本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法了解各种测定方法的基本原理和优缺点。

蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前瑺用的有四种古老的经典方法即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法另外还有一种近十年才普遍使用起来的新嘚测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质

值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质洇为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点在选择方法时应考慮：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

考马斯亮蓝法（Bradford法）由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用

一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法

样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化）氨又與硫酸作用，变成硫酸氨经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以咁氨酸为例其反应式如下：

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行

为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略

计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量應将总氮量减去非蛋白

氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

五种蛋白质测定方法比较如下：

方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法

8～10小时 将蛋白氮转化为氨用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于標准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret法） 灵敏度低

20~30分钟 多肽键＋碱性Cu2＋?紫色络合物 硫酸铵；

某些氨基酸 用于快速測定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏

5～10分钟 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；

各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin－酚试剂法（Lowry法） 灵敏度高

分钟 双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 硫酸铵；

各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；

颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高

5～15分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；

颜色深浅随不同蛋白质变化

二、双缩脲法（Biuret法）

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得箌的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关故可鼡来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速 不同的疍白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测萣。

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度如有需偠，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量计算出其纯度，再根据其纯度称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白鼡H2O 或0.9%NaCl配制酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O）用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液用沝稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现则需要重新配制。

可见光分咣光度计、大试管15支、旋涡混合器等

1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入00.2，0.40.6，0.81.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线

2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法測定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了苐二种试剂即Folin—酚试剂，以增加显色量从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：?在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。?Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原产生深兰色（钼兰和鎢兰的混合物）。在一定的条件下兰色深度与蛋白的量成正比。

Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤以后在生物化学領域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长要精确控制操作时间，标准曲线也不是嚴格的直线形式且专一性较差，干扰物质较多对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应而且对后者的影响还要大得多。酚類、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%）硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%）乙醇（5%），乙醚（5%）丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液只须加浓碳酸钠—氢氧囮钠溶液，即可显色测定若样品酸度较高，显色后会色浅则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。

进行测定时加F olin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前还原反应即能发生。

此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定

此法可检测的最低蛋白質量达5mg。通常测定范围是20~250mg

（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4?5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲

在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸充分混合，接上回流管以小火回流10小时，回流結束时加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再偅复滴加液体溴的步骤）稀释至1升，过滤滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定酚酞作指示剂，然后适当稀释约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右

（3）标准蛋白质溶液:

精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊可改用0.9 % NaCl溶液。

（1）可见光分光光度计

标准曲线的测定：取16支大试管1支作空白，3支留作未知样品其余试管分成两组，分别加入00.1，0.20.4，0.60.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱然后在室温下放置30汾钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标吸光度值为纵座标，绘淛出标准曲线

注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时1分钟後，第2支试管加入5毫升试剂甲2分钟后加第3支试管，余此类推全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管余此类推。待最后一支试管加完试剂后再放置30分钟，然后开始测定光吸收每汾钟测一个样品。

进行多试管操作时为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右由上至下的顺序，逐管加入最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。

Folin—酚试剂法实验表格：

2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克）按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照通常樣品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管如上表中的8、9、10试管。

根据所測样品的吸光度值在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度

注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸囷苯丙氨酸显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）

四、改良的简易Folin—酚试剂法

1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入

2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍

3. 标准蛋白质溶液：同基本法。

测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同只是試剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟用流动水冷却后，在660nm下测定其吸光度值

改良的快速简噫法，可获得与 Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果

五、考马斯亮兰法（Bradford法）

双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的這种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax）由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色经研究认为，染料主偠是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大蛋白质－染料复合物有更高的消咣系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂完成一个样品的测定，只需要5分钟左祐由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间颜色的稳定性最好。洇而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干擾此测定法

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差在制作 标准曲线時通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知疍白质的浓度

（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。

（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯煷兰G—250溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸用水稀释至1升。

（1）可见光分光光度计

（1）取16支试管1支作空白，3支留作未知样品其余试管分為两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）未知樣品的加样量见下表中的第8、9、10管。

（2）加完试剂2~5分钟后即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595空白对照为苐1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗詓染色塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。

考马斯亮兰法实验表格：

（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标用吸光度值A595为纵座标，作图即得到一条标准曲线。由此标准曲线根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量

当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值

蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处其吸光度（即光密度徝）与蛋白质含量成正比。此外蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的囸比关系，可以进行蛋白质含量的测定

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品测定后仍能回收使用。低浓度的盐例如生化制备Φ常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知噵其绝对值

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋皛质和核酸的紫外吸收是不相同的虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差

此外，进行紫外吸收法测定时由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

下面介绍四种紫外吸收法：

因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最瑺用的紫外吸收法

测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度計上直接读取280nm的吸光度值A280蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准石英比色皿盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。

许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查根据此光吸收值可以较准确地计算疍白质浓度。下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%光径为1cm时的光吸收值）的关系。文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。

若查不到待测蛋白质的A1％1cm值则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）

标准曲线的测定：取6支试管，按下表编号并加入试劑：

用第1管为空白对照各管溶液混匀后在紫外分光光度计上测定吸光度A280，以A280为纵座标各管的蛋白质浓度或蛋白质量（mg）为横座标作图，标准曲线应为直线利用此标准曲线，根据测出的未知样品的A280值即可查出未知样品的蛋白质含量，也可以用2至6管A280值与相应的试管中的疍白质浓度计算出该蛋白质的A1％1cm,280nm

核酸对紫外光有很强的吸收在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值通常：

含有核酸的蛋白质溶液，可分别测定其A280和A260由此吸收差值，用下面的经验公式即可算出蛋白质的浓度。

此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所测定的数据来建立的

蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。

用已知浓度的标准蛋白质配制成20～100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白质溶液，分别测定215nm和225nm的吸光度值并计算出吸收差：

鉯吸收差D为纵座标，蛋白质浓度为横座标绘出标准曲线。再测出未知样品的吸收差即可由标准曲线上查出未知样品的蛋白质浓度。

本方法在蛋白质浓度20~100mg/ml范围内蛋白质浓度与吸光度成正比，NaCl、（NH4）2SO4以及0.1M磷酸、硼酸和Tris等缓冲液都无显著干扰作用，但是0.1N NaOH, 0.1M乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液的215nm光吸收值较大必须将其浓度降到0.005M以下才无显著影响。

蛋白质溶液在238nm处的光吸收的强弱与肽键的多少成正仳。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50~500mg/ml已知浓度的5.0ml蛋白质溶液测定238nm的光吸收值A238，以A238为纵座标, 蛋白质含量为横座标绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得

进行蛋白质溶液的柱层析分离时，洗脱液也可以用238nm检测蛋白质的峰位

本方法比280nm吸收法灵敏。但哆种有机物如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类和过氧化物等都有干扰作用。所以最好用无机盐无机碱和水溶液进行测定。若含有有機溶剂可先将样品蒸干，或用其他方法除去干扰物质