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转基因玉米检测的内参基因筛选与鉴定.pdf 49页
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转基因玉米检测的内参基因筛选与鉴定
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Quantitative PCR; Copy number
1 文献综述 1
1.1 转基因作物发展近况 1
转基因作物及其产品的安全管理 2
转基因作物及其产品的主要检测方法 3
常用检测方法的分类 4
1.3.2 不同PCR 检测检测方法的特点 5
1.3.3 PCR 检测方法分类 6
转基因检测内参基因的定义和功能 9
转基因成分含量的定量 PCR
检测检测流程11
2.1 研究目的及意义 14
2.2 技术路线 15
材料与方法 16
实验材料 16
3.1.1 植物材料 16
3.1.2 载体与菌株 16
3.1.3 酶及试剂 16
3.1.4 仪器设备 16
实验方法 16
3.2.1 常用试剂的配制 16
3.2.2 植物基因组 DNA
3.2.2 DNA 质量测定及浓度定量 17
3.2.2 定性PCR 反应体系和反应条件 18
3.2.3 定量PCR 反应体系和反应条件 18
3.2.4 玉米基因的克隆 18
内参基因定量检测标准曲线的建立 23
内参基因定量检测灵敏度 23
转基因检测内参基因拷贝数的定量PCR 验证 23
结果与分析 24
4.1 候选内参基因的查找及网上Blast 结果 24
玉米转基因检测内参基因序列克隆 27
4.2.1 玉米叶片总RNA 的提取 27
玉米基因的克隆和序列分析 28
玉米转基因检测内参基因定性检测鉴定 29
4.3.1 不同自交系玉米的种内非特异性鉴定 29
4.3.2 种间特异性鉴定 29
4.4 GRMZM2G054655 基因定量反应条件优化 31
4.5 玉米转基因检测内参基因定量检测鉴定 32
4.5.1 不同自交系玉米品种间种内非特异性鉴定 32
4.5.2 种间特异性鉴定 32
4.6 GRMZM2G054655 基因组拷贝数定量PCR 验证结果 33
4.7 玉米转基因检测内参基因定性、定量检测灵敏度实验 34
4.7.1 定性检测灵敏度 34
4.7.2 定量检测灵敏度 35
参考文献 39
作者简介 46
攻读硕士期间的研究成果 46
1 文献综述
转基因作物(Genetically
正在加载中，请稍后...媒体:转基因玉米被指存在非法种植现象
（原标题：转基因作物是否滥种？）
继转基因水稻和转基因大豆之后，转基因玉米也被指出存在非法种植现象。日，环保组织绿色和平发布调查报告称，在辽宁省多个中国玉米主产区出现了未经国家批准的转基因玉米，在当地已经遍布种子销售、种植、粮食收购及市场流通等各个环节。中国的转基因玉米都来自进口，多用于饲料，严禁进入食品流通环节。国内自产的转基因作物，只有转基因棉花和转基因木瓜，除此之外，非试验用途的转基因作物种植都是违法行为。此次国内突然被爆有大面积转基因玉米种植，立即在业内掀起了泾渭分明的两种观点论战：反对者认为，偷种转基因作物是重大丑闻，政府应严厉监管，出重手打击非法种植转基因的现象；支持者则认为，转基因技术是未来农业的发展方向，政府目前在转基因作物的商业化种植上不作为，农民偷种转基因作物是市场的选择。无论此事件最终以何了局，监管部门都绕不过去一个槛，即不能一味靠“堵”来处理目前的转基因发展困局。谁是检测方2015 年5 月至12 月间，绿色和平食品与农业项目主任张菁和同事多次前往辽宁实地调查。绿色和平的调查大致分为三个阶段，即种子销售环节、种植环节和流通环节。2015年5月，绿色和平在辽宁锦州市黑山县、沈阳市的法库县和新民市的种子市场，收集玉米种子样品7个，并送往第三方实验室进行转基因成分检测。结果显示，7个样品中有6个样品含有非法转基因成分。张菁告诉《财经》记者，最初的线索来自一些记者和当地农民，知名反转基因人士崔永元也提供了一些帮助，在种子中发现转基因成分，明确了种植实地调查方向。