细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
实验方法原理
独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、 新鲜植物组织称重后取100 mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100 mg放入研钵）， 加入10体积（1 ml）RLT(请确定已加入β-巯基乙醇)和1体积（100 μl） PLANTaid 室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
二、将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13 000 rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，取450 μl裂解物上清转到一个新离心管。
三、加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
四、将混合物(每次小于700 μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm离心60秒，弃掉废液。
五、加700 μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显，可在加入RW1后室温放置5分钟后再离心。
六、加入500 μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500 μl漂洗液RW，重复一遍。
七、将吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
八、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12 000 rpm 离心1分钟。
九、如果预期RNA产量&30 μg，加30-50 μl RNase free water重复步骤7， 合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。
所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13 000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 需要自备乙醇， β-巯基乙醇，一次性注射器（可选），研钵。
3. 裂解液RLT 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 植物组织裂解是否充分直接影响到RNA 提取的质量和产量，本试剂盒中提供的裂解液RLT，主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解，但有些植物组织（例如玉米的乳白色胚乳）或丝状真菌，由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生固化，导致RNA 无法提取，此时可以向我们索取另一种裂解液RLC，将解决该问题。
5. 关于DNA 的微量残留
一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的EASYspin系列RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜，在大多数RT-PCR 扩增过程中极其微量的DNA残留（一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
6. RNA 纯度及浓度检测
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150 v，15 分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA 为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA 条带。动物rRNA 大小分别约为5 kb 和2 kb，分别相当于28S 和18S rRNA。动物RNA 样品中最大rRNA 亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否则表示RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA，OD260/OD280 读数（10mMTris， pH7.5）在1.8-2.1 之间。OD260/OD280 读数受测定所用溶液的pH 值影响。同一个RNA 样品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的OD260/OD280 读数1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9 之间，但这并不表示RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水稀释n 倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260，OD280 测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数n)×40
实验方法原理
独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
试剂、试剂盒
仪器、耗材
一、取500 μl裂解液RLT(已经加入β-巯基乙醇)，转入1.5 ml离心管中，加入50 μl PLANTaid混匀备用。
二、液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50 mg细粉转入上述装有RLT和PLANTaid的离心管，立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。 在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物，但是淀粉含量高的植物不能温育，因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。
三、用带钝针头的一次性 1 ml(配0.9 mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
四、将裂解物13，000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid，将所有裂解物上清转到一个新离心管。
五、较精确估计裂解物(上清)体积，加入0.5体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
六、将混合物(每次小于700 μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13 000 rpm离心60秒，弃掉废液。
七、加700 μl 去蛋白液RW1，室温放置30秒，12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。
如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟后再离心。
八、加入500 μl漂洗液RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500 μl漂洗液RW，重复一遍。
九、将吸附柱RA放回空收集管中，13 000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
十、取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50 μl RNase free water（事先在 70-90℃水浴中加热效果更好）， 室温放置1分钟，12 000 rpm 离心1分钟。
十一、如果预期RNA产量&30 μg，加30-50 μl RNase free water重复步骤七，合并两次洗脱液，或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。
最新实验心得
(共4个心得)
出现问题可能的原因：
1.总RNA质量不好。
2 引物设计的问题。
3 PCR条件的优化。
发表于 16:18
从植物组织中提取RNA需要克服几个困难：
1.破碎和裂解植物细胞壁。
2.抑制rna酶。
3.去除植物多糖和多酚。
4.去除许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA分离。
发表于 11:29
悬浮系与别的组织提RNA最大的不同就是，悬浮系有很高的水分，用液氮不好研磨。丢进去后都成冰块了。
发表于 18:48
(共1个问题)
相关实验Protocol
谁能提供实验帮助？
谁做这个实验？
谁关注这个实验？
丁香通采购热线：400-
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如何确认RNA的质量
一般通过总量，纯度与完整性三大项检测来确认RNA质量： 1总量：微量分光光度计测260nm吸收值计算。2纯度：微量分光光度计测260nm/230nm吸收值的比值，用于评估有机溶剂残留；260nm/280nm吸收值的比值，用于评估蛋白质污染比例。3完整性：以Agilent Bioanalyzer进行毛细管电泳(capillary electrophoresis)，并以软件的RIN(RNA Integrity Number)分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。RNA质检参数中260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。其中：A230: 测定其它碳源物质，如酚，糖类等。A260：核酸的吸收峰测，测RNA，DNA，引物等的浓度用的。A280：蛋白质的吸收峰。一般的，我们只看OD260/OD280(Ratio，R)在1.8~2.1范围内时，我们认为 RNA中蛋白的污染是可以容忍的，不过要注意，当用 Tris 作为缓冲液检测吸光度时，R 值可能会大于 2（一般应该是&2.2的）。当R & 1.8时，溶液中蛋白的污染比较明显，可以根据自己的需要决定这份RNA 的命运。当R & 2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了，而纯RNA的OD260/OD280的比值为2.0。
