大肠杆菌、菌落总数检测步骤_百度文库
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大肠杆菌、菌落总数检测步骤
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菌落总数和大肠菌群（PPT精选）
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水体中大肠菌群的检测
水体中大肠菌群的检测
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实验原理 所谓大肠菌群，是指在37℃培养24h 内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革蓝氏阴性无芽孢杆菌的总称。主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。 水的大肠菌群数是指100 mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数（MPN）表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽孢杆菌等多种细菌。这些细菌都可以随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。 水中大肠菌群的检测方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可适用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要的时间较长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于堵塞滤孔的水样。 材料与器皿 (—)培养基 1、普通乳糖蛋白胨培养液 蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化钠 5g，1.6％溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸馏水 1000mL，pH 7.2~7.4。 将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混匀，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管10mL，115℃灭菌20min。 2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述普通乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制，分装于有杜汉氏小管的试管中，每管5mL。 1、 品红亚硫酸钠培养基（供平板分离用） 蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，琼脂 15～20g，蒸馏水1000mL，无水亚硫酸钠 5g，5％的碱性品红乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。 4、伊红美蓝培养基（EMB培养基）（供发酵法平板分离用，3和4可任选一种） 蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，2％伊红（曙红）水溶液 20mL，5％美蓝（亚甲蓝）水溶液13mL，pH 7.2~7.4。 (二)灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染色液、灭菌培养皿。 实验过程 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h ，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min ，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。 （二）初发酵试验 1、水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液；再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2、接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基（接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡）中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL， 小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。 3、结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体（杜汉氏小管内有无气体）和酸产生（培养基有无变色）。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。 若实验所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。
wangminchao
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DXY All Rights Reserved.池水大肠菌群、菌落总数、尿素等超标
水质检测不合格3处游泳池被曝光_新闻中心_新浪网
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池水大肠菌群、菌落总数、尿素等超标
水质检测不合格3处游泳池被曝光
　　本报8月10日讯(记者崇真)游泳池中大肠菌群、菌落总数、尿素等超标，3家游泳场馆被曝光。10日，青岛市卫生局对外曝光3家不合格游泳馆，提醒市民注意选择合格场所。
　　本次共抽查市内四区、城阳区、崂山区41家人工游泳池，采集游泳池水样82份，复检样品22份。检测结果表明，青岛中国风健身俱乐部、青岛体育运动学校等3家游泳池池水细菌总数、大肠菌群、PH值、尿素、浑浊度等水质检测项目不符合国家“人工游泳池水质卫生标准”，水质检测单项或多项超标。其中，青岛中国风健身俱乐部的浅水区、深水区水样PH值、大肠菌群、菌落总数均不合格，青岛体育运动学校浅水区的水样PH值不合格。
　　消费者对游泳场所水质不合格、空气质量差的单位，可拨打举报投诉，卫生监督执法机构将及时予以查处。
不支持Flash菌落总数和大肠菌群
微生物检验：是指对食品所含有的微生物做出定量和定性分析。相对理化指标，食品有50%水分，可说一半是水分（如贡丸、鱼丸食品等）。食品没有半个微生物，或半个细菌的说法，当食品中微生物数目达到多不可计时，也没有微生物占食品中百分几的说法。因为微生物属于生命范畴，理化指标属于非生命范畴，所以理化指标检验实验用水必须是三级纯水及三级纯水以上，纯水是理化指标分析工作中用量最大的试剂，微生物检验实验用水可以是三级纯水或生活饮用水，通常大多数必须进行灭菌处理。