三个月后，绿色和平前往黑山县、康平县、法库县、新民市以及彰武县等五地的玉米种植区实地调查，在通往各县市的省道和主要干道两侧的玉米大田中随机采样，采样范围涉及30个村镇，共收集玉米样品45个。结果显示，其中42个样品含有转基因成分，比例高达样品总量的93％。在随后的9月至11月间，绿色和平走访了调查区域的中储粮库、玉米私营收购企业、杂粮批发市场和上述五个县市及其周边城市的超市，从大型杂粮批发市场和当地大型超市随机购买了21个玉米制品样品，实验室检测结果显示，其中20个样品检出了转基因成分。张菁称，上述数据让她“震惊”。目前，中国没有批准任何一种转基因玉米进行商业化种植，但调查结果显示，辽宁的转基因玉米“滥种”现象非常严重。对于本次调查中的检测机构，绿色和平方面表示不方便公开具体信息，只强调是“有资质的第三方实验室”。转基因检测需要在农业部认证的农业转基因生物检测机构检测，出具报告才具有权威性。按《农业转基因生物安全管理条例》规定，农业主管部门可根据安全评价工作需要，委托具备检测条件和能力的技术检测机构对农业转基因生物进行检测。在看过绿色和平的公开报告后，中国科学院遗传与发育生物学研究所高级工程师姜韬倾向于认为，绿色和平是用非规范的、初步筛查的方法给出结论，可能不专业、不规范。转基因的测定是严格的专业测试。必须由专业人员取样、封装、记录直至测试，全程规范。此外，若是正规实验室检测出含有转基因成分的玉米有如此高的比例，也有可能是取样过程中发生了转基因污染。比如，盛放过转基因大豆的麻袋，再去装玉米，就会测出玉米含有转基因。姜韬介绍，一次规范的转基因成分定量检测，花费在3000元以上；若采用快速检测转基因的试纸，平均一次费用是五六十元，但试纸法既不能准确定量，也不具有判决性的定性作用，只能用来初步筛查。绿色和平公布的送检样品数目为73个，若全部采用规范的定量检测，则检测费用在20万元以上。张菁同样不肯透露检测费用。中国农业科学院生物技术研究所研究员黄大对《财经》记者分析，按照《农业转基因生物安全管理条例》，转基因的检测要由第三方检测机构来进行，绿色和平没有公布他们的报告是谁做的，不具有公信力。绿色和平食品与农业项目经理李一方表示，以前曾公布过国内第三方实验室的报告，但随后该实验室就受到政府部门的施压，故而现在都与第三方实验室签署保密协议。农业部尚未就此事件做出回应。1月7日，辽宁省农村经济委员会办公室工作人员张江对《财经》记者解释称，以前没接到绿色和平组织的举报。现在省农委已经派出了5个工作组到报告中提到的县市，同时邀请农业系统的工作人员与农户协助进行调查，调查出来后将严格按照相关法律法规进行处理。2015年就调查出有农户非法种植转基因玉米，已经在上报农业部后进行了相应的处理。他介绍，监管重点在种植与种子入库阶段，发现疑似转基因作物或者种子后，会交到农业部认证过的专业检测机构进行检测。谁应受罚2015年10月，康平县和法库县的一些种子店在“试验田”上召开现场会，绿色和平的工作人员也跟随销售人员进场。“试验田”通常是种子店老板自己或亲戚家的几垅玉米地，里面种植着店里招牌的转基因玉米种子。销售人员向前来参观的村民宣讲转基因玉米如何“抗虫”，好管理。抗虫和抗除草剂，是全球已商业化的转基因作物最受推崇的两大优势。绿色和平此次检出的转基因玉米品种主要为Mon810、NK603、Bt11和TC1507，均为抗虫、抗除草剂或者二者兼具的品种。这四款转基因玉米均为全球市场上主要的商业化转基因玉米品种，目前中国只批准进口做加工原料。生产商包括美国孟山都公司、杜邦先锋和陶氏公司，以及瑞士先正达公司。绿色和平未能查到这些转基因玉米的来源。一位跨国种业公司的亚洲区生物技术总监表示，绿色和平提到的几个县，确实是转基因玉米非法种植比较多、而且时间比较长的县。这些县每年都有公开的现场会，向农民推介转基因玉米种子。最大可能是不法分子从转基因试验田中盗种，然后非法制种，私自售卖。如果细心的话，甚至可以粗辨出转基因玉米植株，它的叶子更光滑漂亮。一位中外合资农业公司的市场总监也向《财经》记者证实，辽宁市场上的转基因玉米比较盛行，其他如河南、山东等玉米种植大省目前没有转基因玉米。