用于微生物学实验室日常诊断中迅速检测和鉴别临床样品中普通细菌病原体和抗生素抗 ...的制作方法
专利名称用于微生物学实验室日常诊断中迅速检测和鉴别临床样品中普通细菌病原体和抗生素抗 ...的制作方法
背景技术细菌的经典鉴别细菌的经典鉴别是通过使用生物化学方法(如API20ETM系统)测定它们利用不同的底物作为碳源和氮源的能力来鉴别的。革兰氏阴性杆菌的敏感性试验发展到微稀释试验。尽管API和微稀释系统费用可行，但由于必须进行连续两个过夜培养以从样品中分离和鉴别细菌，获得初步的结果至少需要两天。也开发了一些使用先进和昂贵仪器的更快速的检测方法。例如，最快的鉴别系统(autoSCAN-Walk-AwayTM系统)在2小时内可从分离的细菌菌落中鉴别出革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，而且仅仅7小时内就能鉴别出对抗生素的敏感方式。然而，这个系统的出错幅度使人无法接受，尤其是鉴别非肠杆菌科的细菌物种时(York等，1992，临床微生物杂志，0)。但是，即使这种最快速的方法也需要首先把细菌分离为纯培养物，需纯培养物时这一过程要花费至少18小时，需混合培养物时这一过程要花费至少2至3天。
尿样在常规诊断微生物实验室接受的用于细菌鉴别的大部分样品(40-50％)是尿样(Pezzlo，1988，临床微生物学回顾，)。尿道感染(UTI)是极其常见的，感染的妇女多达20％，在住院患者中发病率很高，死亡率还在增长(Johnson和Stamm，1989，国际医学年评，)。UTI通常与细菌病原学有关，需要抗微生物治疗。到目前为止，革兰氏阴性大肠杆菌是最流行的泌尿病原体，占UTI的50至60％(Pezzlo，1988，op.cit.)。从最近在“Hospitalier de 1′Universit éLaval中心(CHUL)”观察到的尿样中分离的细菌病原体的分布情况在表1和表2中给出。
尿样中常见病原体的鉴别对尿样中病原体的研究在常规微生物实验室占有很大优势，以致开发了许多实验方法。金标准仍然是经典的半定量平板培养法，其中在平板上刻划一个量好直径的尿环，并培养18-24小时。对菌落计数以确定每升尿样中菌落形成单位(CFU)的总数。细菌UTI通常与尿液中≥107CFU/L细菌计数有关。然而，尿液中小于107CFU/L的感染也是可能的，尤其是在高发病率的病人或导管插入过的(catheterized)病人中(Stark和Maki，1984，英国国家医学杂志，)。值得注意的是，所测的尿样中接近80％被认为是阴性的(＜107CFU/L，表3)。
准确而快速的尿液细菌病原体的筛选方法使阴性结果的快速鉴别以及患者的更有效地临床检查患者成为可能。最近，比较了几种快速鉴别方法(UriscreenTM，UTIscreenTM，Flash TrackTMDNA探针以及其它方法)与较慢的基于细菌病原体培养的标准生化方法。这些快速鉴定尽管更快，但灵敏度和特异性较低，而且有许多假阴性和假阳性结果(Koening等，1992，临床微生物学杂志，，Pezzlo等，1992，临床微生物学杂志，)。
通过培养发现为阳性的尿样中使用标准的生化测定进一步确定其特征，这些生化测定可以鉴别细菌病原体，尿样也用来试验对抗生素的敏感性。
任何临床样品与这里用作例子的尿样一样，我们的探针与扩增引物也可应用于任何其它临床样品。根据快速和准确的原则，本发明所用的基于DNA的测定与当前用于常规诊断的标准方法相比是更好的。当尿样阴性的百分率很高时，在其它临床样品中超过95％的培养物是阴性的(表4)。这些数据进一步证明了通用探针在筛选阴性临床样品上的用途。也可以使用非人类的其它有机体的临床样品(如其它灵长类，哺乳动物，家畜或家禽)。
开发快速的基于DNA之诊断试验的方向快速诊断试验应当对感染控制形成有效的影响。对临床样品中的病原体和抗生素抗性基因的鉴别，DNA探针和DNA扩增技术与常规方法相比有几个优点。这种方法不需要继代培养，因此有机体可以直接在临床样品中鉴别，从而减少了与病原体的分离相关的花费和时间。基于DNA的技术被证明对于在临床微生物实验室的特别应用是极有用的。例如，基于使用杂交探针或DNA扩增直接检测临床样品中的病原体的致命有机体检测的试剂盒是市售的产品(Persing等，1993，诊断分子微生物学原理和应用，美国微生物学协会，华盛顿特区)。
本发明对在医院临床微生物实验室和常规诊断的私人诊所里常用的培养鉴别法是有优势的替代方法。除了更快之外，基于DNA的诊断试验比目前用于诊断的标准生化测定更准确，因为细菌基因型(如DNA水平)比细菌表型(如生化特性)更稳定。本发明的创造性是把对12种常见的细菌物种的细菌病原体的特异性基因组DNA片段(大小至少为100个碱基对)从基因组文库或数据库中选择出来；从物种特异性DNA片段的序列(这些序列通过与基因组文库或所选的数据库序列杂交鉴别)中衍生的扩增引物或寡核苷酸探针(二者长度均小于100个核苷酸)用作开发诊断试验的基础。用作检测常见的和临床重要的细菌抗性基因的寡核苷酸引物和探针也包括在本发明的范围内。例如，附录I和附录II列出了适当的寡核苷酸探针和PCR引物，这些探针和引物均从选自基因组文库或数据库序列的物种特异性DNA片段中衍生出来。本领域的技术人员清楚附录I和附录II中未列出的适于上述细菌物种的特异性检测的寡核苷酸序列可以从物种特异性片段或所选的数据库序列中衍生。例如，寡核苷酸可以比我们所选择的更短或更长，也可以在任何其它鉴别的物种特异性序列或选择的数据库序列中选择。另外，可以设计寡核苷酸以用于非PCR的扩增方法。因而，本发明的核心是得自细菌基因组DNA文库的物种特异性基因组DNA片段的鉴别和得自数据库序列的基因组DNA片段的选择，其中数据库序列作为物种特异性的(specific)和普遍性的(ubiquitous)寡核苷酸的来源。尽管从物种特异性片段的序列或选择的数据库序列中选择适合诊断用途的寡核苷酸需要更多的努力，但对本领域技术人员来说，从我们的片段或选择的数据库序列中衍生出不同于我们作为例子选择和试验的适当寡核苷酸片段(附录I和附录II的片段)是极可能的。
另有人开发了基于DNA的用于检测和鉴别一些我们已经鉴别了物种特异性序列的细菌病原体(PCT专利申请序列号WO9303186)的试验方法。然而他们的策略基于高度保守的16S rRNA基因的扩增以及与内生的物种特异性寡核苷酸杂交。本发明的方法更简单快速，因为它可以通过使用从物种特异性细菌基因组DNA片段中衍生的寡核苷酸使物种特异性目标直接扩增。
因为临床样品阴性的比例较高，为确定临床样品感染与否，从高度保守的16S rRNA或23S rRNA基因中选择寡核苷酸引物和探针以检测所有在临床样品中可能碰到的细菌病原体。这种策略使得可以快速筛选出供生物学试验的大量阴性临床样品。
我们也开发了其它基于DNA的试验方法，与细菌鉴别同时完成以通过定向常见的和临床有关的细菌抗性基因快速确定推定的细菌对抗生素的敏感性。尽管可以得到来自选择的抗生素抗性基因的序列并用于开发检测这些抗生素抗性基因的基于DNA的试验方法(Ehrlich和Greenberg，1994.基于PCR的传染病诊断，Blackwell科技出版社，马萨诸塞州波士顿，Persing等，1993，诊断分子微生物学原理和应用，美国微生物协会，华盛顿特区)，但我们的方法是革新性的，它代表了在通常的基于细菌培养的“金标准”诊断方法上较大的提高，因为这种方法能够快速鉴别特异性细菌病原体的存在以及在一个小时内评价这种病原体对直接得自临床样品的抗生素的敏感性。
我们相信我们开发的快速而简单的诊断试验(不是基于细菌培养)将逐步取代目前在医院临床微生物学实验室和私人诊所中使用的缓慢的常规细菌鉴别方法。就我们看来，这些对严重的和普通的细菌病原体和抗生素抗性的快速的基于DNA的诊断将(I)通过最优处理挽救生命，(II)通过减少广谱抗生素的使用以减少抗生素抗性和(III)通过预防或缩短治疗期以全面减少健康花费。
发明概述本发明提供了得自基因组DNA片段的序列(大小至少为100个碱基对，所有的均在序列表中描述)，这些基因组DNA片段是通过杂交从基因组文库或数据库选择的，它们对检测临床样品中常见的细菌病原体(如大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单孢菌，奇异变性菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，流感嗜血菌，粘膜炎莫拉氏菌)是特异性的。这些细菌物种与大约90％的尿道感染和其它严重的感染(包括败血症，脑膜炎，肺炎，腹腔内感染，皮肤感染以及许多其它严重的呼吸道感染)有关。总的说来，上述细菌物种可以占到常规微生物实验室分离到的细菌病原体的80％。