GB3《食品卫生微生物学检验 罐头食品商品无菌的检验
》，罐头食品经过适度的热杀菌以后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。罐头食品中并非完全灭菌。可以说一个425g装罐头食品中还带有一定量的微生物，但在商业无菌检验中第一步骤，通过庖肉培养基温度在36?癈（厌氧）、55度（厌氧）；溴甲酚紫葡萄糖肉汤（带倒管）温度在36?癈（需氧）、55度（需氧）；酸性肉汤温度在55度（需氧）、30度（需氧）；麦芽浸膏汤温度在
30度（需氧）培养1～5天增菌后，镜检观察；大多数检验可排除商业有菌，确定为商业无菌。第二步骤采用分离培养（锰盐琼脂、血琼脂、卵黄琼脂）分离培养，镜检观察，再鉴定是否有致病性微生物；同时抽取样品经保温10天逐天试验，没有出现胖听或泄露，开罐，经感官检查，pH测定和涂片镜检，确定无微生物增殖现象，则判定为商业无菌。
微生物常规检验分：1、菌落总数的测定：菌落总数是指在一定条件下，每克（每毫升）食品检样所生长出来的细菌菌落总数。其并不表示实际中的所有细菌菌落总数。所谓一定条件，按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37癈培养48小时，能在普通琼脂平板上生长的细菌菌落总数。另外厌氧或微需氧菌，有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，也难以繁殖生长。菌落总数的多少标志着食品卫生质量的优劣。也标志着食品的微生物状态，通常罐头食品的菌落总数往往未检出，而在酱油的菌落总数检定时，有酱油发酵时的发酵细菌，多数也有生产过程中污染的细菌。对一般食品的菌落总数测定是定量非定性的，它不检验菌落是哪些种、属微生物组成的，没有分类学要求，只是检定在适应条件下的每一个活菌细胞必须而且只能生长成一个肉眼可见的菌落。所以国家标准1984年版规定的菌落总数测定的培养时间
24小时，国家标准1994年版（同现行2003年版）规定的多培养一天至48小时，让每一个菌落生长到检验人员肉眼可见程度，至于菌落大小，直径多少，形态如何都不属于检验观察范围，因为不用鉴定该食品的各个菌落是不是同一种属的微生物组成，是否有致病菌。要鉴别食品残渣与菌落形态，不至于把食品（面包、中秋月饼）残渣作为菌落计数。
2、大肠菌群的测定：大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染，可能有肠道致病菌的存在（如沙门氏菌、志贺氏菌），必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群同菌落总数的测定相同是评价食品卫生的重要指标。大肠菌名称并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而提的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其公认的定义如下：需氧及兼性厌氧，在37癈能分解乳糖产酸产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
与菌落总数测定的不同是（1）大肠菌群的测定采用液体培养基作为乳糖发酵试验（初发酵培养），而菌落总数测定采用固体琼脂培养；（2）大肠菌群的测定采用三步骤（即乳糖胆盐发酵试验，伊红美蓝琼脂分离培养，乳糖发酵证实试验）（液-固-液）；而菌落总数采用固体琼脂培养一步测定方法；（3）根据证实为大肠菌群阳性的发酵管数。查MPN检查表，报告每项100mL（g）大肠菌群的最可能数，此属概率学范畴；而菌落总数的测定按稀释度选择及菌落数报告方式，是数字梯度计算方式；(4)
伊红美蓝琼脂分离培养后的大肠菌群镜检系革兰氏阴性杆菌，同时嗅闻伊红美蓝琼脂上有粪便臭味，而菌落总数用肉眼观察(最多用放大镜观察)，无嗅觉特征。
与菌落总数测定的最大相同点是这两个测定方法，同是食品微生物检验的定量分析，同属杂菌范畴，不具有细菌分类学，生化、血清鉴定内容，同属食品中微生物的常规检验且观察都用肉眼判定（前者直接计数，后者第一步骤是关键）。测定计数方式也较接近，菌落总数的计数：个/g或mL（＜；个位数或二位有效数字；多不可计），大肠菌群的计数：个/100g或mL（＜；个位数或二位有效数字；＞）。
大肠菌群的测定作为三步骤与大肠菌群的杂菌状态有一定矛盾之处。第一步乳糖胆盐发酵试验是样品内所有细菌可能的发酵结果，而不是纯菌的发酵试验。许多专家认为初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过平板分离和证实试验后，有时可能成为阴性，当然大多数仍为阳性。大肠菌群（由于是杂群）采用乳糖发酵（或乳糖胆盐发酵），由于采用伊红美蓝琼脂分离培养，也涉及初发酵的量与质的问题。由于采用了（3递度?管）9管乳糖胆盐初发酵，检验观察只考虑每支发酵管内是否有产酸产气，既不考虑每支发酵管内产酸产气量是多是少浓度问题，又不考虑每支发酵管内有大肠菌群繁殖是多是少浓度的问题，也不考虑开始检验时每支发酵管内原有大肠菌群是多是少浓度问题，所以发酵管初发酵在这20mL～11mL液体中如果有一个大肠杆菌，在繁殖中浓度达到——可以只取接种环一环的量液接种分离培养即可。而对于浓度达不到足够量，只取一环量液就不能分离培养出大肠菌群的菌落（在此往往误判为阴性管），必须取1mL、2mL，仍到11mL、20
mL才能培养出大肠菌群的菌落，镜检证实为G杆菌，才可以判定试管为阳性管，而不至于出现假阴性管。所以同一支发酵管初发酵后出现假阳性管的可能性比出现假阴性管的可能性少得多，不足万分之一。本人还认为初发酵产酸产气量不明显，还可以用适度增菌的方法，如再用乳糖发酵（或乳糖胆盐发酵）或其它方法增菌——“大海”捞“针”、“针”繁殖“针”、“针”量足够伊红美蓝琼脂分离培养和镜检证实为G杆菌，第一“针”-----就是量少或只（个）大肠杆菌。
致病性微生物的检验，例如：沙门氏菌的检验步骤：1、前培菌和培菌；2、分离；3、生化学鉴定；4、血清学分型；5、菌型的判定和结果报告。通常取25g样品于前培菌中，如果有一个受伤的沙门氏菌（不是半个）或称半死不活的一个沙门氏菌，培菌后恢复沙门氏菌的生理活性，再到培菌液中培菌，24h后在选择性培养基分离培养，挑可疑菌落，做TSI（三糖铁培养基）等生化学鉴定，现在有15管生化小试管实验，血清学分型；根据血清学鉴定结果，查阅沙门氏菌属抗原表判定菌型。不同的致病性微生物检验采用不同的选择性培养苗进行培养、分离、鉴定（镜检判定、生化鉴定、血清鉴定），但都是定性检验，其难度之大超过了菌落总数和大肠菌群的测定，近年来食品卫生状态好于以往，食品的致病性微生物检验通常是未检出。致病性微生物检验必须有一定的人力、物力和时间，对微生物的定性检验与对微生物的定量检验有质的区别，它更体现微生物鉴定仪在生物学统计数学概率上对生物分类学“种”的定义的应用，
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