转基因作物与普通作物相比，可以降低农民的生产成本，大大减少除草、打药等农业劳作，并且在遭遇虫害时保持作物稳产。据上述生物技术总监说，尝到种植转基因作物甜头的辽宁当地农民，“哭着喊着要种转基因抗虫玉米种子”，以致该公司原来在辽宁主打的常规杂交玉米种子销量大幅下滑。巴西也曾经历同样的事情。阿根廷在南美洲最早开始种植转基因大豆，而巴西由于法律法规上的矛盾，一直没有批准种植。巴西农民看着邻国的同行富了起来，心有不甘，就从阿根廷偷运种子回来种，到2004年前，与阿根廷交界的巴西农民普遍偷种转基因大豆。之后，巴西政府放开管制，时任总统卢拉签署法令，允许使用转基因大豆，此后修订法律，解决转基因作物种植问题。在中国批准种植转基因玉米之前，商家非法生产和农民“偷种”的行为都是违法的。在现场会上，也有农民质疑种植转基因玉米的合法性，销售人员则声称，所售种子是经国家批准可种植的，经过辽宁省的审定。根据《农业转基因生物安全管理条例》，未经批准的转基因生物，或者未按照批准的品种、范围、安全管理要求和技术标准生产、加工的，农业主管部门可依据职权，责令停止生产或者加工，没收违法生产或者加工的产品及违法所得。同时，违法所得10万元以上的，并处以违法所得1倍以上5倍以下的罚款；没有违法所得或者违法所得不足10万元的，并处以10万元以上20万元以下的罚款。北京市京悦律师事务所高级合伙人、律师王少华告诉《财经》记者，如果后期调查绿色和平报告所言属实，确实存在非法种植转基因玉米的行为，种植者本身不会承担法律责任，但要追究种子销售者的法律责任。
其实，黄大也相信在国内有一定程度上存在非法偷种转基因农作物的现象，但他认为“这是难免的，是市场的选择，农民肯定倾向于优质的作物种子。即便是存在非法种植、销售的状况，监管部门也不能一味只靠‘堵’来处理目前的困局，要疏堵结合，才能结束现在的转基因农作物种植乱象”。黄大表示质疑绿色和平组织此次所谓调查的合法性。对此，王少华则认为，绿色和平组织在民政部门没有登记注册，因此没有权利进行这样的调查活动，如果农业部门调查后证实并不存在该组织报告中所说的状况，该组织的行为可能违反《治安管理处罚条例》与《刑法》，涉嫌编造、故意传播虚假恐怖信息罪。
本文来源：财经网
责任编辑：杨易颖_NN2426
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30个玉米品种上榜转基因黑名单
&30个玉米品种上榜转基因黑名单
&　农业部办公厅关于印发《2016年农业转基因生物安全监管工作方案》的通知
　　各省、自治区、直辖市农业（农牧、农村经济）厅（局、委），新疆生产建设兵团农业局：为切实做好我国农业转基因生物安全监管工作，确保农业转基因生物技术研究、试验、生产、经营和加工等规范有序，我部研究制定了《2016年农业转基因生物安全监管工作方案》，现予以印发，请认真抓好落实。
　　农业部办公厅
　　2016年1月28日
　　这则关于严禁销售转基因品种的紧急通知称：按照农业部和省种子管理局的相关文件通知，严禁在国内种子市场销售转基因种子，否则承担由此造成的一切后果。近期在种子销售的销售的玉米品种世宾338、金庆707、金庆709、金庆129、金庆168、宏晨788、鹏程8、鹏程5、富尔216、富尔虞我116、桥景607、塔玉1、迪卡1、迪卡3、元发815、佳禾558、锦玉29、中农大236、中农大4号、登海3686、元钰66、福星2000、银禾14、聚禾20、禾育187、亚美72、前锋252、远科701、辽单570及金庆707变名包装的所有产品名称。
　　经农业部确认为转基因种子，应立即退出种子疏通领域。否则种植后产生的粮食会造成极其严重、不可预见的后查。秋后国储粮拒收转基因粮食后果自负；从事销售的当事人也将受到法律的严惩，种植该品种的农户也将遭到经济损失。望全市种子经销商谨慎销售，坚决不销售转基因种子，否则，执法检查中或接举报查实将给以严厉制裁，情节严重将移交司法机关，依法制裁，农民应谨慎购种了，坚决不种转基因品种，以免造成严重后果。通知单位为肇东市种子管理站，时间为2016年1月23日。
