 上传我的文档
 下载
 收藏
该文档贡献者很忙，什么也没留下。
 下载此文档
正在努力加载中...
免疫荧光染色方法实验原理和操作步骤，结果分析
下载积分：1500
内容提示：免疫荧光染色方法实验原理和操作步骤，结果分析
文档格式：PDF|
浏览次数：1806|
上传日期： 19:16:21|
文档星级：
全文阅读已结束，如果下载本文需要使用
 1500 积分
下载此文档
阅读此文档的用户还读了
免疫荧光染色方法实验原理和操作步骤，结果分析
官方公共微信关注今日：44 | 主题：143939
微信扫一扫
【交流】免疫荧光染色成功经验的总结&[精华]
页码直达：
问一下楼主，做免疫组化的抗体一般可以做免疫荧光染色吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我做的是一抗，二抗荧光间标染色，染的是细胞的中间丝。细胞核也染过，结果：细胞核染出来很漂亮，但中间丝的荧光很弱。我用的一抗，二抗稀释浓度都是1:100。找不到原因，你们有出现过这种现象的么？求助！！！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
想请问楼主，做星形胶质细胞 细胞爬片的免疫荧光，细胞的接种密度有什么建议么？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这个帖子真好
对我帮助很大
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主，我也染过内皮细胞ZO-1，实验过程很简单，结果也很漂亮。可能冰冻切片或石蜡切片有些不同吧？wh2008是个男性吧？成功经验?蛮自信嘛！stonebreaker_yu的两张icc结果不同的关键在于：你的实验条件不一样吧？我感觉后者好像破膜了，一定是用了triton X-100或tween 20或丙酮吧？因为两张片子，你会发现后者的细胞核变小了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我刚刚接触icc4个月，没什么经验可谈，只是有些许想法而已。根据protocol做实验，遇到问题就不停地请教，只是感觉站在别人的肩膀上而已。闲着没事，穷聊，希望没惹怒楼主!
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
对了，不用太在意光强光弱。通常，只要不在荧光灯下照太长时间即可。我曾经把一张片子遗落在显微镜上，长达12小时以上，显微镜关上了，但日光灯开了一夜。第二天，看片子，哈哈--没事。当然，这种事不是经常发生。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
弱问下楼主，本来抗原在胞质中，却出现了核内的阳性结果，可能原因有什么啊？小虾多谢了！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
wh2008 如何最大限度地降低非特异性染色和背景着色？产生原因：（1）游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。（3）组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。（6）荧光素不纯、标本固定不当等。（7）一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。消除方法：（1）购买高质量、高纯度的荧光素二抗。（2）二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。（3）调整一抗和二抗孵育条件和浓度至最佳。（4）增加清洗次数和延长清洗时间。（5）延长血清封闭时间。（6）适当稀释二抗浓度至出现特异性染色阳性，而非特异性染色保持阴性。楼主您好，我正在做角膜上皮的ZO-1，想请问下您用的二抗是国产的还是进口的，您一抗和二抗是多大浓度的。我的倒是出了，但问题就是要看的部位荧光很弱，邻近的组织非特异染色特别强（主要是胶原）。我的一抗是SANTA的（1：200），二抗是中杉的羊抗兔TRITC（1：100）。我做另一个蛋白用的同公司的二抗，羊抗兔FITC就没有非特异染色了，请问那是不是ZO-1的那组二抗有问题呢？我该怎么办呢？请帮忙分析下，不胜感激。还有贴子里提的新买的二抗透析法，那个具体是如何操作的呢？谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这是我的片子，弱弱的那一条是要看的部位，红的地方是不应该出的地方。在镜下，要看的部位稍微清楚些，能看出在胞膜处一圈一圈的，但由于非特异的太强了，照相时要看的部位就调不了那么清楚。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
非常受益！最近在做大肠上皮细胞的免疫荧光染色，有很多问题，本来很苦恼，看了帖子很受启发，准备再换换条件试一试！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你好，楼主。请教你一个问题，我的实验进行到免疫荧光染色这一步被挡住了，原因是染色后几乎所有的细胞都会有很强的荧光被激发，我的老师认为是非特异染色，他亲自做了两遍结果和我一样，我们重新换了抗体，结果也是这样。我的1抗2抗分别为1:200,1:500. 我需要染得抗原是一种小分子的分泌蛋白，查过文献，没有人染过。下一步我会做几个阴性对照，并且改变抗体浓度，试一下。请楼主帮我分析一下可能的原因，谢谢。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
它的受体的染色
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请问一下楼主，你的封闭血清是和二抗来源的一致吗？查到很多资料，有些说要一致，有些说最好一致，意思是不一致还是可以的，你的意见呢？另外就是你二抗封闭的时间是多少，我现在做的是细胞爬片，开始用两小时，荧光较弱，后来别人推荐6-8h，但是查资料没看到二抗孵育这么久的？谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我同时做了两种抗体的荧光，一红一绿，在标本同一部位分别拍一红和一绿的图片，怎样用软件Photoshop合成双标图？即阳性细胞成为黄色！高手指点一下！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
