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新编实验四 动物血液中DNA的提取-教案
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新编实验四 动物血液中DNA的提取-教案
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3秒自动关闭窗口& 孕妇血样采集后体外存放对血浆中胎儿游离DNA水平的影响
孕妇血样采集后体外存放对血浆中胎儿游离DNA水平的影响
摘 要：目的：探讨孕妇血样采集后体外存放过程中血浆游离DNA水平的影响因素。方法：采集孕妇血样，体外4℃存放6、36h后，实时定量PCR检测孕妇外周游离DNA水平，AnnexinV／PI双染色法流式分析血样白
【题　名】孕妇血样采集后体外存放对血浆中胎儿游离DNA水平的影响
【作　者】李勤 张毅 丁宇烽 胡振林 孙树汉 惠宁
【机　构】第二军医大学长海医院妇产科,上海200433 第二军医大学基础部医学遗传学教研室,上海200433
【刊　名】第二军医大学学报,
【关键词】孕妇 血浆 胎儿游离DNA Dnase 乳酸脱氢酶
【文　摘】目的：探讨孕妇血样采集后体外存放过程中血浆游离DNA水平的影响因素。方法：采集孕妇血样，体外4℃存放6、36h后，实时定量PCR检测孕妇外周游离DNA水平，AnnexinV／PI双染色法流式分析血样白细胞死亡情况，速率法检测血浆乳酸脱氢酶（LDH）活性，单相酶扩散法测定血浆DNA酶活性。结果：血样体外存放36h后，血浆中β-globin基因的拷贝数较存放6h的样品显著增加，而SRY基因拷贝数明显减少；4℃存放条件下，妊娠晚期孕妇外周血中胎儿DNA占总DNA百分比从6h的（10．3±5．6）％下降到36h的（3．0±2．1）％，差异有统计学意义（P〈0．05）。体外存放6h的血样中基本未检出死亡细胞，而存放36h的血样中分别检出了坏死和凋亡的白细胞；36h样品血浆中LDH活性较6h样品显著升高（P〈0．05）。单相酶扩散法结果表明，血浆DNA酶在4℃时虽然活性显著减弱，但仍然保持降解DNA的能力。结论：血样采集后体外存放时间过长会导致血浆总游离DNA增多，而胎儿DNA减少，这种变化可能与血样体外存放过程中白细胞死亡和血浆DNA酶对胎儿DNA的降解作用有关；胎儿DNA抽提应在血样采集后尽早（6h内）进行。
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孕妇,血浆,胎儿游离DNA,Dnase,乳酸脱氢酶
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分子生物学系列实验技术指南
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这个帖子发布于14年零33天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
除添加相关内容外，请不要在这个帖子后面跟贴。谢谢合作。目录第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA的提取和cDNA合成 第五章　重组质粒的连接、转化及筛选 第六章 基因组DNA的提取 第七章 RFLP和RAPD技术 第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章 分子杂交技术 第十章 测序技术
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第一章 质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节 概 述
　　把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 　　质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 　　质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。　　利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。　　质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。　　从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称 ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
第二节 材料、设备及试剂 　　一、材料 　　含pBS的E. coli DH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管),离心管架。 　　二、设备 　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器， 电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和 恒温水浴锅等。　　三、试剂 　　1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。　　2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。 　　3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。 　　4、 溶菌酶溶液： 用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一经使用后便予丢弃。　　5、 3mol/l NaAc (pH5.2)： 50ml水中溶解40.81g NaAc·3H2 O,用冰醋酸调pH至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。 　　6、 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。　　7、溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。 　　8、溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。 　　9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15分钟,使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20℃。 　　10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂),并用等体积的0.5mol/L Tris·Cl (pH8.0)和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。 　　11、 氯仿:按氯仿:异戊醇＝24:1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。 　　按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 　　12、 TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。　　13、STET：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10 mmol/L EDTA (pH8.0)， 5% Triton X-100。　　14、STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。 　　15、 电泳所用试剂： （1） TBE 缓冲液 (5×)：称取 Tris 54g，硼酸27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。 （2）上样缓冲液 (6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。
第三节 操作步骤 　　一、 细菌的培养和收集 　　将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。 　　二、 质粒DNA少量快速提取 　　质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要。　　（一）、煮沸法 　　1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。 　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。 　　3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。 　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。　　5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 　　6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。　　7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。 　　8、取20ml进行电泳检查。 　　[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。　　2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。 　　3. 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。　　（二）、 碱法 　　1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。 　　2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 　　3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。 　　4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。 　　5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 　　6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。 　　7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。 　　8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。 　　9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。 　　10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。　　