　　这次公布的三十个转基因玉米品种，其中有些老面孔，如登海种业的登海3686。早在2010年12月农业部发布的1504号《公告》，共有27个玉米品种被停止生产，并自公告发布起一年内彻底退出中国种子市场。在这27个玉米品种中，&登海3686&、&中农大4号&、&中农大236&、&铁研124&等品种都属于违规商业化的转基因玉米品种。虽然勒令退市，但还是有不少育种公司偷偷繁育。业内一直呼吁：应该从源头进行管理。
　　一、总体目标
　　严格按照《农业转基因生物安全管理条例》&以下简称（条例）&等法规规章要求，按照&属地管理、部门协调、检打联动&的原则，以转基因玉米、水稻为重点，保持高压态势，严厉打击农业转基因生物非法试验、制种、销售、种植等行为，斩断农业转基因生物非法扩散链条，查处一批违法案件，惩处一批违法分子，有效遏制转基因生物违法扩散现象，形成与公安、工商、质检、食药监管等部门联合执法、协同监管的工作格局，提升监管水平，保障我国农业转基因生物产业健康发展。
　二、监管任务
　　（一）研发者督促检查。督促转基因研发单位和研发人员落实第一责任人的责任，健全管理制度，强化对科教单位和种子企业育种活动的督查，严防育种材料非法扩散。 督促研发单位落实相应的安全控制设施和安全管理措施，严格按照《转基因植物试验安全控制措施》标准的规定进行过程管理，建立转基因活动管理记录，实施转基因材料转移合同制度，确保转基因材料可监管、可溯源；督促研发单位开展自查，制定定期检查制度，发现未经批准的试验、试验条件不符合要求等问题限期整改。 探索建立违规研究单位与研究人员系统内通报制度。
　　（二）源头监督检查。对区域内从事农业转基因生物研发、生产、加工、经营活动的单位进行拉网式排查，查清课题负责人、课题内容及生产加工的转化体等，建立检查台账，做到家底清、情况明、研判准。 严格按照监管手册和田间试验检查指南的要求，对转基因研发实验室和安全评价试验进行全面、动态监管，确保检查全覆盖；对参加区域试验的玉米、水稻、油菜、大豆、小麦等品种开展转基因成分检测，严格落实未获得转基因生物安全证书不得参加区域试验的要求，一经发现，立即终止试验并按规定严肃处理；加强试验残余物处理、收获物管理以及相关操作记录的安全检查，严防转基因材料脱离监控。
　　（三）市场专项检查。以玉米、水稻等作物为重点，春耕备耕前及时组织开展专项检查行动，对主产区、种子企业、制种基地以及曾发生过非法扩散的地区进行全面排查，做到早发现早处理。督促企业和基地执行种子生产转基因检验制度，对种子企业和制种基地的品种进行抽样检查，严查转基因种子非法生产；加强种子销售商的宣传教育，探索建立转基因证明材料查验和承诺制度，对种子市场、经营门店开展转基因成分抽检，严查转基因种子非法销售；充分利用试纸条等快速检测方法，对玉米等种植田进行抽样监测，严查转基因作物非法种植。
　　三、工作安排
　　（一）动员部署阶段。（2016年1月-2月）。各省（市、区）农业行政主管部门按照本方案制定相应的安全监管实施方案，明确牵头部门、任务分工和工作机制，细化工作要求和责任落实，尽快组织开展相关工作。
　　（二）组织实施阶段。（2016年3月-11月）各省根据实施方案落实年度任务，严格落实属地化监管职责，认真开展监管工作，春耕前组织开展专项检查行动，及时回应社会关切。 农业部将对各省监管情况进行督查。
　　（三）经验总结阶段。（2016年12月）各省对全年转基因安全监管情况进行总结，及时总结工作中的好经验、好做法，科学研判形势，谋划下一步工作。
　四、工作要求
　　（一）加强属地化管理。省级农业行政主管部门是本行政区域内农业转基因生物安全监管工作的责任主体。 要提高认识、健全机制、加强领导，将工作任务分解到具体的机构、部门和人员，强化责任追究，将转基因生物安全监管工作制度化、常态化。 探索建立约谈当地主要负责人等监管工作新机制，推进属地管理责任的落实。
　　（二）建立协同监管机制。各地农业部门要主动加强与公安、工商等相关部门的沟通协调，形成齐抓共管工作格局。 省级农业行政主管部门要强化统筹协调，明确内容相关机构的职责分工和协作机制；加快建立跨地区执法监管协调机制，对扩散源头不在本行政区域的，要及时向扩散源头所在地农业部门发送协查信函，严肃查处。
