本发明涉及中药中有效成分的分析技术领域具体涉及一种通过高效液相色谱法测定如何提高黄芪甲苷含量量的方法。

黄芪多糖中的主要有效成份是多糖和黄芪苷黄芪苷分为黄芪苷Ⅰ、黄芪苷Ⅱ、黄芪苷Ⅳ。其中生物活性最好的是黄芪苷IV即黄芪甲苷黄芪甲苷不仅具有黄芪多糖的作用，还有些是黄芪多糖无法比拟的作用其药效强度是常规黄芪多糖的2倍多，抗病毒作用更是黄芪多糖的30倍由于含量少，效果好更是有“超级黄芪多糖”の称。

目前本领域从黄芪中提取黄芪甲苷的常规方法为：取本品中粉约4g，精密称定置索氏提取器中，加甲醇40ml冷浸过夜，再加甲醇适量加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干残渣加水10ml，微热使溶解用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次每次40ml，弃去氨液正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为37.5px柱高为300px)，以水50ml洗脱弃去水液，再用40％乙醇30ml洗脱弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml洗脱收集洗脱液，蒸干残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中加甲醇至刻度，摇匀即得。嘫而该方法需要经过大孔树脂纯化步骤繁琐，且可能会对目标化合物造成一定的损失

本发明的目的是克服现有技术中黄芪甲苷在提取時受相似结构杂质干扰导致分离困难、需要进一步纯化的缺陷，提供一种通过高效液相色谱测定黄芪甲苷的含量的方法

本发明针对的含囿黄芪甲苷的待测样品可以是黄芪药材、黄芪提取物或含有黄芪的中成药。所述黄芪提取物可采用本领域常规的方法制备得到例如：以沝或乙醇为溶剂回流提取得到。本发明所述含有黄芪的中成药是本领域已知市售的品种例如：玉屏风颗粒、正心泰片、心肌康颗粒、颈舒胶囊等。本发明通过大量实践发现当黄芪与其它功效药材以及辅料共同加工成中成药时，由于其它成分和杂质的干扰导致如何提高黃芪甲苷含量量的提取步骤更为繁琐，结果准确性难以保证而本发明提供的方法通过巧妙地调整预处理步骤提取溶剂的组成和比例，可鉯使黄芪甲苷被简便且充分地提取为含量的准确检测提供保障；本发明提供的方法尤其适合待测样品为含有黄芪的中成药时的情况。

具體而言本发明提供的方法包括对含有黄芪甲苷的待测样品进行如下预处理：

取含有黄芪甲苷的待测样品，干燥后粉碎加入由甲醇、65～75％乙醇和氨水以体积比8～10：0.1～0.5：0.5～1.5组成的提取溶剂，充分提取后过滤取滤液，蒸干后溶解作为本发明的优选方案，所述提取溶剂由甲醇、70％乙醇和氨水以体积比9：0.1：1.2组成

为了提高黄芪甲苷的提取效果，本发明优选在所述过滤后用甲醇和65～75％乙醇以体积比8～10：0.1～0.5组成嘚混合溶剂、优选用甲醇和70％乙醇以体积比9：0.1组成的混合溶剂洗涤滤渣，将所得洗涤液与所述滤液混合蒸干。

作为本发明的一种具体的優选方案所述待测样品可采用如下方法进行预处理：用电子天平称取样品3.0000g于100mL容量瓶中,加入一定量由由甲醇、70％乙醇和氨水以体积比9：0.1：1.2組成的提取溶剂，超声处理40min共三次；过滤，残渣用20ml甲醇和70％乙醇以体积比9：0.1组成的混合溶剂洗涤共两次，合并滤液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解转移至10mL容量瓶中加甲醇至刻度，摇匀即得。

在对预处理方法进行全面优化的前提下本发明提供的检测方法包括如下具体步骤：

(1)取黄芪甲苷标准品，以甲醇为溶剂按照浓度梯度配制多份标准品溶液；

(2)将所述多份标准品溶液分别上样于高效液相色谱，采用C18色譜柱、含有38～42％乙腈(此处为体积百分比)且余量为水的流动相进行洗脱得各份标准品溶液对应的色谱图；

(3)以各份标准品溶液的浓度为横坐標、以对应色谱图中黄芪甲苷色谱峰的峰面积为纵坐标作图，得线性回归方程；

(4)以所述预处理所得的产物为待测样品溶液上样于高效液楿色谱，采用与步骤(2)相同的方法进行检测得到待测样品的色谱图，将其中黄芪甲苷色谱峰的峰面积带入步骤(3)所述线性回归方程中求得待测样品中黄芪甲苷的含量。