[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。 　　2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 　　3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 　　（三）、Wizard少量 DNA 纯化系统 　　Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA,整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。 　　该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50ml Wizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml )和50支Wizard微型柱。 　　1、 1-3ml过夜培养细胞液4℃下 12000g离心1-2分钟。 　　2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200μl 细胞悬浮液中,充分混合,并移入eppendorf管中。 　　3、 加200μl 细胞裂解液, 颠倒离心管数次,直到溶液变清亮。 　　4、加200μl 中和液,颠倒离心管数次。 　　5、4℃下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。 　　6、加1ml Wizard少量 DNA 纯化树脂,颠倒离心管数次以充分混匀。 　　7、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。 　　8、将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2ml柱洗液,并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。 　　9、取出微型柱置于eppendorf管中,离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。 　　10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50μl TE(或水)于微型柱中，静止1分钟后，4℃下12000g离心20秒。 　　11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。 　　[注意] 树脂使用前应充分混匀,如有结晶,可将树脂用25-37℃水浴处理10分钟。　　三、质粒DNA的大量提取和纯化 　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。 　　（一）、碱法 　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟,弃上清,将离心管倒置使上清液全部流尽。 　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。 　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。 　　4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中,充分悬浮菌体细胞。 　　5、加入12ml新配制的溶液II, 盖紧瓶盖,缓缓地颠倒离心管数次,以充分混匀内容物,冰浴10分钟。 　　6、加9ml用冰预冷的溶液III, 摇动离心管数次以混匀内容物,冰上放置15分钟,此时应形成白色絮状沉淀。　　7、4℃下5000g离心15分钟。 　　8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分钟。 　　9、加入等体积的饱和酚/氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。 　　10、取上层水相, 加入等体积氯仿,振荡混匀,4℃下12000g离心10分钟。 　　11、取上层水相,加入1/5体积的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分钟。 　　12、4℃下12000g离心15分钟, 沉淀用数ml 70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。 　　13、真空抽干沉淀，溶于500ml TE或水中。 　　[注意] 1. 提取过程中应尽量保持低温。 　　2. 加入溶液II和溶液III后操作应混和,切忌剧烈振荡。 　　3. 由于RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐热的特性,使用时应先对该酶液进行热处理(80℃ 1小时),使DNA酶失活。 　　（二）、Wazard大量DNA纯化系统 　　碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速,只需要离心和真空抽干,这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA(200-20000bp)。该系统不需要酚和氯仿抽提,纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。 该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化,试剂包括: 150ml 细胞悬浮液，150ml 细胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA纯化树脂，125ml Wizard柱子洗脱溶液和10支 Wizard带有存储离心管的柱子。 　　1、100-500ml细胞培养液置离心管中, 22-25℃下5000g离心10分钟, 所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。 　　2、 加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合,可以反复倒置混合,但不能用涡旋振荡,细胞裂解完全时,溶液会变清,这一步需要20分钟。 　　3、 加15ml中和溶液,立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。 　　4、 1℃离心15分钟。 　　5、 小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。 　　6、 加0.5倍体积的异丙醇,混合均匀, 1℃下离心15分钟。 　　7、 弃上清,悬浮DNA沉淀于2ml TE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。 　　8、 加10ml Wizard大量DNA纯化树脂溶液, 并涡旋混合。 　　9、每一个样品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的头插在真空器上(Promega产品,与此配套)。 　　10、将树脂/DNA混合液转入柱子中,真空抽取树脂/DNA混合液。 　　11、将树脂/DNA混合液抽干后,加13ml柱子洗脱溶液至离心管中, 对管底部的树脂/DNA进行洗脱(柱子一边旋转一边加入洗脱液)，并加入柱子中。 　　12、真空抽干所加入的洗脱。 　　13、 再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。 　　14、 加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的树脂, 柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中,2500rpm(1300g)离心5分钟。 　　15、 取出柱子，真空抽干5分钟,再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm(1300g)离心5分钟。　　16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃预热过的灭菌重蒸水或TE,1分钟后2500rpm(1300g)离心柱子/离心管5分钟。 　　17、 取出柱子,离心管中溶液即为提取的质粒DNA,可以直接放在离心管中,盖上盖子，储存在4℃或-20℃备用。　　[注意] 1. 在使用之前,系统所提供的柱子洗脱液按1:1加入125ml 95％乙醇。 　　2. 纯化树脂必须混匀后再用. 　　（三）、Sephrose 2B柱纯化质粒DNA 　　碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理,仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时,则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B进行纯化,该方法具有快速,条件温和,重复性好,载体物质可以再利用等优点,因而已广泛用于质粒DNA纯化。 　　1、将Sepharose 2B经含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。 　　2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase 2B柱上。 　　3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)贮液瓶。 　　4、以1ml流出液为1份进行收集。 　　5、对每一管测定其OD260值,以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。 　　6、合并所有含质粒的洗脱液,用等体积的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g离心2分钟,将上层水相转入新管。　　7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃下沉淀10分钟,然后4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。 　　8、沉淀加70%乙醇洗涤,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清液。 　　9、 沉淀真空抽干,重新溶于TE或无菌水中。 　　[注意] 在装柱过程中,要防止柱床中出现断裂或气泡现象,要使界面保持平整。对新装成的柱,应用含0.1% SDS的TE平衡, 以使柱内的凝胶均匀。 　　