膜蛋白的免疫荧光是不是不可以做trixon-100透化啊？谢谢指教！！！如果不做透化处理，核染色会受影响吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
很好的贴呢 留个记号 慢慢看
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我的做的比较痛苦啊，我免疫荧光完整的50um直径的血管上染ZO-1和ZAPI内皮细胞，血管还不能破坏，由于是很薄的肠系膜，还不能收缩啊，固定在薄片上，血管里面有荧光染色的肿瘤细胞或者beads，初次在试了一下不是特别理想，基本形状出来。我结合了染内皮细胞的monolayer和组织切片的一些方法，正再做一次，用confocal看看。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
bincaicn edited on
图片整不上来呢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
bincaicn edited on
新手请教，要做小肠的ZO-1蛋白，标本怎样保存时间比较长
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
帖子太好了！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好漂亮啊，好好看看，谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
眼花缭乱的图
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主，二抗选择上需要注意什么吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
LZ你好，我做的是骨髓单个核细胞染色，检测转录因子的定位，可是我做出来的结果呈环形或是C形，这与我们预期的结果很不一样（预期是在细胞核），请问这有可能是什么原因？我的片子的制作是提取单个核细胞后用Cytospin进行甩片后室温保存，有没有可能是片子放久了的影响？谢谢
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
近期要做脑切片，一抗是NPY，来源于兔。二抗带荧光标记，羊抗兔。封闭血清是山羊血清。冰冻切片，取了脑下来就直接用干冰冷冻，没有灌流，然后就做50um切片。做了两次染色，结果像是非特异性染色和阴性染色，昨天做的结果是阴性对照也有荧光了，组织边缘都有荧光。一抗推荐的浓度时1:50-1:200.我设的浓度梯度式1:50,1:100，1:200.孵育条件：4度过夜。二抗推荐用1:32-1:64.我用1:50.孵育条件：室温30分钟。用了0.3%triton X-100.双氧水甲醇浓度时0.3%。我的疑惑是：1，为什么还会产生这些非特异染色和阴性结果？2，NPY这个蛋白有没有阳性对照组织？如果没有，怎么办呢？3，如何判断我的结果是真实的阳性？ 请楼主 赐教
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好东西。。留爪
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
好东西，谢谢分享
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主总结的太好了
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
wh2008 今天拍照（1）肝脏冰冻切片的ZO-1表达（胞膜蛋白，正常对照400*）您好，看到你您做的胞膜抗原的免疫荧光片子很漂亮，我最近也在做胞膜抗原的免疫荧光（FITC标记二抗），但结果很奇怪，麻烦您帮我分析一下原因。以下是我的步骤及结果。真诚希望您能在百忙之中抽出时间帮我分析一下，谢谢！1.冰冻切片10?m，室温干燥20~30min。2.冷丙酮固定5~10min 。3.0.01M PBS （pH 7.4）5min×3 。4.5%BSA封闭，室温，20min（吸干不洗）。5.一抗1：100，4℃过夜。6.0.01M PBS（pH 7.4）5min×3。7.FITC（绿色）标记的二抗1：100，室温孵育1h。8.0.01M PBS（pH 7.4）5min×4。9.Hochest（蓝色）染核1min。10.0.01M PBS（pH 7.4）5min×3。11.抗衰减剂封片：拭干切片周围水份，用抗衰减剂封片，荧光显微镜下观察。 PBS代替一抗为阴性对照。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
很好的帖子，楼主真有心！免疫荧光在计划中，多谢了！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
楼主，你好，最近在做ZO-1的细胞免疫荧光，做了几次，拍照时发现FITC标记的ZO-1都是在胞浆里表达的，可文献上报道的都是细胞膜表达，现在不知道哪里出问题，请帮忙分析一下？ 我的步骤如下：
1.取出细胞爬片，用PBS洗3次，每次10分钟
2.4%多聚甲醛室温固定25分钟，（没有用通透的）
3，PBS 洗3次，每次10分钟
5%BSA封闭30分钟
PBS洗3次，每次10分钟
6，加一抗（用PBS稀释1:100）放在湿盒里4°过夜
PBS洗3次，每次10分钟
加二抗（1:100）室温避光30分钟
9，PBS洗3次，每次10分钟
DAPI染色3分钟（1:1000）
11 PBS洗3次，每次10分钟
抗荧光淬灭剂封闭 以上是***作的过程，请LZ指导下，为什么每次做的ZO-1都是胞浆表达的
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我对白平衡设置很是困惑，请版主及各位竹友帮我分析这张图 底色是白色的吗？有没有曝光呢？谢谢.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：44 | 主题：143939
微信扫一扫
免疫荧光染色的一抗如何选择
页码直达：
刚开始接触科研的菜鸟，没有组里师兄师姐带好心累……目前需要做免疫荧光染色，主要是需要将人成纤维细胞和C57小鼠成纤维细胞区分开的特异性抗体，查了半天文献也没结果……FSP1是成纤维细胞特异性抗体，但是人和鼠上都有表达么？不知道大家找抗体的时候都怎么找的呀……只能PUBMED看文献吗？我都不知道要怎么查……求园子里的大大帮助啊