用于杂交(探针)或DNA扩增(引物)的合成寡核苷酸是从上述的物种的特异性DNA片段(大小范围为0.25到5.0千碱基对(kbp))中或从选择的数据库序列(GenBank和EMBL)中衍生得到的。从所选的数据库序列中衍生的一些寡核苷酸探针和扩增引物所适用的细菌物种为大肠杆菌，粪肠球菌，酿脓链球菌和铜绿假单孢菌。本领域的技术人员明白，在本发明中重要的创新是鉴别通过杂交从细菌基因组文库选择的或从数据库序列选择的物种特异性DNA片段。从这些适于诊断用途的片段中选择寡核苷酸也是创新性的。不同于在实践中试验的特异的和普遍的寡核苷酸被作为本发明的实施方案。
用于检测临床样品中病原体的杂交(用片段或寡核苷酸探针)或DNA扩增方案的开发使极快速的细菌鉴别成为可能。这将极大地减少当前在临床实验室病原体鉴别所需的时间。因为这些技术可以用于直接从临床样品中检测和鉴别细菌以释放细菌DNA时对任何生物样品需要最少的前处理。此外，由于100％的特异性，探针和扩增引物使直接来自临床样品或分离物落中的细菌物种鉴别成为可能。DNA扩增测定还有比杂交测定更快速，更灵敏的优势，因为DNA扩增测定使得得自细菌基因组和目标片段的快速和指数级的体外复制。选自细菌中高度保守的16S rRNA或23S rRNA基因的通用性的(universal)探针和扩增引物(其使得可以检测任何病原体)将用于诊断实验室接受的大量阴性临床样品中的筛选方法中。与编码抗生素抗性的确定特征的细菌基因互补的寡核苷酸探针或引物在鉴别常见的和临床重要的抗性基因上的用途也包括在本发明的范围内。发明的详尽描述物种特异性DNA探针的开发开发了用于下列细菌物种的DNA片段探针大肠杆菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单孢菌，奇异变性菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌，流感嗜血菌，粘膜炎莫拉氏菌(唯独对粪肠球菌和酿脓链球菌的寡核苷酸序列从选择的数据库序列中衍生而来)。这些物种特异性片段是通过与不同种类的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种(表5)杂交从细菌基因组文库选择出的。
使用标准方法分离每一细菌物种的染色体DNA(从中寻找探针)。DNA用高频切割限制性内切酶(如Sau3AI)消化，连接进细菌质粒载体pGEM3Zf(Promega)，该载体通过适当的限制性内切核酸酶消化线性化。重组质粒用于转化感受态大肠杆菌菌株DH5α，由此产生基因组文库。转化的细菌细胞的质粒内含物用标准方法分析。靶细菌的大小在0.25至5.0千碱基对(kbp)之间的DNA片段通过用各种限制性内切核酸酶消化重组质粒从载体切割下来。插入序列通过琼脂糖凝胶电泳从载体上分离下来并在低熔点的琼脂糖凝胶中纯化。然后每个纯化的细菌基因组DNA片段可用作特异性试验的探针。
对于每个给定的物种，未知编码潜力(coding potential)的凝胶纯化的限制性片段用放射性核苷酸α-32P(dATP)标记，α-32P(dATP)通过随机引物标记反应掺入DNA片段。非放射性修饰的核苷酸也可以通过这种方法掺入DNA以用于标记。
然后，每个DNA片段探针(如细菌基因组文库的长度至少为100bp的片断，此片段从随机选自基因组文库的克隆中切割下来)通过和各种细菌物种的DNA(表5)杂交试验其特异性。使标记的双链DNA探针热变性以产生标记的单链DNA。这种单链DNA能和任何固定在固体支持物上的或溶液中的单链靶DNA杂交。靶DNA由一系列在临床样品中发现的细菌物种(表5)的细胞全部DNA组成。每个靶DNA都可从细菌细胞中释放，用常规方法变性，然后不可逆地固定到固体支持物上(如尼龙或硝酸纤维素膜)或进入溶液中。然后固定的单链靶DNA和单链探针杂交。预杂交、杂交、和杂交后的条件如下(i)预杂交；在65℃下的1M NaCl+10％葡聚糖硫酸酯+1％SDS(十二烷基磺酸钠)+100μg/ml的鲑精DNA中15分钟，(II)杂交；在65℃下包含标记探针的新鲜预杂交溶液中过夜。(III)杂交后；用含有1％SDS的3×SSC(1×SSC为0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)洗涤两次；再用含有0.1％SDS的0.1×SSC洗涤两次；所有这些洗涤均在65℃下进行，每次15分钟。洗涤后的滤膜的放射自显影使得可以检测选择性杂交的探针。探针和特异性靶DNA的杂交表明这两种DNA的核苷酸序列之间高度的相似性。
选自各种细菌基因组文库的物种特异性DNA片段(大小在0.25至5.0kbp之间)是为10种常见的病原体(表6)分离的，如上所述，分离基于和各种细菌染色体DNA杂交。所有试验的细菌物种(表5中列出的66个物种)可能是从临床样品中分离出来的与普通感染或潜在污染有关的病原体。DNA片段探针只有在只和从中分离出它的病原体单独杂交时，才可认为是特异性的。随后通过和兴趣物种(表6)的大约10到80个临床分离物中的细菌DNA杂交，试验发现为特异性的DNA片段探针的普遍性(ubiquity)(即识别靶物种的大多数分离物的普遍性探针)。使DNA变性，固定在尼龙膜上，如上所述进行杂交。
物种特异性片段探针的测序分离的物种特异性DNA片段的全部或部分核苷酸序列使用双脱氧末端测序法来测定，这种方法使用测序酶(USB生物化学)或T7 DNA聚合酶(Pharmacia)进行。在序列表中列出了这些核苷酸序列。另外，选自数据库(GenBank和EMBL)的序列用作诊断大肠杆菌，粪肠球菌，酿脓链球菌和铜绿假单孢菌的寡核苷酸的来源。这种策略需要试验从选自数据库的各种基因组DNA片段(大小大于100bp)中衍生的一系列合适的核苷酸引物或探针以检测它们在如下所述的PCR和杂交试验中的特异性和普遍性。注意到按照有效的序列信息在序列物种特异性潜能的基础上选择数据库序列是很重要的。本发明仅仅包括那些能衍生出物种特异性寡核苷酸的数据库序列。
从选自基因组文库或数据库序列的物种特异性片段中衍生的寡核苷酸探针和扩增引物用自动化DNA合成仪(Millipore)合成。在合成之前，使用标准程序由计算机分析(例如，遗传计算机小组(GCG)和OligoTM4.0(国家生物科学))通过聚合酶链反应(PCR)评价所有寡核苷酸(用于杂交的探针和用于DNA扩增的引物)对杂交和DNA扩增的适合性。PCR引物对的潜在的适合性也可在合成之前通过证实不存在不需要的特征(如一种核苷酸的长链，在3′末端有高比例的G或C残基以及3′末端T残基)来评价(Persing等，1993，诊断分子微生物学原理和应用，美国微生物协会，华盛顿特区)。
用寡核苷酸探针杂交在杂交实验中，寡核苷酸(大小不到100个核苷酸)用于细菌检测较之DNA片段探针有一些优点，如易于大量制备、各批结果一致和化学稳定。简言之，供杂交的寡核苷酸是通过T4多核苷酸激酶(Pharmacia)用放射性核苷酸32γP(ATP)5′端标记的。没有掺入的放射性核苷酸经把标记的单链寡核苷酸通过Sephadex葡聚糖凝胶G50柱除去。另外，寡核苷酸通过在其3′端酶促标记或在合成时直接掺入5′端用生物素标记或用洋地黄毒苷标记。本领域的技术人员清楚非上述三种标记方法之标记方法可以使用。
如上所述，对DNA探针片段，使靶DNA变性、固定在固体支持物上并进行杂交。预杂交和杂交的条件均如前所述。杂交后洗涤条件如下在包含1％SDS的3×SSC中洗两次，在包含1％SDS的2×SSC中洗两次，再在包含1％SDS的1×SSC中洗两次(所有这些洗涤均在65℃下进行15分钟)，最后在25℃下包含1％SDS的0.1×SSC中洗涤15分钟。对于放射性标记的探针，杂交体通过如前所述的放射自显影检测。对于非放射性标记的检测可用比色法或化学发光法进行。
寡核苷酸探针可从双螺旋DNA链的任何一条链衍生。探针由碱基A，G，C，T或类似物组成。探针可以具有任何适合的的长度，可在选自基因组文库或数据库序列的物种特异性基因组DNA片段内任何位置选择。
DNA扩增通过广泛应用的PCR(聚合酶链反应)方法进行DNA扩增，引物对可从测序的物种特异性DNA片段中或数据库序列中衍生。另外，引物对也可以是寡核苷酸探针的缩短的形式。合成之前，通过使用程序OligoTM4.0(国家生物科学)分析潜在的引物对以检验它们是否可能用于PCR扩增。
在通过PCR的DNA扩增期间，分别结合到得自细菌基因组的变性双链靶DNA的每一条链上的两条寡核苷酸用于在体外指数倍地扩增靶DNA。这种扩增通过连续的热循环使DNA变性、引物退火、以及合成新靶DNA进行(Persing等，1993，诊断分子微生物学原理和应用，美国微生物学协会，华盛顿特区)。简言之，PCR方案如下把临床样品或细菌菌落直接加到50μl的PCR反应混合物中(其中包含50mM KCl，pH为8.3的10mM Tris-Hcl，2.5mM MgCl2，两种引物各0.4μM，四种dNTPs各200μM以及1.25单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer))。PCR反应使用Perkin Elmer480TM热循环器进行热循环(95℃下3分钟，95℃下1秒与55℃下1秒，循环30次)，随后用标准的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳分析。显然可以使用其它检测特异性扩增产物的方法(更快速或在常规诊断中更实用)。这些方法可以基于扩增后荧光检测(如得自Perkin Elmer的TaqmanTM系统或Biotronics的AmplisensorTM系统)或用结合到特异性扩增产物内部序列上的寡核苷酸的液相杂交。这些新探针可由我们的物种特异性片段探针产生。事实上，基于荧光的检测方法用于常规诊断是特别有前途的，这种方法快速、定量并可自动化。