英语爱好者
R值可能会大于2（一般应该是&lt，则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好.4，比较两者的电泳条带，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了.0！ 以下两种方法.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，其值大于2，当然这时你的实验也就完了。 下面，我们介绍一个可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法。 3）保温试验 方法很简单的，它们的条带也要符合方法2中的条件）。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。 时间到了之后，取出两份样本进行电泳;2.2的），乙醇沉淀RNA，所以希望大家自己多多思考啊;A280的比值为2，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了，RNA的电泳都是用变性胶进行的;1.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巯基乙醇残留，我是这样想的，我可以看到的资料或者是厂家的说明书，各位也同样可以看到的，相信大家都知道的： 1）检测RNA溶液的吸光度 280，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。 电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰。电泳完成后？或许各位非常关心呢;mlssRNA。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1h，按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0，以下同）是非常困难。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R&2.2时、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。 以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，需用乙酸盐、背景（溶液浑浊度）。 1.82,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖、230。相反的。 2）RNA的电泳图谱 一般的如何确认RNA的质量 提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA、320.5 ml的离心管中。 如果你的RNA样本通过了保温实验的检测并且你在后续的实验中还是非常小心的防范RNA酶的骚扰，那么你的实验应该是很难失败了。如果两者的条带一致或者无明显差别（当然，关于RNA的提取技术，我就不说了，为什么呢，说明RNA已经水解成单核酸了。 如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug&#47.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显。当R&lt，内容当然都是一样的了，所以实验做的好不好，主要是心的投入多少的问题、260nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R），其值小于2。纯RNA的A260&#47
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................................................................................................................ 49 酵母三杂交系统............................................................................................................................................................... 50表格目录表格 1、信息准备 ___________________________________________________________________________________ 1 表格 2、RNA探针标记体系 ____________________________________________________________________________ 1 表格 3、PCR法Dig探针标记体系 _______________________________________________________________________ 2 表格 4、PCR法Dig探针反应参数 _______________________________________________________________________ 2 表格 5、抗体稀释液 _________________________________________________________________________________ 3 表格 6、0.2mol/L NaH2PO4 ____________________________________________________________________________ 3 表格 7、0.2mol/L Na2HPO4 ____________________________________________________________________________ 3 表格 8、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method I) ___________________________________________________________________ 3 表格 9、0.2mol/LPB(pH7.2)(Method II) __________________________________________________________________ 3 表格 10、RACE之PCR反应体系 ________________________________________________________________________ 5 表格 11_____________________________________________________________________________________________ 6 表格 12 ____________________________________________________________________________________________ 6 表格 13、随机引物标记DNA探针反应体系 _______________________________________________________________ 7 表格 14、RNA Master Blot杂交检测反应体系 _____________________________________________________________ 8 表格15、LB液体培养基 _______________________________________________________________________________ 9 表格16、LB固体培养基 ______________________________________________________________________________ 10 表格 17、0.1mol/L CaCl2溶液 _________________________________________________________________________ 10 表格 18、TE buffer配制方案 __________________________________________________________________________ 11 表格 19、双酶切反应体系 ___________________________________________________________________________ 12 表格 20、pGEM?