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
买个单纯抗人或者抗鼠的抗体就行了呀
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
同感，木有师兄师姐带的小菜鸟
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
帖子已被删除这类单纯抗人的抗体特异性够么？会不会特异性不够高然后也染上非人来源的？不知道师兄/师姐有没有做过相关的或者看文献用过？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
晨光微曦 买个单纯抗人或者抗鼠的抗体就行了呀这类单纯抗人的抗体特异性够么？会不会特异性不够高然后也染上非人来源的？不知道师兄/师姐有没有做过相关的或者看文献用过？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
陈汉堡和陈薯条 这类单纯抗人的抗体特异性够么？会不会特异性不够高然后也染上非人来源的？不知道师兄/师姐有没有做过相关的或者看文献用过？实验室的小伙伴有做过类似的，但不是纤维化。这个你直接去抗体公司的网站上选只针对human的，然后电话问下技术支持这个抗体的抗原人鼠同源性多少就可以。当然就算同源性低也不一定真就能区分出人鼠，然后就换抗体换到合适的那个为止运气不好的话，很烧钱的。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
晨光微曦 实验室的小伙伴有做过类似的，但不是纤维化。这个你直接去抗体公司的网站上选只针对human的，然后电话问下技术支持这个抗体的抗原人鼠同源性多少就可以。当然就算同源性低也不一定真就能区分出人鼠，然后就换抗体换到合适的那个为止运气不好的话，很烧钱的。好~十分感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：112 | 主题：512668
微信扫一扫
【求助】细胞免疫荧光染色
页码直达：
这个帖子发布于11年零355天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位高手：做了几次都非常不理想，请指点迷津：胞浆中的抗原。在24孔板中操作，步骤如下，1. 吸出培基，预冷的PBS洗涤2次，2. 4％多聚甲醛固定，冰上20min，也用过甲醇 -20℃固定1h，3. 0.1％Triton in PBS 洗涤3×3min。最近一次是固定后PBS简单洗涤，0.5％Triton in PBS透化处理2×5min，4. 含3％羊血清的PBS室温封闭1h，也有过1％封闭30min，5. 0.1％Triton in PBS 洗涤3×3min，6. 一抗用含3％羊血清（或1％）的PBS稀释，1:100～1:400，4℃过夜（18h），有时是室温2h，7. 0.1％Triton in PBS 洗涤3×3min，8. 二抗1:50～1:200，室温1h，9. PBS简单洗涤后观察。在一抗1:200二抗1:100以及更低稀释度的情况下，能看到极微弱的荧光，仔细辨认比较后认为是特异性的显色，但是太模糊根本无法拍照保存。我看到大家在封闭后是不洗的，那么我的步骤5会对结果有什么影响？要检测的抗原在所有哺乳动物细胞中均有较强的表达，那么会不会把这些抗原也封闭掉了，阻碍其后的特异性抗原抗体反应？请大家指正，急啊！
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
是FITC标记的二抗，goat-anti-mouse
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我指出我做的与你不同的步骤,希望对你有帮助.2. 预冷的4％多聚甲醛固定，常温20min3. 0.1％Triton in PBS 10min。4. 含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 37度封闭1h5. PBS 洗涤3×3min(不含Triton)6. 一抗用含2%的BSA稀释，1:200(根据抗体好坏)，4℃过夜，有时是37度1h7. PBS 洗涤3×3min(不含Triton)8. 二抗1:50～1:200，37度1h，9.
PBS 洗涤3×3min洗涤后观察。不知道你的机器是数码成象,还是胶卷拍的?机器新吗?我建议Triton通透后,PBS洗的过程中不要加Triton了.请按照我的步骤做做.我经常做,很容易出结果.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我们实验室都按照这个protocol做的，效果不错。1. Fix for 3min (less than 5 min)
with enough cold(–20℃) methanol. 2. Block
1% BSA-TBST, R.T. 1h.3. Add primary antibody
Incubate 1h or more at R.T.
1% BSA-TBST, 6min×4 times Avoid strong light for the following steps.5. Add secondary antibody
Incubate 1h or more at R.T.6. Wash
1×TBST, 5min×3 times
1×TBS, twice (briefly)7. Stain DNA with 0.5ug/DAPI in 1×TBS (or1× PBS) for 1min. Wash twice with 1×TBS (or1× PBS), 5min each.8. Seal the coverslip onto a glass slide using mounting medium.
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
感谢两位的指点！我改进方法试试。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园扫二维码下载作业帮
2亿+学生的选择
下载作业帮安装包
扫二维码下载作业帮
2亿+学生的选择
免疫荧光染色时封闭的一步是干什么的?是封闭被破坏的胞膜么?封闭了一抗还怎么进去?thx~
扫二维码下载作业帮
2亿+学生的选择
是封闭可以非特异性结合蛋白质的位点,也就是减少抗体（一抗和2抗都是蛋白质）的非特异性结合.
为您推荐：
其他类似问题
扫描下载二维码