为确保PCR效率，甘油、二甲基亚砜(DMSO)或其它有关的溶剂可用来增加PCR的灵敏度并能克服与有高GC含量或稳定的二级结构的靶DNA的扩增有关的问题。甘油和DMSO的浓度范围分别为5-15％(V/V)和3-10％(V\V)，对于PCR反应混合物，扩增引物和MgCl2的浓度分别是0.1-1.0μM和1.5-3.5mM。使用外引物和嵌套引物(即嵌套PCR)或一个以上的引物对(即多重PCR)标准PCR的修饰方案也可以使用(Persing等，1993，诊断分子微生物学原理和应用，美国微生物学协会，华盛顿特区)。关于PCR方案与扩增子检测方法的更多细节参见实施例7和实施例8。
DNA扩增领域的技术人员知道存在其它的快速扩增方法(如连接酶链反应(LCR)，基于转录的扩增系统(TAS)，自动维持序列扩增(3SR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，链置换扩增(SDA)以及分支DNA(bDNA)(Persing等，1993，诊断分子微生物学原理和应用，美国微生物学协会，华盛顿特区)。本发明的范围不限于PCR扩增的使用，而且包括任何快速核酸扩增方法或其它任何可用于增加试验的快速性和敏感性的方法。包括在此申请内的任何通过非PCR的方法适合于核酸扩增的寡核苷酸与从物种特异性片断和抗生素抗性基因序列衍生的寡核苷酸也包括在本发明的范围内。
寡核苷酸探针和引物的特异性和普遍性试验从已测序的物种特异性片段或数据库序列中衍生的寡核苷酸探针的特异性通过与前面所述的与表5中列出的细菌物种中的DNA杂交来测试。接着被发现是特异性的寡核苷酸通过与靶物种(如有关片断探针的所描述的)的大约80个分离物的细菌DNA杂交试验其普遍性。当探针和至少80％分离物的DNA特异地杂交时，可以认为这些探针是普遍性的(ubiquitous)。在表6中概括了用寡核苷酸探针试验特异性和普遍性的结果。扩增引物对的特异性和普遍性可直接从同样细菌菌株的培养物(见实施例7)试验。为测定特异性和普遍性，直接在靶物种的大约80个分离物的细菌菌落中进行PCR试验。结果概述于表7。对研究的12个细菌物种中每个物种的所有特异性和普遍性寡核苷酸探针和扩增引物分别列于附录I和附录II。已测序的DNA片段可以出现趋异(divergence)，到目前为止这些序列或其一部分序列趋异并不影响探针或扩增引物的特异性，因此变异的细菌DNA也属于本发明的范围。
通用的细菌检测在常规微生物实验室中用于细菌鉴别的临床样品阴性的百分率较高(表4)。如在两年的一个时期内，“Hospitalier 1′Universit Laval中心(CHUL)”实验室接受的大约80％的尿样品是阴性的(即＜107CFU/l)(表3)。检测临床样品时先用通用性探针和通用性扩增引物检测细菌的存在，然后进行特异性鉴定，筛选出大量的阴性样品。这种方法是有用的，因为它能节约开支并可迅速确定对患者的临床治疗。因而可从在数据库(附录III和IV)得到的细菌16S或23S核糖体RNA基因序列高度保守的部分合成几条寡核苷酸和扩增引物。在杂交试验中，一组7个寡核苷酸(附录I，表6)强烈地和表5中列出的所有细菌物种的DNA杂交。因而这种用放射性核苷酸或任何其它修饰核苷酸标记的通用性探针对检测尿样品中的细菌是很有用的，其敏感性范围≥107CFU/l。这些探针也适用于其它临床样品中的细菌检测。
衍生自高度保守的核糖体RNA基因序列的扩增引物也可作为通用的直接从临床样品(附录IV，表7)中检测细菌的替代策略。为提高试验的灵敏性和快速性，开发了DNA扩增策略。因为这种扩增试验特异地从临床样品中碰到的23种不同细菌物种中扩增DNA，因而是普遍的。
非核糖体RNA基因的高度保守的细菌基因也是通用的直接从临床样品中检测细菌的较好候选者。这些基因可能和一些细菌存活的必要过程有关(如蛋白质合成，DNA合成，细胞分裂或DNA修复)因而在进化过程中是很稳定的。我们正在研究候选基因以开发新的通用的直接检测来自临床样品中的细菌的快速试验方法。
抗生素抗性基因抗微生物抗性使治疗复杂化并常导致治疗失败，而且，使用抗生素过多不可避免地导致细菌抗性的出现。我们的目标是在一个小时内提供临床诊断(clinicians)，即开最优治疗的药方所需的信息。除了进行通用的细菌检测的基于DNA的试验快速鉴别阴性临床样品和阳性样品中特异性病原体的存在之外，临床诊断也要及时了解细菌病原体抵抗抗生素处理的能力。我们认为迅速评价细菌对抗微生物剂抗性最有效的策略是直接从临床样品中检测最常见的和最重要的抗生素抗性基因(即以DNA为基础的检测抗生素抗性基因的试验)。因为最重要的和最常见的细菌抗生素抗性基因的序列可从数据库得到，我们的策略是用一部分或全部基因的序列设计特异的寡核苷酸，这种寡核苷酸可用作开发基于DNA的快速试验的基础。以细菌的临床相关性(即高发病率和重要性)为基础选择的细菌抗生素抗性基因的序列在序列表中给出。表8概述了一些选择的抗生素抗性基因的特征。
实施例下面的实施例旨在说明本发明的各种方法和化合物。实施例1片断的分离和克隆。使用标准方法制备大肠杆菌株ATCC25922，肺炎克雷伯氏菌CK2，铜绿假单孢菌株ATCC27853，奇异变形菌株ATCC35657，肺炎链球菌株ATCC27336，金黄色葡萄球菌株ATCC25923，表皮葡萄球菌株ATCC12228，腐生葡萄球菌株ATCC15305，流感嗜血菌的相关菌株Rd和粘膜炎莫拉氏菌ATCC53879的基因组DNA。可以理解细菌基因组DNA也可以从不是上述菌株的菌株中分离(对粪肠球菌和酿脓链球菌，寡核苷酸源于数据库)。每一种DNA用经常切割DNA的限制性酶(如Sau3AI)消化。形成的DNA片段连接进质粒载体(pGEM3ZF)以产生重组质粒，并转化进感受态大肠杆菌细胞(DH5α)。可以理解载体与相应感受态细胞不应限制在本文作为例子的具体的载体和细胞。获得重组质粒和转化细胞的目的是提供易于生产的用作探针的DNA片段的来源。因此，到目前为止，因为插入片断对于靶细菌DNA是特异性和选择性的，任何重组质粒和相应的转化宿主细胞也在本发明的范围内。转化细菌细胞的质粒含量用标准方法分析，大小在0.25至5.0kbp之间的靶细菌DNA片断用各种限制性内切核酸酶消化重组质粒而从载体上切割下来。用琼脂糖凝胶电泳把插入序列从载体中分离出来，再在低熔点的琼脂糖凝胶中纯化。然后用每个纯化片断进行特异性试验。
DNA片段探针的标记使用的标记是α32P(dATP)，这种放射性核苷酸能通过酶促反应掺入双链DNA分子。兴趣片段首先通过在95℃下加热5分钟变性，然后使随机引物的混合物退火形成片断链。这些引物一旦退火，就提供一个DNA合成的起始位点。DNA聚合酶(通常是Klenow片段)与四种核苷酸一起提供，其中一种是放射性的。当反应终止后，新的DNA分子的混合物再一次变性，产生放射性的单链DNA分子(即探针)。如前所述，其它修饰的核苷酸也可用来标记探针。
DNA片断探针的特异性和普遍性的试验。对10种(表6)常见细菌病原体的大小在0.25至5.0kbp之间的物种特异性DNA片断基于和各种细菌染色体DNA杂交进行分离。使用斑点印迹器把表5中列出的每种细菌菌株细胞的完整DNA样品转移到尼龙膜上，洗涤并使其变性，然后不可逆地固定。杂交条件如前所述。当DNA片断探针只和从中分离出它的病原体杂交时才可认为是特异性的。只能和靶细菌物种特异性杂交(即特异性的)的标记DNA片断可通过和如上所述的兴趣物种的大约10-80个菌落的DNA杂交来试验其普遍性。预杂交、杂交、杂交后洗涤的条件如上所述。放射自显影(或对非放射性标记适用的其他检测方法)之后，每个探针的特异性都可以确定。发现具有特异性(即仅能和从中分离出它的细菌物种DNA杂交)和普遍性(即和靶物种的大多数分离物杂交)的每个探针保留下来以进一步实验。
实施例2除菌株试验是通过菌落杂交之外和实施例1相同。细菌菌株接种到置于营养琼脂中的尼龙膜上，膜在37℃下培养两小时，然后根据标准方法进行细菌裂解和DNA变性。DNA杂交如前所述进行。
实施例3除直接从临床样品中检测细菌外和实施例1相同。把任何生物学样品直接装载进斑点印迹器上，细胞原位裂解以进行细菌检测。使血样肝素化，以避免干扰方便地装载到斑点印迹器上的凝结。
实施例4测定DNA片段的核苷酸序列。每个发现是特异的和普遍的片断(实施例1)的全部或部分的核苷酸序列使用双脱氧末端测序法测定(Sanger等，1977，美国科学院学报，7)。这些DNA序列在序列表中给出，从这些核苷酸序列中或者是从选择的数据库序列中选择寡苷酸探针和扩增引物，然后用亚磷酰胺化学法在Biosearch自动合成仪(MilliporeTM)上合成。
