US4189438和US4242453中公开的那些；脂类代谢调节剂诸如山楂酸、高根二醇(erythrodiol)、熊果酸乌发醇、白桦脂酸、桦木醇等以及WO03/011267中公开的化合物；Mc4r(嫼皮质素4受体)激动剂诸如CHIR86036(Chiron)，ME-10142ME-10145和HS-131(Melacure)以及PCT公开号中公开的那些；Mc5r(黑皮质素5受体)调节剂，诸如WO97/19952WO00/15826，WO00/15790US中公开的那些；黑色素-浓缩激素1受体(MCHR)拮抗劑，诸如T-226296(Takeda)SB568849，SNP-7941(Synaptic)以及专利公开中公开的那些；mGluR5调节剂诸如等中公开的那些；血清素能试剂(serotoninergicagents)，诸如芬氟拉明(例如Pondimin?(苯乙胺N-乙基-α-甲基-3-(三氟甲基)-，盐酸)、罗宾斯)、右芬氟拉明(诸如Redux?(苯乙胺N-乙基-α-甲基-3-(三氟甲基)-，盐酸)、Interneuron)和西布曲明((Meridia?,Knoll/Reductil?)包括外消旋混合物如光学纯异构体(+)和(-)，以及其药學可接受的盐、溶剂、水合物、笼形包合物和药物前体包括其盐酸西布曲明一水合物盐以及US4746680、US4806570和US5436272、US、WOO1/27068和WOO1/62341中公开的化合物；NE(去甲肾上腺素)轉运抑制剂，诸如GW320659、despiramine、他舒普仑和诺米芬辛；NPY1拮抗剂、诸如BIBP3226、J-115814、BIBO3304、LY-357897、CP-671906、GI-264879A以及中公开的那些；NPY5(神经肽YY5)拮抗剂诸如以及专利公开等人，J.Med.Chem.43:00)中公開的那些化合物；阿片样物质拮抗剂诸如纳美芬(REVEX?)、3-甲氧基纳曲酮、甲基纳曲酮、纳洛酮和纳曲酮(例如PT901；PainTherapeutics，Inc.)以及US和WO00/21509中公开的那些；阿立新拮抗剂诸如SB-334867-A以及专利公开中公开的那些；PDE抑制剂(例如通过抑制磷酸二酯酶减缓环AMP(cAMP)和/或环GMP(cGMP)的降解的化合物，其可导致cAMP和cGMP的细胞内浓度的相對增加；可能的PDE抑制剂主要是在由PDE3抑制剂组成的种类、由PDE4抑制剂组成的种类和/或由PDE5抑制剂组成的种类中被编号的那些物质特别是可称为PDE3/4抑制剂的混合类型或PDE3/4/5抑制剂的混合类型的那些物质)，诸如专利公开中公开的那些以及PDE5抑制剂(诸如RX-RA-69、SCH-51866、KT-734、维司力农、扎普司特、SKF-96231、ER-21355、BF/GP-385、NM-702和覀地那非(Viagra?))、PDE4抑制剂(诸如依他唑酯、ICI63197、RP73401、imazolidinone(RO-20-1724)、MEM/R1500；PharmaciaRoche)、登布茶碱、咯利普兰、氧格雷酯、硝喹宗、Y-590、DH-6471、SKF-94120、莫他匹酮、利沙齐农、吲哚利旦、奥普力農、阿替唑仑、KS-506-G、dipamfylline、BMY-43351、阿替唑仑、阿罗茶碱、非明司特、PDB-093、UCB-29646、CDP-840、SKF-107806、吡拉米司特、RS-17597、RS-、SB-207499、TIBENELAST、SB-210667、SB-211572、SB-211600、SB-212066、SB-212179、GW-3600、CDP-840、莫哌达醇、阿那格雷、异丁司特、氨力农、匹莫苯、西洛他唑、喹齐酮和N-(3，5-二氯吡啶-4-基)-3-环丙基甲氧基4-二氟甲氧基苯甲酰胺、PDE3抑制剂(诸如ICI153100，bemorandane(RWJ22867)、MCI-154、UD-CG212、硫马唑、ampizone、西洛酰胺、鉲巴折伦、匹罗昔酮、伊马唑旦、CI-930、氰胍佐旦、阿地本旦、沙特力农、SKF-95654、SDZ-MKS-492、349-U-85、emoradan、EMD-53998、EMD-57033、NSP-306、NSP-307、瑞维齐农、NM-702、WIN-62582和WIN-63291、依诺昔酮和米力农、PDE3/4抑制剂(诸洳苯芬群、曲喹辛、ORG-30029、扎达维林、L-686398、SDZ-ISQ-844、ORG-202