-T连接体系 _________________________________________________________________________ 13 表格 21、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求 ________________________________________________________ 13 表格22、平端PCR产物加尾体系 _______________________________________________________________________ 13 表格 23 ___________________________________________________________________________________________ 14 表格 24 ___________________________________________________________________________________________ 14 表格 25 ___________________________________________________________________________________________ 14 表格 26 ___________________________________________________________________________________________ 15 表格 27、LB液体培养基配方 _________________________________________________________________________ 15 表格 28、LB固体培养基配方 _________________________________________________________________________ 16 表格 29、SOC培养基配方 ____________________________________________________________________________ 16表格 30、Mg2+ stock(2M)_____________________________________________________________________________ 16 表格 31 ___________________________________________________________________________________________ 19 表格 32 ___________________________________________________________________________________________ 20 表格33、0.25% Trypsin-0.04% EDTA消化液:500ml ________________________________________________________ 21 表格34、细胞冻存液 ________________________________________________________________________________ 23 表格35、DMEM培养基 ______________________________________________________________________________ 24 表格 36、30%凝胶贮备液 ____________________________________________________________________________ 26 表格 37、10%SDS __________________________________________________________________________________ 27 表格 38、5×电泳缓冲液 _____________________________________________________________________________ 27 表格 39、10%过硫酸胺 ______________________________________________________________________________ 27 表格 40、1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8) ______________________________________________________________________ 27 表格 41、1.0mol/L Tris-Cl ____________________________________________________________________________ 27 表格 42、2×Sample Buffer ____________________________________________________________________________ 27 表格 43、凝胶(分离胶)浓度的选择 ____________________________________________________________________ 27 表格 44、分离胶的制备 _____________________________________________________________________________ 28 表格 45、配制Tris-甘氨酸SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳5%浓缩胶所用溶液 _____________________________________ 28 表格 46、脱色液 ___________________________________________________________________________________ 28 表格 46、考马斯亮蓝(Commassise blue R250)染液 ________________________________________________________ 29 表格 47、TBS配方(Western Blot用)_____________________________________________________________________ 30 表格 48、TBST配方(Western Blot用)____________________________________________________________________ 31 表格 49、Blocking buffer配方(Western Blot用) ____________________________________________________________ 31RNA相关实验 细胞总RNA的提取单层培养细胞加入Trizol试剂的量取决于培养皿的大小，而不取决于细胞的量。悬浮细胞离心收集，每 5-10×106个细胞加入1ml Trizol试剂。组织标本用玻璃匀浆器处理，每50-100mg组织标本，加入1ml Trizol试 剂。将50ml培养瓶（25cm2）内的培液倒去用PBS洗细胞两次，将残存的PBS吸干净。 ① 匀浆分层：加1ml的Trizol转移至DEPC处理过的1.5ml离心管中，室温放置5min。加200μl的三氯甲 烷，剧烈震荡15s，室温静置2-3min, 离心12000rpm×15min，4℃。 ② RNA的沉淀：管内液体分为三层，吸取最上层液体（注意不要吸到其他层液体） ，转移至新EP管中， 加入500μl的异丙醇，室温沉淀10min或-20℃沉淀过夜） ，离心12000rpm ×10min，4℃。 ③ RNA的洗涤：弃去上清，加75%乙醇1ml颠倒洗两次，离心7500rpm×5min，4℃。干燥后加适量无 RNA酶水溶解，-70℃保存。细胞小RNA的提取现行的RNA纯化方法包括有机溶剂抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅胶膜离心柱的方法 来纯化RNA。由于硅胶膜离心柱通常只富集较大分子的RNA（200nt以上） ，小分子RNA往往被淘汰掉，因而不适用于小分子RNA的分离纯化。有机溶剂抽提能够较好的保留小分子RNA，但是后继的沉淀步骤比较 费时费力。MirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纤维滤膜离心柱(glass fiber filter，GFF)，既能够有效富集 10mer以上的RNA分子，又能够兼备离心柱快速离心纯化的优点， 是一个不错的选择。 对于特别稀有的分子， 由于需要分离大量RNA而导致高背景而降低灵敏度，还可以进一步富集10mer到200bp的小分子RNA来提高 灵敏度。小分子RNA(≤200nt) 的提取：用mirVanaTM法简述如下：miRNA 提取试剂盒按照说明书提取。方① 细胞(≤107)收集后用600μl裂解/结合缓冲液裂解（取适量组织(≤250mg)，于液氮中研磨成粉末， 转移至600μl裂解/结合缓冲液中裂解） ，再加入60μl miRNA 匀浆液，在冰上放置10min。加入600μl 酸酚/氯 仿，剧烈混匀30-60s后于室温以10000rpm离心5min(完全分层)。小心吸取上清转移至新的无RNase 1.5ml离心 管中。 ② 加入1/3体积的无水乙醇，完全混匀后加入到装在收集管中的离心柱中(每次最多700μl)，室温以 10000rpm离心1min，收集流出液。 ③ 在收集的流出液中再加入其2/3体积的无水乙醇，完全混匀后再加入到装在收集管中的另一新的离 心柱中，室温以10000rpm离心1min，弃掉流出液。 ④ 离心柱中加入700μl miRNA 洗液1，离心5-10s漂洗。 ⑤ 再按上述方法用500μl 洗液2/3漂洗两次。再离心1min以完全去掉乙醇。 ⑥ 加100μl 室温的洗脱液，10000rpm离心1min，回收RNA。 ⑦ RNA稀释25倍后，紫外分光光度计测其OD260及OD280的值，并计算OD260/OD280，比值大于1.8 时，表明RNA纯度较好。同时根据OD260计算RNA的浓度。小分子RNA的检测由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的 分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究非常困难，目前多数研究人员采用Northern Blots――一种技术复杂而费力的方法来检测小分子RNA的存在。 传统的的Northern Blot方法是是用探针检测 固相支持物（膜）上的目标分子，由于用探针检测液相中的目标分子远比检测固相中的目标更为灵敏，这里 推荐一种基于核酶保护分析方法改进的新方法――将同位素标记好的小分子RNA探针和待检测样品混合杂 交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并纯化杂交的RNA分子，最后通 过变性胶电泳放射自显影检测结果。 