寡核苷酸标记。如前所述，每个寡核苷酸通过T4多核苷酸激酶(Pharmacia)用γ32P-ATP在5′-端标记。这种标记也可以是非放射性的。
寡核苷酸探针的特异性试验。通过和前面所述的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种的DNA杂交试验所有的标记寡核苷酸探针的特异性。物种特异性探针是那些仅能和从中分离这种探针的细菌物种DNA杂交的探针。对所发现的特异性寡核苷酸探针进行下述的普遍性试验。
寡核苷酸探针的普遍性试验。在用靶物种的大约80个种菌株进行的普遍性试验中使用特异性寡核苷酸探针。如上述的特异性试验所述，分离物的染色体DNA转移到尼龙膜上，并用标记的寡核苷酸探针杂交。为每个靶物种构建的约由80个分离物的小组包含参比ATCC菌株以及许多从各种来源获得的临床分离物。普遍性探针是那些能和靶物种临床分离物组的至少80％DNA杂交的探针。特异的和普遍的寡核苷酸探针的例子列于附录I。
实施例5除了一组特异的寡核苷酸探针用于细菌鉴别之外与实施例4相同。这组特异的寡核苷酸可以(I)提高灵敏度并确保100％普遍性或(II)同时鉴别一种以上细菌物种。细菌鉴别可从分离物落或直接从临床样品中进行。
实施例6PCR扩增。使用PCR技术可提高试验的灵敏性和快速性。使用的PCR引物通常是先前开发的用于杂交测定的很多(extensive)组寡核苷酸的较短衍生物(表6)。此组引物在直接从细菌菌落或细菌悬浮液(见实施例7)中进行的PCR测定中被测试以确定它们的特异性和普遍性(表7)。特异的和普遍的PCR引物对的例子列于附录II。
扩增引物的特异性和普遍性试验试验所有选择的PCR引物对针对用于试验寡核苷酸探针的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌组的特异性(表5)。然后试验发现对每一物种为特异性的引物对的普遍性以确保每组引物能从一组靶细菌的大约80个分离物中扩增至少80％的DNA。为每一物种构建的分离物包括参比ATCC菌株以及代表每一物种临床多样性的各种临床分离物。
应该采取标准的预防方法以避免假阳性PCR结果。灭活PCR扩增产物的方法(如通过尿嘧啶-N-糖基化酶)可用于控制PCR遗留。
实施例7从细菌菌落或悬浮液中直接扩增。PCR测定可直接从细菌菌落或细菌悬浮液中进行，把细菌悬浮液调整到标准的McFarland 0.5(对应于1.5×108个细菌/ml)。在从菌落直接扩增的情况下，使用塑料棒把一部分菌落直接转移到50μl的PCR反应混合物中(含有50mM KCl，pH为8.3的10mM Tris，2.5mM MgCl2，两种引物各0.4μM，四种dNTP各200μM以及1.25个单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer))。对于细菌悬浮液，把4μl的细胞悬浮液加入46μl同样的PCR反应混合物中。两种策略都把50μl的矿物油加到反应混合物上，PCR扩增按下列步骤进行第一步在95℃下变性3分钟，然后在95℃下在Perkin Elmer 480TM热循环器中进行30个循环(每个循环由95℃下1秒的变性步骤和在55℃下1秒的退火步骤组成)。然后用标准的琼脂糖凝胶(2％)电泳分析PCR扩增产物。该产物可在254毫微米的紫外线下含有2.5μg/ml溴化乙锭的琼脂糖凝胶中显示出来。整个PCR测定可在大约一小时内全部完成。
另外，从细菌培养物的扩增除了使用“热起始”方案外均按如上所述的方法进行。在此种情况下，包含靶DNA，引物和dNTPs初始反应混合物加热到85℃，然后再加入PCR反应混合物的其它组分。所有试剂的最终浓度如上所述。随后，按上述的方法进行PCR反应热循环并分析。
实施例8直接从临床样品中扩增。对于从尿样中的扩增，按前述方法把4μl的未稀释的或稀释的(1∶10)尿液直接加到46μl的上述PCR反应混合物中进行扩增。
为增强细菌细胞裂解并消除临床样品中PCR的抑制作用，通常把样品稀释在含有去垢剂的裂解缓冲液中。随后，裂解物直接加到PCR反应混合物中。在DNA扩增之前，用热循环器或微波炉对裂解液进行热处理以提高细胞裂解的效率。
我们的策略是开发快速简便的方案以消除临床样品和裂解的细菌细胞中的PCR抑制效应以便直接从各种生物样品中进行DNA扩增。PCR有与粗提DNA制品相容的优势。例如，血液，脑脊液和血清在简短的热处理后可在PCR测定中直接使用。我们打算用这样快速而简便的策略开发从各种临床样品中快速扩增DNA的方法。
实施例9抗生素抗性基因的检测。常见的和临床有关的特异性抗生素抗性基因的存在用前面部分所述的PCR扩增或杂交方案鉴别。用作基于DNA的试验之基础的特异性寡核苷酸选自抗生素抗性基因序列。这些试验可直接从临床样品或细菌菌落中进行，而且应补充特异性细菌鉴别的诊断试验。
实施例10除了测定是通过多重PCR(即在一个PCR反应中使用几对引物)之外与实施例7和实施例8相同，使用多重PCR可以(I)达到对特异性靶病原体100％的普遍性，(II)同时检测几种细菌病原体。
例如，检测大肠杆菌需要三对PCR引物以确保100％的普遍性。因此，开发了使用三个引物对的多重PCR测定(用“热起始”方案(实施例7))。这种策略也可用于其它需要一种以上引物对以达到100％普遍性的细菌病原体。
多重PCR试验也用于(I)同时检测几个细菌物种或者(II)同时鉴别细菌病原体并直接从临床样品或细菌菌落中检测特异性抗生素抗性基因。
对于这些应用，扩增子检测方法应适合区分产生的各种扩增子。可以使用标准的琼脂糖凝胶电泳，因为它可基于扩增子的大小区分它们。适用于这种用途的另一种有用的策略是使用在不同波长处激发的各种荧光染料检测，每种荧光染料可与连接到荧光淬灭物上的特异性寡核苷酸相偶联，这种荧光淬灭物在扩增过程中降解释放荧光(如TaqManTM，PerkinElmer)。
实施例11扩增产物的检测。本领域技术人员清楚非标准的琼脂糖凝胶电泳(实施例7)的替代性方法可以用于扩增产物的揭示。这类方法可基于扩增之后的荧光检测(如AmplisensorTM，Biotronics，TaqManTM)或标记物如生物素(SHARP SignalTM系统，Digene Diagnostics)的检测。这些方法是定量的并易于自动化。一个扩增引物或内部寡核苷酸探针(其对从物种特异性片段探针衍生的扩增子是特异的)与荧光染料或任何其它标记偶联。基于荧光检测的方法特别适用于诊断试验，因为在可以得到发射不同波长的荧光染料(Perkin Elmer)时这种方法是快速而灵活的。
实施例12物种特异的、普遍性和抗生素抗性基因的扩增引物可用于其它快速的扩增方法(如连接酶链反应(LCR)，基于转录的扩增系统(TAS)，自动维持序列扩增(3SR)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，链置换扩增(SDA)，和分支DNA(bDNA)或其它任何用于增加试验灵敏度的方法。扩增可从分离的细菌菌落或者直接从临床样品中进行。因而本发明的范围并不限于PCR的使用，而且包括任何特异性地鉴别细菌DNA并可增加试验的快速性和灵敏性的方案的使用。
试验试剂盒包括对每种细菌特异的探针组以及一组通用探针。试剂盒是以试验组分的形式提供，由一组非放射性标记物标记的通用探针和用于临床样品中兴趣细菌检测的标记的特异性探针组成。试剂盒也包括进行预杂交，杂交，洗涤步骤和杂交体检测必需的检试验剂。最后，试剂盒还包括用于检测已知的抗生素抗性基因(或它们的衍生物)的试验组分。当然，试剂盒也包括用作每次杂交试验阴性和阳性对照的标准样品。
包括在试剂盒中的组分适用于每种样品类型，并适于检测在该样品中常见的病原体。试剂盒还包括用于细菌通用性检测的试剂。基于感染位点，开发了用于病原体特异性检测的下列试剂盒-通用的检测多数临床样品中的细菌病原体的试剂盒，其中包含对细菌基因组高度保守区特异的探针组。
-用于检测从尿样中取得的细菌病原体的试剂盒，其中包含八种特异性试验组分(用于试验大肠杆菌，粪肠球菌，肺炎克雷伯氏菌，奇异变性菌，铜绿假单孢菌，腐生葡萄球菌，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)。
用于检测呼吸病原体的试剂盒，其中包含七种特异性试验组分(用于检测肺炎链球菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单孢菌，酿脓链球菌和金黄色葡萄球菌的探针组)。
-用于检测从血液中取得的病原体的试剂盒，其中包含十一种特异性试验组分(用于检验肺炎链球菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血菌，奇异变性菌，肺炎克雷伯氏菌，铜绿假单孢菌，大肠杆菌，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，酿脓链球菌以及表皮葡萄球菌的探针组)。