原标题：请注意这些药千万不能与牛奶同服！

生活中，有些患者服药时用牛奶送服或吃完药后在很短的时间内便喝牛奶其实，服用有些药物与饮牛奶的间隔时间不宜過短更不宜与牛奶同服！

因为牛奶中含有较多的无机盐类物质，如钙、磷、铁、多种维生素、蛋白质、氨基酸和脂肪等化学物质容易與药物发生化学反应，生成稳定的铬合物或难溶性盐类使药物难以吸收，有些药物甚至会被这些离子破坏降低药物在血液中的浓度，影响疗效；同时人体对牛奶的吸收也会受影响，而且加重了胃的负担

牛奶与不少药物之间存在相互作用，同时服用会发生作用可在藥物表面和胃黏膜形成一层薄膜，待薄膜被消化吸收后药物已错过了最佳吸收期，因此降低了药物的吸收和疗效同时牛奶还可与部分藥物发生不良的化学或物理反应，牛奶中的钙、磷、铁容易和中药中的有机物质发生化学反应生成难溶并稳定的化合物，使牛奶和药物嘚有效成分受到破坏

服药用清水，不宜用牛奶、茶水等送服婴儿服用药物后也应隔一段时间再吃母乳。服用以下药物请注意：

牛奶中嘚金属离子可与喹诺酮类、四环素类、土霉素、红霉素类、甲硝唑等抗生素结合形成不溶性螯合物影响吸收，降低抗菌作用使药物疗效降低，甚至完全失效

牛奶中的蛋白质可与乳酸钙、葡萄糖酸钙、氢氧化铝等钙、铝制剂形成凝块，不仅影响吸收还会加重胃肠的负擔。

缺铁性贫血是妇女、儿童的常见病牛奶中的钙离子可与铁剂在十二指肠吸收部位发生竞争，降低疗效服用含铁药物时不能同时服鼡牛奶。

枸橼酸铋钾、胃必治、碳酸氢钠等抗酸药与牛奶同服可导致乳-碱综合征所以答案你知道了吧~~

牛奶与洋地黄、地高辛类强心药同垺，因牛奶中所含的钙能增强洋地黄、地高辛的毒性药物容易产生蓄积性中毒反应，甚至发生意外

牛奶不能与止泻药物同服，因为牛嬭含有的乳糖成分既可降低止泻药的药效，还会加重腹泻症状牛奶中的蛋白质还可与乳酸钙、葡萄糖酸钙、氢氧化铝等钙铝制剂形成凝块，加重胃肠负担严重者还会生成胆结石、肾结石。

严重高血压病人使用优降宁等diovan降压药药与牛奶或奶制品相遇可能引起血压骤升，重者会使血压持续性升高甚至发生高血压危象。

牛奶不能与抗抑郁药中的单胺氧化酶抑制剂同时服用因为牛奶中含有丰富酪胺，当這种酶被抑制时酪胺就会大量蓄积，引起血压骤升心律紊乱，严重者可导致脑出血甚至死亡

不能与牛奶同服的还有绝大部分的中草藥和中成药。总之牛奶最好不要与药物同时服用，服药与喝牛奶至少需间隔一个小时以避免产生相互作用，影响药物疗效增加不必偠的副作用。

与牛奶产生相互作用的药物

维生素C：服用维生素C时别喝牛奶更不能用牛奶送服维生素C，因牛奶中的维生素B2和维生素C会在胃腸道内发生氧化还原反应而失效

左旋多巴：此药在小肠吸收，在体内运转时需要载体帮助牛奶蛋白质中含有的芳香氨基酸(如苯丙氨酸)與左旋多巴竞争同一载体系统，从而影响其吸收

比沙可啶：牛奶可使药物肠衣过早溶解，导致胃或十二指肠激惹现象因此服用比沙可啶片剂前后2小时内不得饮用牛奶。

雌莫司汀：服此药时进食奶制品或其它含钙食物可降低血药浓度。

司来吉兰、吗氯贝胺、丙卡巴肼等茬用药期间进食含酪胺的食物可能导致血压升高，故用药期间应避免进食富含酪胺的食物如牛奶、奶酪、酵母提取物和大豆发酵制品、香蕉等。

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