这个基于液相杂交的新方法不但操作简单而快速， 而且灵敏度极高―― 可以半定量检测少至10ng总RNA模版中的小分子RNA， 或者说， 可以检测attomole (10-18mol)级别的靶目标！ 灵敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人员还可以在同一个样品中同时检测多个小分子RNA和长 的RNA模版。应该说，这个灵活巧妙的设计可以为从事小分子RNA实验的研究人员带来不少方便。总RNA 的Poly(A)加尾取5 ?g 总RNA，分别加入5?l 10×Poly(A) 聚合酶缓冲液 5?l、MnCl2 5?l、DTT 5?l、0.1% BSA 10?l、 100mmol/L ATP 0.5?l、Poly(A) 聚合酶 4.5U，最后加水补充至50?l。37℃反应30min后补充50?l DEPC 水， 再用等体积水饱和酚/氯仿及等体积氯仿分别抽提一次。 上清移至另一微量离心管中， 加入10?l 3 mol/L NaAc （pH5.2）及250?l无水乙醇，－20℃放置60min。12000rpm离心15min后用75％乙醇漂洗沉淀，室温干燥后溶 于11?l DEPC水中。cDNA的合成取1μg RNA样品，加入0.5μg RT引物，并用DEPC水补足至5μl， 70℃变性5min后立即置于冰上冷却 5min，之后加入如下试剂： 5×ImProm-ⅡTM Reverse Buffer 4μl MgCl2 (25mM) 2.4μl dNTP(25mM) 0.4μl DEPC H2O 6.7μl Ribonuclease Inhibitor(40u/μl) 0.5μl ImProm-ⅡTM Reverse Transcriptase 1μl 组成20μl的反应体系， 于42℃反应1h后70℃处理15min以灭活反转录酶。 制备的cDNA保存于-20℃备用。 从细胞中提取的总RNA反转录以后即可作为PCR的模板。半定量PCR及Real-time PCR① PCR扩增IGF2基因， 琼脂糖凝胶电泳分析， 1% 比较IGF2在不同细胞中mRNA水平的表达情况。 PCR 反应体系为正向引物1μl（10μM） ，反向引物1μl（10μM） ，2μl 2.5mmol/L dNTP，模板cDNA 2μl，10×ExTaq 扩增缓冲液2.5μl，ExTaq DNA聚合酶1U，无菌水补至25μl。 PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s, 59.8 ℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min。同时扩增β-actin作为内参对照。 ② SYBR ExTaq Mix定量PCR扩增miR-483和IGF2在不同细胞中和组织中的表达。取2×SYBR ExTaq Mix 缓冲液20μl，50×Rox 0.8μl， PCR 引物（10μM）各0.8μl，cDNA 2μl，dH2O补至40μl混匀后分至两管， 每管20μl，一个样品平行检测两管。IGF2反应条件如下：先95℃ 15 min, 再执行(95℃ 10s, 60℃ 30s, 72℃ 30s)40个循环，最后溶解曲线分析一个循环(95℃ 1min, 55℃ 1min, 95℃ 1min)。miR-483反应条件如下：先 95℃ 15 min, 再执行(94℃ 15s, 56℃ 30s, 68℃ 30s)40个循环， 最后溶解曲线分析一个循环(95℃ 1min, 55℃ 1min, 95℃ 30s)。同时扩增GAPDH作为内参对照。 ③ PCR扩增IGF2不同启动子的转录本。 取4μl cDNA， 25μl 2×GC BufferⅠ， 2.5mmol/L dNTP， 4μl 50pmol 特异性引物及2.5U LA Taq polymerase，加水至50μl。反应条件如下：先94℃ 3min, 再执行(94℃ 1min, 58℃ 1min, 72℃ 1min)30个循环，最后72℃ 10min。2%琼脂糖电泳PCR产物。Northern blot 分析miRNA的表达小分子RNA探针的制备方法其实很简单：只需要准备目的基因的一小段寡核苷酸序列，3'端另外增加8个和T7启动子互补的碱 基，将这段寡核苷酸和T7启动子引物退火，用Klenow大片断补齐得到双链的转录模版，然后用T7RNA聚合 酶、rNTP和标记物混合，体外转录得到标记的小分子RNA探针。这种方法可以快速制备各种标记（同位素、 非放射性标记均可）的小于100nt的小分子RNA探针，适用于包括RPAs，Northerns和原位杂交等各种方法检 测小分子核仁RNA(small nuclear RNA, snRNA)，small interfering RNA (siRNA)，micro RNA (miRNA)和 mRNA。非放射性标记的探针还可以用于原位杂交研究miRNA或者mRNA在组织中的分布。 1) RNA的电泳分离 ① 配制15％的8mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶： 40％丙烯酰胺(19:1) 7.5ml 尿素 9.6g 10×TBE 2 ml 加DEPC水至20ml 再加入10％AP 100 μl及8μl TEMED，混合均匀后灌制凝胶。 ② 取10μg 小分子RNA样品加入等体积的凝胶上样缓冲液Ⅱ。 ③ 95-100℃热变性2-5min后冰上放置。 ④ RNA样品加入到15％尿素变性凝胶的上样孔中，120V电压电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶的底端。 ⑤ 取下凝胶，在含0.5-1 μg/ml EB的1×TBE浸泡5min。 ⑥ 用1×TBE漂洗2-5min。 ⑦ 用紫外凝胶成相系统检测RNA的完整性及电泳情况。 2) 转膜及固定 ① 剪四张印迹纸及一张Hybond N+ 尼龙膜（四周均比凝胶大约1.5cm） ，浸泡在0.5×TBE中。 ② 在干净塑料手套上铺上两层浸湿的印迹纸， 上面铺上浸湿的尼龙膜， 再小心地把凝胶放在尼龙膜上， 最后再铺上两层印迹纸（操作时不要留气泡） 。 ③ 把凝胶及尼龙膜等小心地转移至半干电转移装置上，于50mA恒流转移4h。 ④ 取下尼龙膜在0.5×TBE中稍稍漂洗一下，去掉残留的凝胶碎片，滤纸上晾干。 ⑤ 在紫外交联仪上用紫外线交联125mJ。 ⑥ 最后于80℃干烤1h。 3) 探针的制备 探针是与所杂交的RNA完全反向互补的寡核苷酸。 ① 探针的标记： DNA探针 1μl(25pmol) 10×T4 多聚核苷酸激酶缓冲液 3μl [γ-32P]ATP 18μl H2O 5μl T4 多聚核苷酸激酶(10U/μl) 3μl 总体积 30μl 37℃ 反应1h后70℃15min以灭活T4 多聚核苷酸激酶。 ② 分别加入30μl 水、1μl糖原(20mg/ml)、240μl 5mol/L NH4Ac及750μl 冰冷的无水乙醇。混匀后冰上 沉淀30min。 ③ 于13000rpm，4℃离心20min。④ 用冰冷的80％乙醇漂洗后，再于10000rpm，4℃离心5min。 ⑤ 小心吸弃上清，室温干燥后加入100μl水溶解标记的探针。 4) 杂交、洗膜及显影 ① 将膜放在杂交瓶中，加入5ml完全溶解的ExpressHyb杂交液，于37℃预杂交1h后，再换用新鲜的5ml ExpressHyb杂交液，加入溶解的探针并混匀，于37℃杂交16h。 ② 用2×SSC，0.1％SDS溶液在室温洗膜三次，再用0.5×SSC，0.1％SDS于室温洗一次。 ③ -70℃对X光片曝光24-48h, 显影5min，定影5min。siRNA designRNAi靶的选择原则: Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted gene should be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG). Search for sequence motif AA(N19 )TT or NA(N21 ), or NAR(N17 )YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U). Avoid targeting introns, since RNAi only works in the cytoplasm and not within the nucleus. Avoid sequences with & 50% G C content. Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats. Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs have successfully induced gene inhibition. Avoid sequences that share a certain degree of homology with other related or unrelated genes. How to obtain a cDNA sequence for target selection Before finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRNA sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI , since the RefSeq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences have unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For example, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence predicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq. Search LocusLink by gene name or symbol at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/ . Once the locus of your gene is found, scroll