-用于检测引起脑脊膜炎的病原体的试剂盒，其中包含四种特异性试验组分(用于试验流感嗜血菌，肺炎链球菌，大肠杆菌和铜绿假单孢菌的探针组)。
-用于检测临床重要的抗生素抗性基因的试剂盒，其中包含用于特异地检测以下19种和细菌抗性相关的基因中至少一种的探针组blatemblarob，blashv，aadB，aacC1，aacC2，aacC3，aacA4，mecA，vanA，vanH，vanX，satA，aacA-aphD，vat，vga，msrA，sul和int。
-开发了其它适用于检测来自皮肤，腹部创伤的病原体的试剂盒或任何其它临床有关的试剂盒。
实施例14除了试验试剂盒含有进行DNA扩增试验的所有试剂和对照外和实施例13相同。诊断试剂盒适用于直接从临床样品或细菌菌落中通过PCR(或其它扩增方法)进行的扩增。在试剂盒中还包括通用的细菌检测、细菌鉴别和抗生素抗性基因检测所需的组分。
扩增测定可在试管中或微滴定板上进行。对微滴定板上的测定，将孔用特异性扩增引物和对照DNA分子涂覆，扩增产物的检测可以自动化。为从临床样品中直接进行检测，在试剂盒中包含用于通用细菌检测的试剂和扩增引物。直接从菌落中试验的试剂盒或直接从临床样品中试验的试剂盒中还包括细菌鉴别和抗生素抗性基因检测所需的组分。
如实施例13所述的基于杂交的诊断试剂盒一样，该试剂盒适用于每一类型的样品。
实施例15可以理解，本发明所述的用于细菌检测和鉴别的探针和扩增引物的使用不限于临床微生物学的应用。事实上，我们感到其它部门也能从这些新技术中受益。例如，这些试验可在工业上用于食物、水、药物产品或其它需要微生物控制的产品的质量控制。这些试验也可用于检测和鉴定来自非人类的其它有机体(其它灵长类，哺乳类，农场动物，牲畜)的生物样品中的细菌。这些诊断工具对包括临床试验和流行病学研究在内的研究是十分有用的。
表1. 年期间Hospitalier de 1′UniversitéLaval中心(CHUL)阳性尿样(≥107CFU/L)中尿分离物的分布。
分离物百分率(％)有机体92年11月 93年4月
94年1月n＝267an＝265n＝238n＝281大肠杆菌53.2
54.1粪肠球菌13.8
11.4肺炎克雷伯氏杆菌6.4
5.3表皮葡萄球菌7.1
6.4奇异变形菌
2.5铜绿假单胞菌3.7
2.9腐生葡萄球菌3.0
1.4其它b10.2
16.0an＝指出的月份内分离物的总数b参见表2
表2. 年期间Hospitalier de 1′UniversitéLaval中心(CHUL)阳性尿样(≥107CFU/L)中稀有的a尿分离物的分布。
分离物百分率(％)有机体a92年11月
93年7月 94年1月金黄色葡萄球菌0.41.1
1.3 1.4葡萄球菌属的几个种2.24.9
1.7 6.0微球菌属的几个种
0.4 0.7粪肠球菌
1.3 1.4柠檬酸杆菌属的几个种
0.4 0.7肠杆菌属的几个种
1.3 1.4产酸克雷伯氏菌1.11.5
2.5 1.8沙雷氏杆菌属的几个种
0.5 0.0变形菌属的几个种
0.0 1.1摩根氏菌属和普罗威登斯菌属0.40.8
0.4 0.0蜂房哈夫尼菌
0.0 0.0NFBb0.00.4
1.3 1.1假丝酵母属的几个种0.81.9
0.7 0.4a稀有尿分离物是那些在表1中鉴别为“其它”的分离物bNFB非发酵杆菌(如寡养单胞菌属和不动杆菌属)表3. 年期间Hospitalier de 1′Universite Laval中心(CHUL)测试的阳性(细菌计数≥107CFU/L)和阴性(细菌计数＜107CFU/L)尿样品的分布。
分离物数(％)样品
92年11月93年4月93年7月94年1月接收的)
)阳性的267(19.3)
281(20.9)阴性的) )
)a在标准的诊断方法的基础上，指示尿道感染的尿样中细菌病原体的最小数量通常为107CFU/L。
表4.CHUL的微生物实验室中检测的阳性和阴性临床样品的分布。临床样品a所测样品阴性样品阳性样品的数目
百分率％百分率％尿
19.4 80.6血培养物/骨髓
93.1唾液1,266
68.4 31.6表面脓液1,136
72.3 27.7脑脊髓液553 1.0
99.0滑液-关节液 523 2.7
97.3支气管/气管/扁桃体/喉咙 502 56.6 43.4深部脓液473 56.8 43.2耳朵289 47.1 52.9胸膜和心包液132 1.0
99.0腹膜液
101 28.6 71.4a从1994年2月到1995年1月检测的样品表5.
用于检测DNA片段探针、寡核苷酸探针和PCR引物之特异性的细菌物种(66)细菌物种检测的
检测的菌株数目菌株数目革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌奇异变形菌 5副流感嗜血菌
2肺炎克雷伯氏菌 5百日咳博德氏菌2铜绿假单胞菌
5副泡膜溶血性嗜血菌2大肠杆菌
5溶血性嗜血菌
2粘膜炎莫拉氏菌 5埃及嗜血菌1普通变形菌 2产吲哆萨顿氏菌1摩氏摩根氏菌
2亚特兰大莫拉氏菌
1阴沟肠杆菌 2豚鼠奈瑟氏球菌1斯氏普罗威登斯菌
1微黄奈瑟氏球菌1普罗威登斯菌属物种 1尿道莫拉氏菌
2宋内氏志贺氏菌1雷氏普罗威斯登菌
2弗氏志贺氏菌
1粘液奈瑟氏球菌 1产酸克雷伯氏菌属
2产碱普罗威登斯菌
1粘质沙雷氏菌
2拉氏普罗威斯登菌
1鼠伤寒沙门氏菌1洋葱伯克霍尔德氏菌 2小肠结肠炎耶尔森氏菌
1产气肠杆菌 2醋酸钙不动杆菌1嗜麦芽糖寡养单胞菌 2鲁沃夫氏不动杆菌
1荧光假单胞菌
1蜂房哈夫尼菌
2食酸丛毛单胞菌 2差异柠檬酸杆菌1恶臭假单胞菌
2弗劳地氏柠檬酸杆菌1流感嗜血菌 5沙门氏菌属物种1
用于检测DNA片段探针、寡核苷酸探针和PCR引物之特异性的细菌物种(66)细菌物种
检测的菌株数目革兰氏阳性菌肺炎链球菌 7唾液链球菌 2绿色链球菌 2酿脓链球菌 2金黄色葡萄球菌 2表皮葡萄球菌
2腐生葡萄球菌
5微球菌属物种
2棒状杆菌属物种 2链球菌属B组2模仿葡萄球菌
2路邓葡萄球菌
2头状葡萄球菌
2溶血葡萄球菌
2人葡萄球菌 2粪肠球菌
1沃氏葡萄球菌
1耐久肠球菌 1牛链球菌
1Diphteroids1嗜乳酸芽孢杆菌 1
表6.物种特异性DNA片段和用于杂交的寡核苷酸有机体a片段探针的数目b寡核苷酸探针的数目测试的 特异性的 普遍性的c合成的
特异性的 普遍性的大肠杆菌d-
9f大肠杆菌 14
--肺炎克雷伯氏菌d-
-- 15 11肺炎克雷伯氏菌
8奇异变形菌d-
32奇异变形菌
33e15 87铜绿假单胞菌d-
9铜绿假单胞菌 6
00腐生葡萄球菌 7
44 20 97流感嗜血菌d-
-- 16 22流感嗜血菌
11 20 11肺炎链球菌
11肺炎链球菌d19
11粘膜炎莫拉氏菌2
88表皮葡萄球菌 62
--金黄色葡萄球菌
--通用探针d-
-7ga没有试验粪肠球菌和酿脓链球菌的DNA片段或寡核苷酸。bDNA片段的大小在0.25到5.0之间。c当至少80％的目标物种分离物(大约80个分离菌)被每一个特异性探针识别时，这个探针就被认为是普遍性的。两个或更多个探针结合可识别100％的分离物。d这些序列选自数据库。e用大约10个目标物种的分离物试验普遍性。f大多数探针不能区分大肠杆菌和志贺氏菌属的几个种。g用检测所有表5中列出的66个细菌物种的一组7个探针试验普遍性。
尿液、唾液、血液、脑脊髓和其它样品中常见的细菌病原体的PCR扩增。有机体 引物对a扩增子大 普遍性bDNA扩增自小#(SEQ ID NO)
菌落c样品d大肠杆菌
1e(55+56) 10775/80
+ +2e(46+47) 29777/80
+ +3 42+43)
+ +4(131+132) 13473/80
+ +1+3+4 - 80/80
+ +粪肠球菌
1e(38+39) 20071/80
+ +2e(40+41) 12179/80
+ +肺炎克雷伯氏菌 1(67+68)
+ +2(61+62)
+ +3h(135+136)148
N.T.i4(137+138) 11669/80
1+2+3- 80/80
N.T.奇异变形菌 1(74+75)
2(133+134) 12380/80
表7(续)尿液、唾液、血液、脑脊髓和其它样品中常见的细菌病原体的PCR扩增有机体引物对a扩增子大小
普遍性bDNA扩增自#(SEQ ID NO)
(bp) 菌落c样品d铜绿假单胞菌1e(83+84)139 79/80 +N.T.
2e(85+86)223 80/80 +N.T.腐生葡萄球菌1(98+99)
126 79/80 ++2
190 80/80 +N.T.粘膜炎莫拉氏菌
157 79/80 +N.T.
118 80/80 +N.T.
137 80/80 +N.T.流感嗜血菌
1e(154+155)
217 80/80 +N.T.肺炎链球菌
1e(156+157)
134 80/80 +N.T.
2e(158+159)
197 74/80 +N.T.
175 67/80 +N.T.