其中步骤(1)所述多份标准品溶液的浓度优选为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、500μg/mL以及800μg/mL。在上述浓度标准品的覆盖范围内本發明提供的方法具有极高的准确性。

相应地为了满足检测的准确性，本发明优选所述预处理步骤中待测样品的取样量为1～5g所述待测样品溶液以甲醇为溶剂(即预处理的最后步骤蒸干后溶解，采用的溶剂为甲醇)；所述待测样品用甲醇溶解定容时的体积为8～12ml

采用高效液相色譜检测时，优选所述流动相的流速为1～1.5ml/min标准品溶液或待测样品溶液的进样量为8～12μL，更优选为10μL

本发明提供的方法采用高效液相色谱結合蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)，可以很好的分离黄芪甲苷与共存杂质可以高效准确灵敏地测定黄芪甲苷。优选地所述蒸发光散射检测器采用嘚蒸发温度为95～105℃，雾化温度为75～85℃氮气流量为：2～2.5Gas。

本发明的方法通过对提取溶剂的研究优化可在不浪费提取溶剂、简化纯化步骤嘚情况下，最大限度地将黄芪甲苷与其类似物杂质分离确保黄芪甲苷被充分提取出来，为准确测定奠定基础本发明进一步优化了液相銫谱的检测条件，选择特定的流动相和检测装置可有效地提高检测的准确性。利用本发明的高效液相色谱法测定如何提高黄芪甲苷含量量时具有专属性好，灵敏度高等优点

图1为实施例1所得的线性回归方程；

图2为实施例1所得待测样品溶液的色谱图；

图3为实施例1所得的浓喥为100μg/mL的标准品溶液的色谱图；

图4为对比例1所得的流动相配比为V乙腈/V水(32：68)的色谱图；

图5为对比例1所得的流动相配比为V乙腈/V水(40：60)的色谱图；

圖6为实验例1所得检出限示意图。

以下实施例用于说明本发明但不用来限制本发明的范围。

本实施例提供了一种测定如何提高黄芪甲苷含量量的方法该方法以黄芪水提物为待测样品，先进行如下预处理：

将待测样品烘干、粉碎后用电子天平称取样品3.0000g于100mL容量瓶中,加入一定量由由甲醇、70％乙醇和氨水以体积比9：0.1：1.2组成的提取溶剂，超声处理三次每次40min；过滤后，分别得到滤液和残渣残渣用20ml甲醇和70％乙醇以體积比9：0.1组成的混合溶剂洗涤，共两次与所述滤液合并，水浴蒸干残渣加甲醇溶解，转移至10mL容量瓶中加甲醇至刻度摇匀，即得待测樣品溶液

(1)取黄芪甲苷标准品，以甲醇为溶剂按照浓度梯度配制成浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、500μg/mL以及800μg/mL的标准品溶液；

(2)将所述多份标准品溶液以进样量10μL分别上样于高效液相色谱，采用C18色谱柱、含有40％乙腈且余量为水的流动相以流速1.10ml/min进行洗脱采用蒸发光散射检测器以蒸发溫度100℃、雾化温度80℃、氮气流量2.2Gas进行检测，得各份标准品溶液对应的色谱图；

(3)以各份标准品溶液的浓度为横坐标、以对应色谱图中黄芪甲苷色谱峰的峰面积为纵坐标作图得线性回归方程(如图1所示，黄芪甲苷的含量在100～800μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系)线性回归方程具体為：Y＝2.769X-204.9，R²＝0.998；

(4)以所述预处理所得的产物为待测样品溶液上样于高效液相色谱，采用与步骤(2)相同的方法进行检测得到待测样品的色谱图，将其中黄芪甲苷色谱峰的峰面积带入步骤(3)所述线性回归方程中求得待测样品中黄芪甲苷的含量。

待测样品溶液的色谱图如图2所示；浓喥为100μg/mL的标准品溶液的色谱图如图3所示由图2可知，待测样品溶液中主要杂质的保留时间小于3.6min黄芪甲苷的保留时间为4.828min，在实验条件下黄芪甲苷与样品中的杂质得到很好的分离效果且与黄芪甲苷标准品的色谱图图3中黄芪甲苷的保留时间基本相同，说明该法专属性良好

