基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱 - 实验交流 - 生物秀
标题: 基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱
摘要: [基因带六个his标签，蛋白纯化时为何挂不上镍柱] 克隆了一个肠激酶的基因，设计引物时加了６个his，蛋白可溶性还行，可是做蛋白纯化时，用的镍柱，但是目标蛋白就是挂不上柱，磷酸盐和tris-Hcl 的缓冲液都试过了，没法，请教各位高手，怎么办啊？ 关键词:[缓冲液 空间结构 柱子 复性 蛋白变性]……
克隆了一个肠激酶的基因，设计引物时加了６个his，蛋白可溶性还行，可是做蛋白纯化时，用的镍柱，但是目标蛋白就是挂不上柱，磷酸盐和tris-Hcl 的缓冲液都试过了，没法，请教各位高手，怎么办啊？回复不懂啊。。。。
等待高人回答回复可能情况：
1，ORF不完整或者不是预期的ORF，His没表达出来
2，His被空间结构所掩盖，建议变性后再过柱回复同一ls，可能跟蛋白空间结构有关，变性后再上柱。
另外，是否是柱子本身的问题，也可以重新脱镍挂镍后再看看~~回复1.标蛋白是否表达HIS 标签..
2. 柱子是新的还是以前用过的,旧的应该很好的处理一下,
3.缓冲液很重要,蛋白与柱子结合是靠离子螯合,反应环境很重要
好好做好每一步!回复首先感谢各位的解答啊！不过问题还是没有解决。那个重组基因是测过序的，没有内含子的，也做过SDS－凝胶蛋白电泳，蛋白表达正确且可溶性也好，就是做纯化，挂不上柱，我想得到的是纯化后有活性的蛋白，因为后续还要做其它的用。所以不能变性后挂柱啊！各位还有什么高招啊？小妹先谢过了。回复用其它纯化手段回复有可能是你的his 标签掉了，另一个就是你的镍柱没有还原彻底。回复曾经傻乎乎的用TE缓冲液溶蛋白去挂镍柱，结果……后来想想真好笑：）回复这样呀，不变形的话也可以尝试做个活性蛋白电泳，然后切胶回收吧!回复我建议你做一个正对照，用一个完好的his标签的蛋白去做纯化，在通过你的结果去分析问题到底出在那个地方！回复用western验证一下是否有该标签，看一下缓冲液里有没有能够和ni结合的物质回复1.首选确定你的His融合是可溶性表达；
2.确定你的Ni株没有问题，注意Ni有没有掉下来，建议对Ni柱进行清洗，然后再生。
3.改变Binding Buffer的pH（在不影响活性情况下，建议提高pH可增加Ni的亲和力）、盐浓度、添加Triton、NP40等；
4.细胞裂解尤其是超声波不能太剧烈，我们发现His与Ni不结合往往是超声太剧烈导致蛋白变性l；回复再次感谢各位的建议，我准备做个蛋白变性，再纯化，后复性，:)回复这个情况我也遇到过
我最后是将组氨酸标签融合到了基因序列的后面回复1，western检验一下你的蛋白是不是有his标签
2，你的镍柱是不是有问题，是否需要再生了再用
3，你设计引物加入his标签的时候是否有误，6个his密码子不能是一样的，如果his标签设计在c端的话很可能这些his没有表达出来。回复1，ORF不完整或者不是预期的ORF，His没表达出来
2，His被空间结构所掩盖，建议变性后再过柱回复你的蛋白表达是在包涵体中表达吗？是的话那就必须先变性，如果以后要用有活性的蛋白，那你就得进行复性后再用。另外可能是你的镍没有挂好。
只是个小建议，说的不对还请指教。回复binding buffer不要含咪唑，直接上样，再用低浓度的洗脱试下！保证成功！回复加大盐浓度。
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电话：021-抗前列腺癌双特异性抗体的构建、表达、纯化及其活性鉴定的实验研究--《第四军医大学》2013年硕士论文
抗前列腺癌双特异性抗体的构建、表达、纯化及其活性鉴定的实验研究
【摘要】：目的：
1.构建双特异性双链抗体BsDb（抗-PSMA×抗-FITC）的基因序列及质粒载体pET-28(a)-BsDb，将其转入大肠杆菌中构成BsDb的原核表达体系，以IPTG诱导表达并纯化。