表7(续)尿液、唾液、血液、脑脊髓和其它样品中常见的细菌病原体的PCR扩增有机体 引物对a扩增子大小
普遍性bDNA扩增自#(SEQ ID NO) (bp) 菌落c样品d表皮葡萄球菌1(147+148)175
2(145+146)125
+N.T.金黄色葡萄球菌
1(152+153)108
2(149+150)151
3(149+151)176
+N.T.酿脓链球菌f1e(141+142)213
2e(143+144)157
+N.T.通用的
1e(126-127)241
194/195g++a在PCR测定中所有的引物对都是特异性的，因为用得自66个不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(表5)而非兴趣细菌的DNA没有观察到扩增。b普遍性通常用兴趣物种的80个菌株测试。所有保留的引物对扩增至少90％的分离物。当使用引物的组合时，达到了100％的普遍性。c对于所有的引物对和多重组合，直接从细菌克隆进行的PCR扩增是100％物种特异性的。dpCR测定直接在尿样中进行。e得自数据库序列的引物对。没有“e”的引物对得自我们的物种特异性片段。f对于酿脓链球菌，引物对#1对链球菌属A组(GAS)是特异性的。引物对#2对GAS-产生外毒素A基因(SpeA)是特异性的。g用临床样品中常见的病原体的23个物种代表中的195个分离物试验普遍性。h进行优化以消除用一些细菌物种而不是靶物种观察到的非特异性扩增。iN.T.未试验。
表8.选择的用于诊断的抗生素抗性基因基因
细菌aSEQ ID NO(blatem)TEM-1
肠杆菌科，假单孢菌科，161嗜血菌属，巴斯德氏菌属(blarob)ROB-1
克雷伯氏菌属
162(blashv)SHV-1
和其它肠杆菌科物种163aadB，aacC1，aacC2， 氨基糖苷类 肠杆菌科，假单胞菌科
164，165，166aacC3，aacA4
167，168mecA β-内酰胺
葡萄球菌属169vanH，vanA，vanx 万古霉素
大肠杆菌属170staA 大环内酯
大肠杆菌属173aacA-aphvD
氨基糖苷类 大肠杆菌属，葡萄球菌属174vat
葡萄球菌属175vga
葡萄球菌属176msrA 红霉素 葡萄球菌属177Int和Sul β-内酰胺类，三甲氯苄二肠杆菌科
171，172保守序列 氨嘧啶，氨基苷类，消毒 假单胞菌科剂，氯霉素乙酰转移酶a特异的抗生素抗性基因有较高的出现率。并不排除在其它细菌中存在。
附录I.用于杂交的特异性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO核苷酸序列起始DNA片段SEQ ID 核苷酸位置NO细菌物种 大肠杆菌44
5′-CAC CCG CTT GCG TGG CAA GCT GCC C
5a213-23745
5′-CGT TTG TGG ATT CCA GTT CCA TCC G
5a489-51348
5′-TGA AGC ACT GGC CGA AAT GCT GCG T
6a759-78349
5′-GAT GTA CAG GAT TCG TTG AAG GCT T
6a898-92250
5′-TAG CGA AGG CGT AGC AGA AAC TAA C
5′-GCA ACC CGA ACT CAA CGC CGG ATT T
5′-ATA CAC AAG GGT CGC ATC TGC GGC C
5′-TGC GTA TGC ATT GCA GAC CTT GTG GC 7a111-13654
5′-GCT TTC ACT GGA TAT CGC GCT TGG G
7a373-397细菌物种 奇异变形菌70b5′-TGG TTC ACT GAC TTT GCG ATG TTT C
5′-TCG AGG ATG GCA TGC ACT AGA AAA T
53-7772b5′-CGC TGA TTA GGT TTC GCT AAA ATC TTA TTA 12
5′-TTG ATC CTC ATT TTA TTA ATC ACA TGA CCA 12
174-203a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链(opposite DNAstrand)
附录I.用于杂交的特异性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO核苷酸序列
起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO细菌物种 奇异变形菌76
5′-CCG CCT TTA GCA TTA ATT GGT GTT TAT AGT
5′-CCT ATT GCA GAT ACC TTA AAT GTC TTG GGC b5′-TTG AGT GAT GAT TTC ACT GAC TCC C
5′-GTC AGA CAG TGA TGC TGA CGA CAC A
5′-TGG TTG TCA TGC TGT TTG TGT GAA AAT 15a细菌物种 肺炎克雷伯氏菌57
5′-GTG GTG TCG TTC AGC GCT TTC AC
5′-GCG ATA TTC ACA CCC TAC GCA GCC A
9 161-18559b5′-GTC GAA AAT GCC GGA AGA GGT ATA CG
9 203-22860b5′-ACT GAG CTG CAG ACC GGT AAA ACT CA
9 233-25863b5′-CGT GAT GGA TAT TCT TAA CGA AGG GC
b5′-ACC AAA CTG TTG AGC CGC CTG GA
5′-GTG ATC GCC CCT CAT CTG CTA CT
5′-CGC CCT TCG TTA AGA ATA TCC ATC AC
5′-CAG GAA GAT GCT GCA CCG GTT GTT G
11a296-320a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录I.用于杂交的特异性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO核苷酸序列
起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO细菌物种铜绿假单胞菌87
19a705-72992
19a668-69293
19a505-52994
20a细菌物种肺炎链球菌120 5′-TCT
31aa得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录I.用于杂交的特异性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO
核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID核苷酸位置NO细菌物种
腐生葡萄球菌965′-CGT TTT TAC CCT TAC CTT TTC GTA CTA CC
45-7397b5′-TCA GGC AGA GGT AGT ACG AAA AGG TAA GGG
5′-CAC CAA GTT TGA CAC GTG AAG ATT CAT
89-′-ATG AGT GAA GCG GAG TCA GAT TAT GTG CAG
105-134102
5′-CGC TCA TTA CGT ACA GTG ACA ATC G24
5′-CTG GTT AGC TTG ACT CTT AAC AAT CTT GTC
61-90104b5′-GAC GCG ATT GTC ACT GTA CGT AAT GAG CGA
19-48细菌物种
粘膜炎莫拉氏菌108
5′-GCC CCA AAA CAA TGA AAC ATA TGG T28
5′-CTG CAG ATT TTG GAA TCA TAT CGC C28
126-150110
5′-TGG TTT GAC CAG TAT TTA ACG CCA T28
165-189111
5′-CAA CGG CAC CTG ATG TAC CTT GTA C28
232-256114
5′-TTA CAA CCT GCA CCA CAA GTC ATC A29
5′-GTA CAA ACA AGC CGT CAG CGA CTT A29
139-163116
5′-CAA TCT GCG TGT GTG CGT TCA CT
178-200117
5′-GCT ACT TTG TCA GCT TTA GCC ATT CA
287-312a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录I.用于杂交的特异性和普遍性的寡核苷酸SEQ ID NO
核苷酸序列
起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO细菌物种流感嗜血菌105b5′-GCG TCA GAA AAA GTA GGC GAA ATG AAA G25
138-′-AGC GGC TCT ATC TTG TAA TGA CAC A26a770-′-GAA ACG TGA ACT CCC CTC TAT ATA A27a通用探针c122b5′-ATC CCA CCT TAG GCG GCT GGC TCC A- -123 5′-ACG TCA AGT CAT CAT GGC CCT TAC GAG TAG G- -124b5′-GTG TGA CGG GCG GTG TGT ACA AGG C- -125b5′-GAG TTG CAG ACT CCA ATC CGG ACT ACG
- -128b5′-CCC TAT ACA TCA CCT TGC GGT TTA GCA GAG AG
- -129 5′-GGG GGG ACC ATC CTC CAA GGC TAA ATA C- -130b5′-CGT CCA CTT TCG TGT TTG CAG AGT GCT GTG TT
- -a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链c通用探针源于不包括在序列表中的16S或23S核糖体RNA基因序列附录II.用于DNA扩增的特异性和普遍性的引物SEQ ID NO核苷酸序列起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO细菌物种
大肠杆菌425′-GCT TTC CAG CGT CAT ATT G
4 177-19543b5′-GAT CTC GAC AAA ATG GTG A
4 260-278465′-TCA CCC GCT TGC GTG GC 5a212-22847b5′-GGA ACT GGA ATC CAC AAA C
5a490-508555′-GCA ACC CGA ACT CAA CGC C
5′-GCA GAT GCG ACC CTT GTG T
5′-CAG GAG TAC GGT GAT TTT TA 3 60-79132b5′-ATT TCT GGT TTG GTC ATA CA 3 174-193细菌物种
粪肠球菌385′-GCA ATA CAG GGA AAA ATG TC 1a69-8839b5′-CTT CAT CAA ACA ATT AAC TC 1a249-268405′-GAA CAG AAG AAG CCA AAA AA 2a569-58841b5′-GCA ATC CCA AAT AAT ACG GT 2a670-689a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录II.用于DNA扩增的特异性和普遍性的引物SEQ ID NO核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID核苷酸位置NO细菌物种
肺炎克雷伯氏菌61 5′-GAC
9 37-5562b5′-CGT
9 161-17967 5′-TCG
8 40-57136b5′-AGC
8 170-1871375′-ATT
CA 9 166-′-ATC
GT 9 262-281细菌物种
奇异变形菌74 5′-GAA
TC 5′-CGG
TC b5′-CTA