down to the &NCBI Reference Sequence (RefSeq)& section and look for mRNA. Search Entrez Gene at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene , and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll down to the &NCBI Reference Sequence (RefSeq)& and look for mRNA. Search Nucleotide database using Entrez query tool at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db= Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to the RefSeq database only select &RefSeq& from the &Only from& menu, this restricts the query to the RefSeq collection select &mRNA& from the &Molecule& menu, this restricts the query to mRNA RefSeq records Homology search The RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is essential to minimize off-target effects. Although mostsiRNA design tools provide BLAST option, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are some BLAST tools for homology search. NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches Blat tool on UCSC Genome Website http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat Ensembl Blast http://www.ensembl.org/Multi/blastviewsiRNAs的制备方法越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA （small interfering RNAs， siRNAs)来抑制特定的哺乳动物基因 表达。siRNA是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个 过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway） 。RNAi的应用包括功能基因组学，药物靶筛选，细胞信 号传导通路分析等等。 目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括 ?化学合成 ?体外转录 ?长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III) ?siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs ?PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 前面3种方法包括体外制备siRNAs然后经过转染或者电转导入哺乳动物细胞后面两种方法则依赖能够表达 siRNAs的DNA载体或者表达框转染到细胞中。每种方法都有自己的优点和缺点。哪种是最好的方法，其实 取决于实验目的。这里简单介绍这5种方法，优点和缺点，以及它们最适合的应用。 siRNA的设计 除了方法3以外， 其他的方法都在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。 关于怎样设计siRNA以及siRNA 设计对siRNA功能的影响，尽管我们不断掌握越来越多有关设计原则的信息。但这仍然不是精确的。通常来 说，每个目标序列设计3―4对siRNAs，在后面的实验中选择最有效的那个。网上有提供免费的siRNA设计工 具。 体外制备 1.化学合成 尽管化学合成是最贵的方法， 但是却是最方便的――研究人员几乎不需要做什么工作。 包括Ambion和Qiagen 公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特 殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3―4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用 其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。 2.体外转录 通过体外转录的方法可以合成siRNAs，这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比高的筛选 siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer siRNAConstruction Kit为例，一旦得到DNA Oligo模版（这个还是需要DNA合成的，不过DNA合成的成本就比较低 了） ，只要24小时就可以，不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录 合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还 是需要占用研究人员相当的时间――毕竟，化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的 siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果（0.5-20 nM vs. 50-100 nM per transfection ） 。 最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。 3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法 ――制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。这个方法是选择通常是200―1000碱 基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得 到一众siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法 和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs， 通常能够保证目的基因被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注 意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜） 。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因 沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。Ambion 公司曾经用它的Silencer siRNA Cocktail Kit(RNase III)试剂盒成功关闭几个基因，包括c-fos, GAPDH, La, ?-actin, 和Ku-70。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。 体内表达 前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用 siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于： 从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。 这两种 方法的优点在于不需要直接操作RNA。 4. siRNA表达载体 多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种， 操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物 细胞中的表达(1C4)。这3类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U 来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的 pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是 正确的。 不过幸好载体容易大量扩增， 这个优点足以弥补所有缺陷， 特别是当载体在实验中确实有效的时候。 毫无疑问， siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法――带有抗生素标记的 载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达， 持续数星期甚至更久。 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进 行瞬时筛选， 也有助于富集带质粒的细胞。 这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。 最近多个厂家开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达， 其优势在于可以直接高效率感染细胞进 行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便。 