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第二章 DNA酶切及凝胶电泳第一节 概 述 　　一. DNA的限制性内切酶酶切分析 　　限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 　　5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 　　3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' 　　DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 　　DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 　　构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 　　在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 　　二. 凝胶电泳　　琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 　　琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。 　　琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: 　　1、 DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 　　2、 琼脂糖浓度　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。 　　3、 DNA分子的构象 　　当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时,可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收,用同一种限制性内切酶分别水解,然后电泳,如在凝胶上出现相同的DNA图谱,则为同一种DNA。 　　4、 电源电压 　　在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所加电压不得超过5v/cm。 　　5、嵌入染料的存在 　　荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。 　　6、 离子强度影响 　　电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 　　对于天然的双链DNA,常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成浓缩母液,储于室温。
第二节 材料、设备及试剂 　　一、 材料 　　λDNA: 购买或自行提取纯化; 重组pBS质料或pUC19质粒; EcoRI酶及其酶切缓冲液: 购买成品; HindⅢ酶及其酶切缓冲液: 购买成品;琼脂糖(Agarose): 进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 　　二、 设备 　　水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支架, 照相机及其附件。 　　三、 试剂 　　1、 5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 　　2、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 　　3、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于 室温即可。
第三节 操作步骤 　　一、 DNA酶切反应 　　1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 　　2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 　　3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。 　　二、DNA分子量标准的制备 　　采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子,其商品溶液浓度为0.5mg/ml,酶解反应操作如上述。HindIII切割 DNA后得到8个片段,长度分别为23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.56和0.12kb。EcoRI切割lDNA后得到6个片段,长度 分别为21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9和2.5kb。 　　三、 琼脂糖凝胶的制备 　　1、 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液,待用。 　　2、 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 　　3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 　　4、 加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 　　5、 电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 　　6、 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 　　7、 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。 　　8、 DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。 　　9、 DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 　　10、 DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 　　[注意] 1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 　　2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 　　3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。 　　4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。 　　5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 　　6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。
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第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第一节 概 述 　　在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。　　转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 　　转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 　　1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。　　2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 　　3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 　　4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
第二节 材料、设备及试剂 　　一. 材料　　E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制，eppendorf管。 　　二. 设备 　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 　　三. 试剂 　　1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。 　　2.Amp母液：配方见第一章。 　　3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。 　　4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。 　　5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。　　6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
第三节 操作步骤 　　一、 受体菌的培养 　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。 　　二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 　　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。 　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。 　　三、 转化 　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。　　2、 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。 　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。 　　4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 　　5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 　　同时做两个对照: 　　对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 　　对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 　　四、 计算转化率 　　统计每个培养皿中的菌落数。 　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg) 　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积 　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数 　　[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
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