TT a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录II.用于DNA扩增的特异性和普遍性的引物SEQ ID NO
核苷酸序列
起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO细菌物种腐生葡萄球菌98
5′-CGT TTT TAC CCT TAC CTT TTC GTA CT21
45-7099b5′-ATC GAT CAT CAC ATT CCA TTT GTT TTT A 21
143-′-CTG GTT AGC TTG ACT CTT AAC AAT C 24
61-85140b5′-TCT TAA CGA TAG AAT GGA GCA ACT G 24
226-250细菌物种铜绿假单胞菌83
5′-CGA GCG GGT GGT GTT CAT C 16a554-57284b5′-CAA GTC GTC GTC GGA GGG A 16a674-69285
5′-TCG CTG TTC ATC AAG ACC C 17ab5′-CCG AGA ACC AGA CTT CAT C 17a细菌物种粘膜炎莫拉氏菌112 5′-GGC ACC TGA TGT ACC TTG
235-′-AAC AGC TCA CAC GCA TT28
375-′-TGT TTT GAG CTT TTT ATT TTT TGA
41-64119b5′-CGC TGA CGG CTT GTT TGT ACC A 29
137-′-GCT CAA ATC AGG GTC AGC
22-39119b5′-CGC TGA CGG CTT GTT TGT ACC A 29
137-158a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录II.用于DNA扩增的特异性和普遍性的引物SEQ ID NO
核苷酸序列
起始DNA片段SEQ ID核苷酸位置NO细菌物种表皮葡萄球菌145
5′-ATC AAA AAG TTG GCG AAC CTT TTC A
b5′-CAA AAG AGC GTG GAG AAA AGT ATC A
121-145147
5′-TCT CTT TTA ATT TCA TCT TCA ATT CCA TAG 36
448-′-AAA CAC AAT TAC AGT CTG GTT ATC CAT ATC 36
593-622细菌物种金黄色葡萄球菌149b5′-CTT CAT TTT ACG GTG ACT TCT TAG AAG ATT 37
409-438150
5′-TCA ACT GTA GCT TCT TTA TCC ATA CGT TGA 37
288-′-CTT CAT TTT ACG GTG ACT TCT TAG AAG ATT 37
409-438151
5′-ATA TTT TAG CTT TTC AGT TTC TAT ATC AAC 37
263-292152
5′-AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG 37
5-34153b5′-CGT AAT GAG ATT TCA GTA GAT AAT ACA ACA a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录II.用于DNA扩增的特异性和普遍性的引物SEQ ID NO 核苷酸序列 起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO细菌物种
流感嗜血菌154 5′-TTT AAC GAT CCT TTT ACT CCT TTT G 27ab5′-ACT GCT GTT GTA AAG AGG TTA AAA T 27a细菌物种
肺炎链球菌78
5′-AGT AAA ATG AAA TAA GAA CAG GAC AG34
164-18979b5′-AAA ACA GGA TAG GAG AAC GGG AAA A 34
314-′-ATT TGG TGA CGG GTG ACT TT31ab5′-GCT GAG GAT TTG TTC TTC TT31a 5′-GAG CGG TTT CTA TGA TTG TA35ab5′-ATC TTT CCT TTC TTG TTC TT35a细菌物种 化脓链球菌141 5′-TGA AAA TTC TTG TAA CAG GC32a286-′-GGC CAC CAG CTT GCC CAA TA32a479-′-ATA TTT TCT TTA TGA GGG TG33a966- ′-ATC CTT AAA TAA AGT TGC CA33aa得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链附录II.用于DNA扩增的特异性和普遍性的引物SEQ ID NO核苷酸序列起始DNA片段SEQ ID
核苷酸位置NO通用引物C126
5′-GGA GGA AGG TGG GGA TGA CG - -127b
5′-ATG GTG TGA CGG GCG GTG TG - -a得自数据库的序列b这些序列得自序列表中给出的序列的相反DNA链c通用探针源于不包括在序列表中的16S或23S核糖体RNA基因序列附录III.通过细菌16S和23S核糖体RNA基因的序列对比选择通用探针SEQ ID NO122的相反链(Reverse strand) TGGAGCC
AGCCGCCTAA
GGTGGGAT唾液链球菌
TGAGGTAACC
TTTTGGAGCC
AGCCGCCTAA
GGTGGGATAG
ATGANNGGGG普通变性菌
TAGCTTAACC
TTCGGGAGGG
CGCTTACCAC
TTTGTGATTC
ATGACTGGGG铜绿假单胞菌TAGTCTAACC
GCAAGGGGGA
CGGTTACCAC
GGAGTGATTC
ATGACTGGGG淋病奈瑟氏球菌
TAGGGTAACC
GCAAGGAGTC
CGCTTACCAC
GGTATGCTTC
ATGACTGGGG乳链球菌TTGCCTAACC
GCAAGGAGGG
CGCTTCCTAA
GGTAAGACCG
ATGACNNGGG
附录III.通过细菌16S和23S核糖体RNA基因的序列对比选择通用探针SEQ ID NO123ACGTCAAGTCATCATGGC
CCTTACGAGT
AGG流感嗜血菌GGTNGGGATG
ACGTCAAGTC
..ATCATGGC
CCTTACGAGT
AGGGCTACAC淋病奈瑟氏球菌GGTGGGGATG
ACGTCAAGTC
..CTCATGGC
CCTTATGACC
AGGGCTTCAC葱头假单胞菌
GGTNGGGATG
ACGTCAAGTC
..CTCATGGC
CCTTATGGGT
AGGGCTTCAC粘质沙雷氏菌
GGTGGGGATG
ACGTCAAGTC
..ATCATGGC
CCTTACGAGT
AGGGCTACAC大肠杆菌
GGTGGGGATG
ACGTCAAGTC
..ATCATGGC
CCTTACGACC
AGGGCTACAC普通变性菌GGTGGGGATG
ACGTTAAGTC
GTATCATGGC
CCTTACGAGT
AGGGCTACAC铜绿假单胞菌
GGTGGGGATG
ACGTCAAGTC
..ATCATGGC
CCTTACGGCN
AGGGCTACAC产气荚膜梭状芽孢杆菌
GGTGGGGATG
ACGTNNAATC
..ATCATGCC
CNTTATGTGT
AGGGCTACAC人形枝原体GGTGGGGATG
ACGTCAAATC
..ATCATGCC
TCTTACGAGT
GGGGCCACAC幽门螺杆菌GGTGGGGACG
ACGTCAAGTC
..ATCATGGC
CCTTACGCCT
AGGGCTACAC肺炎枝原体GGAAGGGATG
ACGTCAAATC
..ATCATGCC
CCTTATGTCT
AGGGCTGCAA
附录III.通过细菌16S和23S核糖体RNA基因的序列对比选择通用探针SEQID NO124的相反链(Reverse strand)GCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACAC1451
1490大肠杆菌
ACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG淋病奈瑟氏球菌 ACGTTCCCNGNNCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG葱头假单胞菌
ACGTTCCCGGGTCTTGTACA
CACNGCCCGTCACACCATGG粘质沙雷氏菌
ACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG普通变性菌 ACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG流感嗜血菌 ACGTTCCCGGGCNTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG铜绿假单胞菌
ACGTTCCCGGGCCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG产气荚膜梭状芽孢杆菌
ACGTTCCCNGGTCTTGTACA
CACCGCNCGTCACACCATGA人形枝原体 ACGTTCTCGGGTCTTGTACA
CACCGCCCGTCACACCATGG幽门螺杆菌 ACGTTCCCGGGTCTTGTACT
CACCGCCCGTCACACCATGG肺炎枝原体 ACGTTCTCGGGTCTTGTACA
CACCGCCCGTCAAACTATGA
附录III.通过细菌16S和23S核糖体RNA基因的序列对比选择通用探针SEQ ID NO125的相反链(Reverse strand)TCG TAGTCCGGAT TGGAGTCTGC AACTC大肠杆菌
AAGTGCGTCG
TAGTCCGGAT
TGGAGTCTGC
AACTCGACTC淋病奈瑟氏球菌 AAACCGATCG
TAGTCCGGAT
TGCACTCTGC
AACTCGAGTG葱头假单胞菌
AAACCGATCG
TAGTCCGGAT
TGCACTCTGC
AACTCGAGTG粘质沙雷氏菌
AAGTATGTCG
TAGTCCGGAT
TGGAGTCTGC
AACTCGACTC普通变性菌 AAGTCTGTCG
TAGTCCGGAT
TGGAGTCTGC
AACTCGACTC流感嗜血菌 AAGTACGTCT
AAGTCCGGAT
TGGAGTCTGC
AACTCGACTC铜绿假单胞菌
AAACCGATCG
TAGTCCGGAT
CGCAGTCTGC
AACTCGACTG产气荚膜梭状芽孢杆菌
AAACCAGTCT
CAGTTCGGAT
TGTAGGCTGA
AACTCGCCTA人形枝原体 AAGCCGATCT
CAGTTCGGAT
TGGAGTCTGC
AATTCGACTC幽门螺杆菌 ACACC..TCT
CAGTTCGGAT
TGTAGGCTGC
AACTCGCCTG肺炎枝原体 AAGTTGGTCT
CAGTTCGGAT
TGAGGGCTGC
AATTCGTCCT
附录III.通过细菌16S和23S核糖体RNA基因的序列对比选择通用探针SEQ ID NO128的相反链CT
CTCTGCTAAA
CCGCAAGGTG ATGTATAGGG1991
2040乳酸乳芽孢杆菌AAACACAGCT
CTCTGCTAAA
CCGCAAGGTG ATGTATAGGG
GGTGACGCCT大肠杆菌
AAACACAGCA
CTGTGCAAAC
ACGAAAGTGG ACGTATACGG
TGTGACGCCT铜绿假单胞菌
AAACACAGCA
CTCTGCAAAC
ACGAAAGTGG ACGTATAGGG
TGTGACGCCT葱头假单胞菌
AAACACAGCA
CTCTGCAAAC
ACGAAAGTGG ACGTATAGGG
TGTGACGCCT嗜热脂肪芽孢杆菌
AAACACAGGT
CTCTGCGAAG
TCGTAAGGCG ACGTATAGGG
GCTGACACCT藤黄微球菌AAACACAGGT
CCATGCGAAG
TCGTAAGACG ATGTATATGG