最适用于： 已知一个有效的siRNA序列， 需要维持较长时间的基因沉默， 或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作） 。 5. siRNA表达框架 siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞 进行表达而无需事前克隆到载体中。这个方法最早是由Castanotto和其同事(5)采用，包括一个RNA pol III启 动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、 测序等颇为费时的步骤， 可以直接由PCR得到， 不用一天的时间。 因此， SECs成为筛选siRNA的最有效工具， 甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配！如果在PCR两端添加酶切位点，那么通 过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳 定表达siRNA和长效抑制的研究。 这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的 话，那问题就可以解决了。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适于大规模制备。 Silencer Express siRNA Expression Cassette Kits提供人源和鼠源的U6启动子或者人源H1启动子元件可供选 择，并已经过c-fos基因抑制的检验。 最适用于： ：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。siRNAs对照设置A．普通阴性对照 1.siRNA实验应该有阴性对照； 2.通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照； 3．Scrambled阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性； 4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因同源性很低。 B．荧光标记阴性对照 1. RNAi negative control与哺乳动物基因无同源性； 2.通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况； 3.可用于优化转染条件和评价转染效率； 4.具备很好的pH耐受性，在活细胞中更稳定。 C．siRNA阳性对照 阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。您可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基 因表达检测方法是可靠的。 siRNA阳性对照较为常用的如下： 1 LaminA/C 2 GFP22 3 Luciferase GL2 4 MAPK1 5 Beta-Actin 6 Vimentin 7 P53 8 GAPDH9 Cyclophilin B D．转染试剂对照 对于一个完善的对照系统，转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染试剂对照可以检测转染试剂 对细胞的毒性、细胞的成活率等细胞转染的各个因素影响。 E．避免Off-target对照 对于RNAi研究来说，在哺乳动物中，off-target效应是一个十分关注的问题。有大量的报道，一个siRNA影响 多个基因的表达。因此，大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个siRNA进行实验，然后分析各 自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的siRNA对同一个靶基因产生相似的干扰效果。不适 用于：长期抑制研究。 （如果克隆到载体后就可以了） 。分子克隆相关实验 DNA的重组T-载体连接(T/A cloning)(一)、试剂: a. 外源片段DNA； b. pGEM?-T载体，Promega: A1360, A180, A3600 and A3610//TM042； (二)、流程: a. 将pGEM?-T离心至管底； b. 建立以下连接体系(每次使用前切记将2×Buffer振荡混匀):表格 20、pGEM?-T连接体系成份 2×Rapid Ligation, T4 DNA Ligase 需要按照每次用量分装，避免多次冻融。 pGEM?-T PCR product(含有粘性A末端) T4 DNA Ligase(3 Weiss units/ul) 用Tip吹打混匀，室温×1h或4℃过夜 说明: A、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求: 10ul体系 5ul 1ul 3ul(Maximum) 1ul 20ul体系 10ul 1ul 8ul(Maximum) 1ul表格 21、单次连接反应中PCR产物最低浓度要求PCR产物大小 反应体系最低含量要求 0.5kb 125ng 1kb 250ng 2kb 500ng B、平端PCR产物加尾体系(for efficient T/A cloning): 每ul含量 8.5ng~41.5ng 17ng~83ng 34ng~166ng表格22、平端PCR产物加尾体系成份 纯化的无A末端的PCR产物 Taq DNA Polymerase 10× Reaction Buffer with MgCl2 dATP Taq DNA Polymerase 去离子水 反应:70℃×15~30min 加入量 1~7ul 1ul 终浓度0.2mM 5units 调整体积 10ul 实用量参考 7ul 1ul 0.2ul(from王升启) 1ul(Takara产品) 此步后可电泳回收， 用10ul水溶解离心， 吸取3ul(10ul体系) 或者8ul(20ul体系) 进行连接反应 可将10ul全部 用于连接反应吸取1~2ul和pGEM?-T载体 建立连接反应f.准备转化JM109宿主细胞，蓝白斑筛选。粘端连接法㈠试剂及材料: 1、 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1。 2、 载体DNA:如pcDNA3；pET22B＋； 3、 10×Buffer K: 4、 限制性内切酶:BamH I； EcoR I； 5、 去离子双蒸水 6、 10×连接buffer 7、 T4DNA连接酶 ㈡操作程序: 1、 制备目的基因片段和载体:建立如下酶切反应:表格 236ul 去离子双蒸水 DNA(1~3ug) 10ul 10×Buffer K 2ul BamH I 1ul EcoR I 1ul 20ul 总体积 37℃，1~2h。 2、琼脂糖凝胶电泳回收目的基因片段和线性化载体。 3、在1.5ml Ep管中建立连接反应: -16ul 2ul 1ul 1ul 20ul表格 24目的基因片段(0.4ug) 载体DNA(0.1ug) 10×连接Buffer T4DNA连接酶 去离子双蒸水至总体积 16℃，12~16h。 13ul 4ul 2ul 1ul 20ul 6ul 2ul 1ul 1ul 10ul4、将连接的重组质粒转化大肠杆菌，根据不同用途选择不同菌种制备感受态细胞。平端连接法㈠试剂及材料 1、 含目的基因片段的DNA:如NDF1/pcDNA1； 2、 载体DNA:如pGEM-T Vector System(Promaga) 3、 去离子双蒸水 4、 TE(pH8.0) 5、 10×连接buffer或2×连接buffer 6、 T4DNA连接酶 ㈡操作程序 1、制备目的基因片段和线性化载体。 采用PCR技术从NDF1/pcDNA1中扩增出NDF1片段。 去5'-P的线性化载体(pGEM-T):由试剂公司提供。 2、连接反应:表格 25、连接反应体系目的基因(平端)(0.5ug) 载体(pGEM-T)(0.1ug) 10×连接Buffer 2×连接Buffer T4DNA连接酶 去离子双蒸水至 16℃，16~24h。 7ul 1ul 1ul 1ul 10ul 3ul 1ul 5ul 1ul 10ul3、转化大肠杆菌，并进行克隆筛选鉴定。平-粘端连接法(定向连接反应)㈠试剂及材料 1、 含目的基因片段的DNA:2、 3、 4、 5、 6、 7、载体DNA 限制性内切酶 T4DNA连接酶 Klenow大片段 2mM dNTP 10×Klenow buffer㈡操作程序 1、 制备目的基因片段和线性载体: 将载体双酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收，使其两端位点不同，防止连接时自身环化。 将含目的基因片段的DNA双酶切，其中必需只有一种与载体酶切所有的酶相同；琼脂糖凝胶电泳回 收。 2、 粘端连接: 目的基因片段和载体各有一匹配末端，先用T4DNA连接酶作用12h，将其连接起来； 而另一端不匹配，无法连接。此时即形成载体连接有目的基因的开环结构。 3、 Klenow补平反应，将带有目的基因载体两端的粘性末端补平:表格 26、连接反应体系4ul 带目的基因的载体(0.1ug) 10×Klenow buffer 2ul 1ul Klenow大片段 2mM dNTP 2ul 20ul 去离子双蒸水至总体积 室温2h后，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。 溶于10ul TE(pH8.0)。 4、平端连接: 再用T4DNA连接酶作用16~20h，使带有目的基因片段的载体环化。 5、将重组质粒转化感受态细胞。 6、克隆筛选鉴定重组质粒。重组质粒的转化准备:感受态细胞；抗性平板；预热SOC培养基；水浴42℃；制冰 c. IPTG stock solution(0.1M): 1.2g IPTG(Cat. Promega#V3951)+50ml双蒸去离子水，过滤除菌，4℃保 存。 d. X-Gal(2ml):100mg IPTG(Cat. Promega#V3941)溶解于2ml二甲酰胺(N,N’-dimethyl-formamide)中，铝 箔纸封口，-20℃保存。 