　　（三）加大案件查处力度。各地要组织基层农技人员和农业行政执法人员明察暗访，对重大案件追根溯源，查出源头，查清主体，查明责任，依法严肃处理。 依法做好行政处罚案件的信息公开，及时公布案件查处情况，保障公众的知情权。 鼓励群众举报和新闻媒体舆论监督，加大违法案件曝光力度，威慑违法行为。
　　（四）加强科普宣传。组织开展形式多样的科普宣传活动，注重统筹资源，创新机制，尊重科学，客观公正，突出宣传效果，形成科普合力。 紧紧依靠宣传主渠道，积极运用新兴媒体，打造科学传播平台，培育懂技术、会科普、接地气的科学传播队伍，深入学校、社区和公共场所，加强与公众的沟通交流，为转基因科研和产业化营造良好舆论环境。&
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农业部农业转基因督导组一行对我院转基因玉米试验安全进行检查
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9月6日，农业部科技教育司调研员何艺兵、农业部科技发展中心沈平、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心（济南）路兴波一行，前往我院综合试验场督导检查转基因玉米试验安全。自治区农业厅科教处副处长万学英、我院粮作所所长吴新元、科管处副处长任红松等陪同检查。
督导组一行首先前往我院综合试验场玉米转基因试验地进行检查。刘成研究员、孙宝成研究员向督导组详细介绍了我院执行农业部转基因玉米鉴定任务的情况。新疆在农作物抗旱品种鉴定方面具有得天独厚的自然条件，课题组自2009年开始承担并执行农业部转基因玉米筛选及鉴定任务以来，主要以转基因玉米抗旱鉴定为主，在品种材料、隔离带设计、保护行设置等方面，严格按照国务院颁布的《农业转基因生物安全管理条例》及相应配套制度的规定执行，通过禁止其它单位或个人进入试验区、减少试验材料与外界接触、控制种苗、加宽保护行等措施，保证了转基因玉米试验材料的生物安全。目前我院每年承担农业部转基因玉米抗旱鉴定材料超过2000余份。督导组领导和专家仔细查看了试验地的设置、品种材料的选择、抗旱试验的设计等，详细了解和询问了可能存在的问题。
随后，督导组与课题组专家进行了座谈。会上，任红松副处长对督导组一行莅临我院检查指导工作表示欢迎。他表示，我院对转基因生物安全管理工作十分重视，于2012年年初成立了由院长为组长、分管科研的副院长为副组长、相关所所长为成员的转基因生物安全领导小组。为加强我院农业转基因生物安全管理，促进和规范我院转基因生物技术研究工作的有序开展，根据国家《农业转基因生物安全管理条例》《农业转基因生物安全评价管理办法》等法律法规要求，制定了《新疆农业科学院转基因生物安全管理办法》《新疆农业科学院农业转基因实验室、田间试验生物种植安全管理实施细则》，要求从事生物转基因研究的课题组，严格执行国家相关规定，在进行试验前一定要做好备案工作。吴新元所长向督导组介绍了粮作所的总体情况，新疆是我国西北重要的粮食生产基地，玉米是新疆第三大农作物、第二大粮食作物，战略地位十分重要，因此开展转基因玉米的研究对于开拓疆内外及中亚地区的农作物市场有着重要意义。目前新疆转基因玉米和棉花的研究工作取得了一定成绩，但仍存在研究试验人员的安全意识还不够强、各地农业执法人员业务能力和水平较低、监管手段落后等问题，需要进一步加强和完善。
何艺兵调研员对我院转基因玉米抗旱鉴定及生物安全方面取得的成绩表示肯定，他强调，转基因是一项高技术、新产业，具有广阔的发展前景，今年中央1号文件明确强调要“加强农业转基因技术研发和监管，在确保安全的基础上慎重推广”，我国在转基因生物安全方面实行严格的分阶段评价，从实验室研究阶段开始，到田间、小规模的中间试验，再到大规模的“环境释放”，生产性实验，安全证书申请的评估等5个阶段，因此我国的评价体系是全球最严的。新疆农科院在转基因玉米抗旱鉴定工作方面做了大量工作，取得了很好的成效。在做好科研任务的同时，还应在公众宣传、公众满意度和产业化研发方面加强宣传力度和开发水平。（科管处 房世杰 任红松）
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