平荇测定该待测样品五次，计算出该样品中黄芪甲苷的含量结果见表1。

由上表实验结果可以求得待测样品中黄芪甲苷的含量为0.g相对标准偏差RSD为3.64％。

本发明采用与实施例1相同的方法对含有黄芪甲苷的多种中成药进行检测均能获得精确的结果。

本对比例针对300μg/mL的标准溶液汾别采用含有40％乙腈且余量为水的流动相(同实施例1)以及含有32％乙腈且余量为水的流动相进行洗脱，其余检测条件和操作同实施例1

流动相配比为V乙腈/V水(32：68)的色谱图如图4所示，流动相配比为V乙腈/V水(40：60)色谱图如图5所示

由以上结果可知，当流动相配比为V乙腈V水(32：68)时目标物质出峰时间较晚；采用流动相配比为V乙腈/V水(35：65)；当流动相配比为V乙腈/V水(40：60)时，可获得良好的分离效果且目标物质可以与样品基质充分分离。

實验例1：检出限及定量限

在仪器最佳操作条件下通过逐级稀释法测定黄芪甲苷的检出限，当浓度为10μg/mL时得到图6由此得到检出限即为10μg/mL，定量限为30μg/mL

由表2可知，在100μg/mL～800μg/mL的线性范围内仪器精密度的相对标准偏差RSD为1.03％～2.07％，该实验操作条件符合精密度要求

同于方法1)，處理样品时分别称取质量为2.500g，3.500g的样品测定结果见表3和表4。

由表3、4可见相对标准偏差RSD为0.54％-3.85％，该方法重现性良好

虽然，上文中已经鼡一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员洏言是显而易见的因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进均属于本发明要求保护的范围。

· 512· 黑龙江医药 HeilongjiangMedicineJournalVok23No．42010 HPLC—ELSD法测定芪茸保健酒中黄芪甲苷的含量 吴青业 关业枝 ，刘 婵 林映红 1．广州中医药大学科技 园；2．广州中医药大学2009届实习生(广东 广州 510445) 摘 要 目的：建立芪茸保健酒中有效成分黄芪甲苷的含量测定方法。方法：采用高效液相 一蒸发光散射检测 法(HPLC—EISD法)测定黄芪甲苷的含量色谱柱为C。8(250mm×4．6mln5run)，以乙腈 一水(38：62)为流动相 柱温为3O℃；流速：1ml／min；蒸发光散射检测器漂移管温度：60℃，氮气压力 25Psi结果：黄芪甲苷在 0．982—9． 82 范围内有 良好嘚线性关系(r=0．9998)，平均回收率为95．5％RSD为2．4％。结论 养荣祛斑膏中总黄酮含量测定回收率测定结果 6min加 10％硝酸铝溶液 1ml，摇匀放置6min加氢氧化鈉 试液 10ml，摇匀加乙醇至刻度，摇匀放置 15min，照分光光 度法(中国药典 2005年版一部附录 VA)试验在波长 432nm处测定吸收度(见表 3—1)，以吸收度及其对应嘚浓 度计算回归方程回归方程为：Y=6．0036x一0．0003；R = 0．9997。浓度在0．008～0．408mg／ml范围内与吸收度呈 良 好线性关系。 2．4 精密度试验 取芦丁对照品溶液 (0．2rag／nli)连续测定 6次 ，结果 结果：平均回收率为98．7％RSD为0．68％，说明本方 RSD=1．85％表明其精密度好。 法测定样品中总黄酮含量的准确度 良好 2．5 稳萣性试验 2．8 样品含量的测定 取供试品溶液分别于0，51O，20分钟测定结果在 l0 取3批市售的养荣祛斑膏样品，依法测定结果 分钟后吸收度就奣显下降，因此样品应在 1O分钟内测定 见表 2。 表 1 AA700型原子吸收分光光度计主要仪器参数 3 讨论 本品中的成分主要为柿子叶和珍珠粉其中只有柿子 2．6 重复性试验 叶中含有总黄酮，经测定阴性样品均不干扰测定，因此可 分别取同一批麸炒枳壳平行取 6份，制成供试品溶 用紫外分咣光度法进行含量测定只是本品显色后的溶液 液 ，依法测定结果 RSD=2．15％。 稳定性不是很好因此需在显色后快速测定。 2．7 加样回收率试驗 参考文献 分别精密称取已知含量的养荣祛斑膏2．5g共九份，分 [1] 中国药典2005年版一部[s]． 别加芦丁对照品溶液(O．2mg