e. LB培养基:表格 27、LB液体培养基配方Bacto?-tryptone Bacto?-yeast extract NaCl 去离子水 用NaOH调节至pH7.0，高压灭菌 10g 5g 5g 1000ml表格 28、LB固体培养基配方Bacto?-tryptone Bacto?-yeast extract agar NaCl 去离子水 用NaOH调节至pH7.0，高压灭菌 10g 5g 15g 5g 1000mlk. 含有ampicillin的LB培养板:在1000ml LB培养基中加入15g agar(琼脂)，高压。冷却至50℃左右时加 入氨苄青霉素(Amp)至终浓度100ug/ml。按照30~35ml/85mm培养皿铺板。凝固后置37℃中30min~1h， 4℃保存备用。 l. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板:按上述方法制作LB培养板，加入ampicillin,加入至0.5mM IPTG和80ug/ml X-Gal后倒板。或者加入100ul 100mM IPTG和20ul 50mg/ml X-Gal至平板表面，37℃ ×30min可完全吸收后使用。 m. SOC培养基:表格 29、SOC培养基配方Bacto?-tryptone Bacto?-yeast extract NaCl, 1mol/L KCl, 1mol/L 双蒸去离子水 搅拌助溶，高压，冷却至室温 Mg2+ stock, 2M, 已过滤除菌(实际可高压) Glucose, 2M, 已过滤除菌 p. Mg2+ stock(2M) 2.0g 0.5g 1ml 0.25ml 97ml 1ml 1ml表格 30、Mg2+ stock(2M)MgCl2?6H2O MgSO4?7H2O 双蒸去离子水 过滤除菌//实际可高压 20.33g 24.65g 100ml流程(根据 pGEM?-T说明书): c. 准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，使用前将平板预热至室温； d. 离心连接反应管。吸2ul连接体系至置于冰上的灭菌1.5ml Epp离心管中； e. 从-70℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，置冰浴中约5min至刚刚融化。轻轻晃动使细胞混匀； f. 吸取50ul细胞至上述连接反应管中；//实际吸取200ul感受态细胞 g. 轻晃Epp管以混匀，至冰上20min； h. 于准确调温的42℃水浴中热休克45~50sec，切勿轻晃、震动； i. 将Epp管返回冰上2min； j. 加入950ul已经预热到室温的SOC培养基至Epp管中；//实际加入750ulSOC培养基 k. 摇菌:37℃×1.5h(~150rpm)； l. 铺 板 : 将 100ul 转 化 体 系 铺 板 至 准 备 好 的 LB/amp/IPTG/X-Gal 平 板 ； // 实 际 此 时 才 加 入 IPTG(4ul)+X-Gal(40ul) 或者其它筛选用抗生素，然后将1ml全部铺板m. 液体被吸收后倒置培养37℃×过夜，后置4℃下以便蓝白斑鉴定重组质粒的鉴定α-互补㈠原理:适用于含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体，载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息。 ㈡材料及试剂 1、 X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷): 20mg/ml:20mg X-Gal溶于1ml二甲基甲酰胺，-20℃避光保存。 2、 IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(200mg/ml): 1g IPTG溶于4ml去离子双蒸水，定容至5ml，0.22um过滤除菌，-20℃保存。 ㈢操作程序: b. 制备含相应抗菌素(如Ap+、Mana+)的琼脂平板。 c. 于平板表面加X-Gal 40ul和IPTG 4ul， 用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个平板表面。 37℃， 1h至所有液体消失。 d. 将200ul转化的菌液涂布于平板表面，37℃，20min后，倒置平板继续培养12~16h。 e. //实际使用:在20ul连接体系中加入200ul感受态细胞，加入780ul SOC培养基，加入IPTG(+4ul)和 X-Gal(+40ul)至所需浓度，将此1ml菌液全部铺板，超静台中吹干约1h，转入倒置培养基中培养 8~12h(常规为过夜)，然后将平板置4℃×1~4h，观察确定蓝白斑。 f. 中止培养，将平板置4℃1~4h，使蓝色充分显现。 g. 挑取白色菌落置3~5ml LB(含相应抗生素如Ap)液体培养基中，37℃振荡培养8~12h，提取质粒， 限制酶酶切分析进一步鉴定。插入失活㈠原理:该法适用于有2个以上选择标志的载体。 ㈡试剂及材料 1、 Ap 2、 tet 3、 转化菌 ㈢操作程序 1、 制备LB琼脂培养板分别含有Ap和tet。 2、 将200ul转化的菌液均匀涂布于含Ap培养板表面，置37℃20min后倒置培养12~16h。 3、 挑取转化菌落，分别接种于Ap培养板和tet培养板上相对应的位置，37℃培养8~10h。 4、 如重组体的外源DNA克隆在tet基因中，应挑选在Ap培养板生长而在tet培养板不能生长的菌落，并 将其接种于含Ap的LB液体培养基5ml中培养8~12h。 5、 小量制备质粒，限制酶酶切分析进一步鉴定。菌落原位杂交㈠原理:采用放射性标记的探针与含有质粒的细菌菌落杂交的方法。 待检菌落从主平板移到硝酸纤维素 滤膜上与标记探针杂交，通过放射自显影查出阳性菌落，再从主平板上回收这些阳性菌落。 ㈡试剂及材料 1、 10%SDS 2、 变性液:0.5M NaOH，1.5M NaCl 3、 中和液:0.5M Tris-Cl(pH7.4)，1.5M NaCl 4、 2×SSC 5、 预杂交液: 50%甲酰胺 6×SSC 0. 1%SDS 1×Denhart 100ug/ml变性鲑精DNA 6、α-32P标记的双链DNA探针 7、 硝酸纤维素滤膜(NC膜) 8、 杂交袋 9、 保鲜膜 10、 暗盒 11、 X光片 ㈢操作程序 1、 菌落转移 ⑴用铅笔在NC膜上划好约5mm见方的小格(直径60mm划64小格，直径80mm划100小格)，将膜夹在两 层普通滤纸之间高压灭菌备用。 ⑵将滤膜平铺于合适的琼脂培养皿上，膜与琼脂之间不要有气泡。 ⑶用灭菌牙签挑取待检菌落顺序涂到滤膜小格子中间，同时涂一个仅含载体质粒的菌落作为阳性对 照。 ⑷将两种平皿37℃倒置培养10~14h，无滤膜的平板置4℃保存待用。取下滤膜继续处理。 2、 膜处理 ⑴使长有菌落的膜面向上，将膜放到浸有10%SDS的普通滤纸上，勿使膜与纸间有气泡，室温3min。 ⑵将膜移至用变性液浸透的滤纸上，室温5min。 ⑶将膜移至中和液浸透的滤纸上，室温5min。 ⑷将膜移至2×SSC浸透的滤纸上，室温5min。 ⑸将膜置80℃烤箱干烤1~2h。 3、 杂交 ⑴将膜放入杂交袋中，加入预杂交液，封口。42℃摇床轻摇4h。 ⑵将标记好的α-32P双链DNA探针置100℃变性5min，迅速冰浴冷却，加入预杂交袋中，混匀，封口。 ⑶42℃水浴摇床杂交过夜。 ⑷将膜移至2×SSC，0.5%SDS中室温漂洗5min，弃洗液。 ⑸加入0.1×SSC，0.1%SDS，置42℃15min，弃洗液。 ⑹重复第二洗液⑸洗膜2次。 ⑺将膜移到干的滤纸上，室温晾干或37℃烘干。⑻用保鲜膜将膜包好，置暗盒中，在暗室中压片。-20℃显影24~72h。 ⑼显影后，根据X光片黑色显印斑点位置判断保留的培养皿中所对应的菌落。将其挑出，进一步扩增， 制备质粒，酶切鉴定。限制酶酶切分析㈠原理:经上述三种方法筛选出的菌落需进一步酶切鉴定，尤其对鉴定外源基因的插入方向更为重要。 ㈡操作程序: 1、 挑选转化菌落，培养。 2、 小规模制备质粒。 3、 琼脂糖凝胶电泳初筛。挑选出比对照质粒(原始质粒)大的重组质粒，该质粒插入有目的基因。 4、 将挑选出的质粒选择合适的酶切位点 进行限制酶酶切分析。琼脂糖凝胶电泳一、 试剂及材料: 1、 琼脂糖 2、 电泳缓冲液:50×TAE ; 1×TAE。表格 31、琼脂糖凝胶电泳缓冲液配方50×TAE Tris EDTA-Na2?2H2O 冰乙酸 3、 10 mg/ml溴化乙锭 4、 上样缓冲液:0.25溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油 4℃保存。 5、 稳压电泳仪和水平凝胶电泳槽；橡皮膏。 6、 透射紫外线灯；照相机；微波炉。 二、 操作程序: 1、 根据所需浓度(1%)称取琼脂糖(1g)，加入100 ml 1×TAE。 2、 微波炉(3分钟)或沸水浴使琼脂糖溶解，用三角瓶，1/3液体。 3、 溶液冷至60℃，加入溴化乙锭，终浓度0.5ug/ml。(100ml加5ul 10mg/ml的EB)。带手套操作。 4、 用橡皮膏将电泳凝胶床的两端封好，成一胶模。 5、 将琼脂糖倒入模具，凝胶厚度3~5 mm，插上梳子。 6、 室温30~45 min后，凝胶完全凝固，小心取出梳子和橡皮膏，将凝胶放入电泳槽。 可同时制作几块凝胶，固化后用保鲜膜包住，4℃保存，在数日内可用。 7、 加入电泳缓冲液(1×TAE),液面高出胶面1~2 mm。 8、 DNA样品中加入1/6的上样缓冲液(20ul:3ul)，混匀。 9、 用移液器将DNA样品(15ul)加入样品孔。 10、 盖上电泳槽通电，正极为红色，样品向正极泳动。60v(60~100v)恒压电泳。 1000ml 242g 37.2 57.111、 根据指示剂迁移的位置，判断是否终止电泳。 12、 切断电源，取出凝胶，在透射紫外线灯下观察。 13、 用加红光滤色镜的相机，光圈放到最大，曝光15-30s，拍照留底。从凝胶中回收DNA一、 试剂及材料 1、树脂(Wizardò PCR Preps DNA Purification Resin) 2、 一次性注射器 3、 柱Minicolumn 4、 80%异丙醇 5、 去离子双蒸水 二、操作程序 3. 切胶:将切下的胶条放入1.5ml离心管中。 4. 加入0.5~1ml树脂(Wizardò PCR Preps DNA Purification Resin)。 5. 