2.培养人前列腺癌细胞系，检测PSMA表达情况及鉴定双特异性抗体BsDb的活性。
1.通过对本课题组先期测得的抗-PSMA单链抗体（ScFv-P）与抗-FITC单链抗体（ScFv-F）基因序列的分析，获得两条ScFv各自的重链和轻链序列。通过VectorNTI9软件将ScFv-P的重链（PVH）和轻链（PVL）与ScFv-F的轻重链（FVL和FVH）交叉连接，构成PVH-Linker-FVL和PVL-Linker-FVH两条杂合链，将其连接后以全基因合成的方法合成BsDb的基因片段。在其C端设计一个XbaⅠ酶切位点，N端设计一个XhoⅠ酶切位点。将BsDb基因片段用XbaⅠ与XhoⅠ两个限制性内切酶进行双酶切并与经过同样双酶切的pET-28(a)质粒载体用T4连接酶连接成pET-28(a)-BsDb，将其转入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导其表达，对表达产物用镍亲和层析柱进行纯化。
2.培养人前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3和人胰腺癌细胞系PANC-1，利用Westernblot检测PSMA在体外培养的前列腺癌细胞系中的表达。
3.通过免疫细胞化学、Western blot等检测BsDb与PSMA结合的特异性，通过ELISA检测其与FITC结合的特异性。
1.成功构建BsDb基因序列，且将其成功导入pET-28(a)质粒中形成pET-28(a)-BsDb，将该质粒导入大肠杆菌BL21实现原核表达。通过对诱导剂IPTG浓度与温度、摇床转数、诱导时间等条件的选择，最终摸索出实现BsDb可溶性表达的条件，即IPTG浓度选择0.50‰，诱导温度、摇床转数和诱导时间分别为16℃，150rpm/min，12h。纯化时目的蛋白通过镍亲和层析柱，其His标签与镍亲和层析柱结合，但同时亦有杂蛋白与镍亲和层析柱非特异性结合，选择不同浓度梯度的咪唑液洗涤，低浓度的咪唑可以将非特异性结合的蛋白洗脱，而高浓度的咪唑才能将与镍亲和层析柱特异结合的目的蛋白洗脱，这时收集则为纯化的BsDb，最终的咪唑浓度梯度为平衡液选10mmol/L，然后分别用40、120、500mmol/L浓度咪唑洗脱，500mmol/L的咪唑洗脱的为目的蛋白。纯化后的BsDb通过BCA蛋白定量法测得其浓度为181μg/ml。
2.人前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3以及人胰腺癌细胞系PANC-1均为单层贴壁生长；Western blot证实PSMA在LNCaP细胞中高表达，而在其余两种细胞系中不表达。
3.通过免疫细胞化学和Western blot检测发现BsDb与PSMA有良好的结合特性，通过ELISA检测发现其与FITC能特异性结合。
1.前列腺癌LNCaP细胞系高表达PSMA。
2.通过基因工程技术制备的双特异性双链抗体BsDb（抗-PSMA×抗-FITC）能在原核表达体系实现可溶性表达并被纯化；其具有两个特异性结合靶点：特异性结合PSMA的靶点和特异性结合FITC的靶点。为下一步体内试验奠定了坚实的基础。
【关键词】：
【学位授予单位】：第四军医大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R730.3;R737.25【目录】：
缩略语表4-6中文摘要6-9Abstract9-12前言12-13文献回顾13-27实验一 抗前列腺癌双特异性抗体 BsDb 的构建、表达及纯化27-42 1 材料27-30 2 方法30-35 3 结果35-39 4 讨论39-42实验二 前列腺癌细胞系培养与 PSMA 表达及 BsDb 活性鉴定42-54 1 材料42-45 2 方法45-49 3 结果49-52 4 讨论52-54小结54-55参考文献55-65个人简历和研究成果65-66致谢66
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