65℃，5min，至胶熔化。 6. 用一次性注射器抽取混合液，过柱，弃滤液。 7. 用80%异丙醇2ml，洗柱，弃滤液。 8. 将柱装在一旧离心管上，离心，12000r/min，2min，弃残留液。 9. 向柱中加50~100ul去离子双蒸水或TE，放置1min。 10. 将柱装在新的无菌的Ep管上，离心，12000r/min，2min，收集DNA。PCR技术一、 PCR的原理: 在模板DNA、 引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下， DNA聚合酶依赖的 酶促合成反应，扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。 整个扩增过程分三步:①变性:加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链； ②退火:突然降温后 模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合；③延伸:在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，从引物的3'端 开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。 上述三步为一个循环，从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的链又 可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后，DNA可扩增106~109倍。 二、 基本操作: ㈠试剂: 1、 引物:用去离子水配成10~50umol/L，扩增时用量为1~2ul/100ul反应体系。 2、 Taq聚合酶:5U/ul，扩增时用量为2~5U/100ul。 3、 PCR反应缓冲液:随Taq酶提供，10×浓度如下: KCl 250~500mM Tris-Cl(pH 8.4)100~500mM MgCl2 15~20mM Tween-20 0.5% BSA(组份Ⅴ) 1mg/L 4、 dNTPs:中性混合液(2M，10×):dATP、dGTP、dCTP、dTTP钠盐各10mg，加去离子水2ml溶解， 用0.1M的NaOH调pH7.0~7.5，分装后-20℃保存(浓度为5mM)。 5、 模板: ㈡操作方法: 1、 在0.5mlEp管中加入下列各成分:表格 32、PCR体系二种引物(各) 10×PCR反应缓冲液 dNTPs(2mM混合母液) 模板 去离子水 混匀后，稍离心。 20ul 加石蜡油 2、94℃(95~97℃)变性7min(5~10min)，冰浴冷却 1ul 加Taq酶(1U/ul) 混匀，稍离心。 3、开始循环: 变性 94℃(94~97℃) 1'(30~60s) 退火 56℃(25~65℃) 1'(60~90s) 延伸 72℃(70~74℃) 1'30&(60~120s) 重复25~35个循环。 4、末次循环后，在延伸温度72℃再延时7min。 5、反应结束后，稍离心，吸取少量(5ul)分析，余置4℃保存备用。 20ul体系 1ul 2ul 1.5ul 1ul 12.5ul 100ul体系 2ul 10ul 10ul 5ul 68ul 70ul 3ulDrosha小干扰RNA载体的构建1 退火形成Drosha抑制片断 ① 将引物DRsi1-1和DRsi1-2均稀释成0.5?g/?l；100?l体系：DRsi1-1和DRsi1-2各2?l，10?l 10×PCR缓 冲液，无菌水补齐至100?l。煮沸4min-5min，沸水中自然降温。 ② 加2?l 10mg/ml糖原，1/10体积3mol/L NaAC，2.5倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置1h以上。 ③ 13000rpm×15min，4℃离心，弃上清；加1ml 75%乙醇洗涤。 ④ 13000 rpm×10min，4℃离心，弃上清；自然晾干，加50?l无菌水溶解，-20℃冻存。 2 DNA限制性内切酶双酶切pSilencer U6 2.1载体 20?l体系：1?g pSilencer U6 2.1质粒，Hind Ⅲ和BamH Ⅰ各1?l，10×K缓冲液，无菌水补齐至20?l。 1%琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收酶切后载体。 3 连接 20?l体系：5?l经双酶切的pSilencer U6 2.1质粒，12?l Drosha抑制片段，2?l 10×T4连接酶缓冲液， 1?l DNA T4连接酶。16℃，14-16h。 4 转化，鉴定。 Drosha表达下调的稳定细胞株的筛选 1，Drosha稳定细胞株的筛选 ①人肝癌HepG2细胞用含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100?g/ml 的DMEM培养基培养。37℃， CO2条件下培养及传代。 5% 取生长状态良好的细胞， 胰酶消化， 细胞计数后， 均匀铺于24孔板中(2×104/ 孔)。次日起，按照一定的浓度梯度每三天向细胞中加潮霉素B(100?g/ml，200?g/ml，300?g/ml，400?g/ml， 500?g/ml，600?g/ml，800?g/ml，1000?g/ml，1500?g/ml，2000?g/ml)。两周后观察细胞存活情况从而确定 筛选稳定细胞株的潮霉素B浓度。 ② 取生长状态良好的细胞，胰酶消化，细胞计数后，均匀铺于35mm2塑料瓶中(8×105/孔)。次日，细 胞达到60%-80%融合时进行转染。 质粒的用量为4?g/瓶， 脂质体Lipofectamine 2000用量为9?l/瓶。 以pSilencer U6 2.1为阳性对照。转染24h后，胰酶消化，取1/3数目的细胞均匀铺于35mm2塑料平皿中。 ③ 转染48h后，每三天向平皿中加潮霉素B(浓度为450?g/ml)。 ④ 两周后观察单克隆细胞生长情况；当单克隆长到合适大小后转至96孔板中继续培养。 ⑤ 当96孔中克隆长满后转至24孔板中继续培养；待之长满后，转至6孔板中继续培养。 ⑥ 6孔板中细胞一部分用于继续培养并冻存，另一部分用于检测Drosha的表达情况。 2，Drosha表达下调的稳定细胞株的鉴定 ① 细胞总RNA的提取：按Trizol试剂说明书进行稳定株细胞总RNA的提取。 ② 半定量RT-PCR：按ImProm-ⅡTM反转录酶说明书进行。 ③ 实时定量PCR检测Drosha的表达：按照TakaRa SYBR premix Ex Taq说明书进行，50?l体系：25?l 2×SYBR premix Ex Taq，DroshaF和DroshaR(10?M)各1?l，2?l cDNA模板，无菌水补齐至50?l；反应参数如 下： 先95℃ 15 min, 再执行(95℃ 10s, 60℃ 30s, 72℃ 30s)40个循环， 最后溶解曲线分析一个循环(95℃ 1min, 55℃ 1min, 95℃ 1min)；同时扩增G3PDH为内参对照。 ④ 实时定量PCR检测miRNA的表达： 小RNA分子Poly(A)加尾： 取10?g RNA， 分别加入10?l 5×Poly(A) 聚合酶缓冲液、MnCl2 5?l、10mmol/L ATP 5?l、Poly(A)聚合酶1?l，无菌水补充至50?l。37℃反应30min， 加50?l DEPC 水，用等体积水饱和酚/氯仿及等体积氯仿分别抽提一次。上清移至另一微量离心管中，加入 10?l 3mol/L NaAc(pH5.2)和250?l无水乙醇，-20℃放置60min。12000rpm离心15min，75%乙醇漂洗沉淀，室 温干燥，加20?l DEPC水溶解。取2μl上述RNA溶液，加入1μl RT引物，65℃变性5min后冰上冷却；按ImPromⅡTM反转录酶说明书进行反转录反应。制备的cDNA于-20℃冻存备用。实时定量PCR检测miRNA的表达： 按照TakaRa SYBR premix Ex Taq说明书进行， 反应条件如下： 先95℃ 15 min, 再执行(94℃ 15s, 56℃ 30s, 68 ℃ 30s)40个循环，最后溶解曲线分析一个循环(95℃ 1min, 55℃ 1min, 95℃ 30s)；同时扩增U6 snRNA为内 参对照。细胞基因组DNA的提取收集106个细胞，加入400μl裂解液（10mmol/L Tris pH8.0, 0.1mol/L EDTA, 0.5% SDS） ，充分混匀后加 入蛋白酶K至终浓度0.1μg/μl， 37℃保温过夜。 次日， 等体积Tris饱和酚抽提2次后， 等体积氯仿／异戊醇 （24： 1）抽提1次。上清加入等体积的异丙醇，于-20℃沉淀过夜。次日，12000g离心10min，70％乙醇洗沉淀，离 心后室温干燥。最后，加入50μl含20μg/ml RNase的TE溶解沉淀，定量，并于-20℃保存备用。cRNA探针标记试剂: b. Roche/BM 公 司 产 品 Dig BA Labeling Kit(SP6/T7), Cat #1175025, labeling/transcription reactions。常规下，1ug DNA 10ug NA。 c. DEPC水，0.2M EDTA, 4M LiCl, 预冷的100%乙醇，预冷的70%乙醇 流程: a. 在置于冰上、无RNase的灭菌1.5ml Epp管中建立以下反应体系: Kit for 2×10表格 2、RNA探针标记体系模板DNA 1ugNTP labeling mixture(vial 7) transcription buffer(vial 8) RNase inhibitor(vial 10) DEPC水 SP6 or T7 RNA polymerase(vial 11 or 12) 总体积 c. d. e. f. g. h. i. j.2ul 2ul 1ul 调整体积 2ul 20ul18ul用枪头混匀，离心。37℃孵育2h； (可选)加入2ul无RNase的DNase(vial 9)，37℃孵育15min以去除模板DNA； 加入2ul EDTA终止反应； 向管中加入2.5ul 4M LiCl(1/10体积)和75ul(2.5倍体积)预冷的无水乙醇； 离心，12,000rpm×15 min(如果标记理想，可见沉淀片); 加入预冷的70%乙醇100ul洗济沉淀片15min，可更换一次，弃上