ACTGACTCCTSEQ ID NO129 GGGGGGACC
ATCCTCCAAG GCTAAATAC481
530大肠杆菌
TGTCTGAATA
TGGGGGGACC
ATCCTCCAAG GCTAAATACT
CCTGACTGAC铜绿假单胞菌
TGTCTGAACA
TGGGGGGACC
ATCCTCCAAG GCTAAATACT
ACTGACTGAC葱头假单胞菌
TGTCTGAAGA
TGGGGGGACC
ATCCTCCAAG GCTAAATACT
CGTGATCGAC乳酸乳芽孢杆菌AGTTTGAATC
CGGGAGGACC
ATCTCCCAAC CCTAAATACT
CCTTAGTGAC藤黄微球菌CGTGTGAATC
TGCCAGGACC
ACCTGGTAAG CCTGAATACT
ACCTGTTGAC
附录III.通过细菌16S和23S核糖体RNA基因的序列对比选择通用探针SEQ ID NO130的相反链AACACAGCA
CTCTGCAAAC
ACGAAAGTGG
ACG铜绿假单胞菌
TGTTTATTAA
AAACACAGCA
CTCTGCAAAC
ACGAAAGTGG
ACGTATAGGG大肠杆菌
TGTTTATTAA
AAACACAGCA
CTGTGCAAAC
ACGAAAGTGG
ACGTATACGG葱头假单胞菌
TGTTTAATAA
AAACACAGCA
CTCTGCAAAC
ACGAAAGTGG
ACGTATAGGG嗜热脂肪芽孢杆菌
TGTTTATCAA
AAACACAGGT
CTCTGCGAAG
TCGTAAGGCG
ACGTATAGGG乳酸乳芽孢杆菌TGTTTATCAA
AAACACAGCT
CTCTGCTAAA
CCGCAAGGTG
ATGTATAGGG藤黄微球菌TGTTTATCAA
AAACACAGGT
CCATGCGAAG
TCGTAAGACG
ATGTATATGG
附录IV.通过细菌16S核糖体RNA基因的序列对比选择通用PCR引物SEQ ID NO126
GGAGGAA GGTGGGGATG
ACGSEQ ID NO127的相反链
CA CACCGCCCGT
CACACCAT......大肠杆菌
ACTGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG淋病奈瑟氏球菌GCCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......NNCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG葱头假单胞菌
ACCGGAGGAA GGTNGGGATG ACGTCAAGTC......GTCTTGTACA CACNGCCCGT CACACCATGG粘质沙雷氏菌
ACTGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG普通变性菌ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTTAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG流感嗜血菌ACTGGAGGAA GGTNGGGATG ACGTCAAGTC......GCNTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG嗜肺军团菌ACCGGAGGAA GGCGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG铜绿假单胞菌
ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC......GCCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG产气荚膜梭状芽孢杆菌
CCAGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTNNAATC......GTCTTGTACA CACCGCNCGT CACACCATGA人形枝原体CTGGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC......GTCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG幽门螺杆菌GGAGGAGGAA GGTGGGGACG ACGTCAAGTC......GTCTTGTACT CACCGCCCGT CACACCATGG肺炎枝原体ATTGGAGGAA GGAAGGGATG ACGTCAAATC......GTCTTGTACA CACCGCCCGT CAAACTATGA
序列表(1)一般信息(i)申请人BERGERON，Michel G.
OUELLETTE，MarcROY，Paul
H.(ii)发明名称用于微生物学实验室日常诊断中迅速检测和鉴别临床样品中普通细菌病原体和抗生素抗性基因之特异性和通用性探针及扩增引物(iii)序列数177(iv)通讯地址(A)联系人(B)街道(C)城市(D)州(E)国家(F)ZIP(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘，800K(B)计算机Macintosh IIci(C)操作系统7.0(D)软件Word 5.la(vi)当前申请的数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(vii)在先申请的数据(A)申请号(B)申请日(viii)律师/代理人资料(A)姓名JEAN C.BAKER
(B)登记号(ix)电信信息(A)电话(B)传真(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1817个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体粪肠球菌(xi)序列描述SEQ ID NO1ACAGTAAAAAAGTTGTTAAC GAATGAATTT
GTTAACAACTTTTTTGCTAT
50GGTATTGAGTTATGAGGGGC AATACAGGGA
AAAATGTCGGCTGATTAAGG
100AATTTAGATAGTGCCGGTTA GTAGTTGTCT
ATAATGAAAATAGCAACAAA
150TATTTACGCAGGGAAAGGGG CGGTCGTTTA
ACGGGAAAAATTAGGGAGGA
200TAAAGCAATACTTTTGTTGG GAAAAGAAAT
AAAAGGAAACTGGGGAAGGA
250GTTAATTGTTTGATGAAGGG AAATAAAATT
TTATACATTTTAGGTACAGG
300CATCTTTGTTGGAAGTTCAT GTCTATTTTC
TTCACTTTTTGTAGCCGCAG
350AAGAACAAGTTTATTCAGAA AGTGAAGTTT
CAACAGTTTTATCGAAGTTG
400GAAAAGGAGGCAATTTCTGA GGCAGCTGCT
GAACAATATACGGTTGTAGA
450TCGAAAAGAAGACGCGTGGG GGATGAAGCA
TCTTAAGTTAGAAAAGCAAA
500CGGAAGGCGTTACTGTTGAT TCAGATAATG
TGATTATTCATTTAGATAAA
550AACGGTGCAGTAACAAGTGT TACAGGAAAT
CCAGTTGATCAAGTTGTGAA
600AATTCAATCGGTTGATGCAA TCGGTGAAGA
AGGAGTTAAAAAAATTGTTG
650CTTCTGATAATCCAGAAACT AAAGATCTTG
TCTTTTTAGCTATTGACAAA
700CGTGTAAATAATGAAGGGCA ATTATTTTAT
AAAGTCAGAGTAACTTCTTC
750ACCAACTGGTGACCCCGTAT CATTGGTTTA
TAAAGTGAACGCTACAGATG
800GAACAATTATGGAAAAACAA GATTTAACGG
AACATGTCGGTAGTGAAGTA
850ACGTTAAAAAACTCTTTTCA AGTAACGTTT
AATGTACCAGTTGAAAAAAG
900CAATACGGGAATTGCTTTAC ACGGAACGGA
TAACACAGGGGTTTACCATG
950CAGTAGTTGA
TGGCAAAAATAATTATTCTA
TTATTCAAGCGCCATCACTA
1000GCGACATTAA
ATCAGAATGCTATTGACGCC
TATACGCATGGAAAATTTGT
1050GAAAACATAT
TATGAAGATCATTTCCAACG
ACACAGTATTGATGATCGAG
1100GGATGCCCAT
CTTGTCAGTTGTTGATGAAC
AACATCCAGATGCTTATGAC
1150AATGCTTTTT
GGGATGGAAAAGCAATGCGT
TATGGTGAAACAAGTACACC
1200AACAGGAAAA
ACGTATGCTTCCTCTTTAGA
TGTAGTTGGTCATGAAATGA
1250CACATGGTGT
GACGGAACATACTGCCGGTT
TAGAATATTTAGGACAATCA
1300GGTGCCTTGA
ATGAATCTTATTCTGATTTG
ATGGGTTATATTATTTCGGG
1350TGCATCTAAT
CCAGAAATTGGTGCGGATAC
TCAGAGTGTTGACCGAAAAA
1400CAGGTATTCG
AAATTTACAAACGCCAAGTA
AACACGGACAACCAGAAACC
1450ATGGCTCAAT
ACGACGATCGAGCACGGTAT
AAAGGAACGCCTTATTATGA
1500TCAAGGCGGT
GTTCATTATAACAGTGGAAT
TATTAATCGGATTGGTTACA
1550CCATTATCCA
GAACTTAGGCATTGAAAAAG
CACAGACTATTTTCTACAGC
1600TCGTTAGTAA
ATTACTTAACACCTAAAGCA
CAATTCAGTGATGCTCGTGC
1650TGCGATGCTT
GCTGCTGCAAAAGTTCAATA
TGGCGATGAAGCAGCTTCAG
1700TGGTGTCAGC
AGCCTTTAACTCTGCTGGAA
TCGGAGCTAAAGAAGACATT
1750CAGGTAAACC
AACCAAGTGAATCTGTTCTG
GTCAATGAATGAAAAAAATT
1800CCCCAATTAA
1817(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度2275个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体粪肠球菌(xi)序列描述
SEQ ID NO2GGTACCAAAGAAAAAAACGAACGCCACAAC
CAACAGCCTCTAAAGCAACA
50CCTGCTTCTGAAATTGAGGGAGATTTAGCA
AATGTCAATGAGATTCTTTT
100GGTTCACGATGATCGTGTCGGGTCAGCAAC
GATGGGAATGAAAGTCTTAG
150AAGAAATTTTAGATAAAGAGAAAATTTCAA
TGCCGATTCGAAAAATTAAT
200ATTAATGAATTAACTCAACAAACACAGGCT
TTAATTGTCACAAAAGCTGA
250ACTAACGGAACAAGCACGTAAAAAAGCACC
GAAAGCGACACACTTATCAG
300TAAAAAGTTATGGTTAATCCCCAAAAATAT
GAAACAGTGG GTTTCGCTCT 350TAAAAGAAAGTGCCTAGAGAGGAAGAAAAC
AATGGAAAAT CTTACGAATA 400TTTCAATTGAATTAAATCAACAGTTTAATA
CAAAAGAAGA AGCTATTCGC 450TTTTCCGGCCAGAAACTAGTCGAGGCAGGC
TGTGTTGAGC CCGCTTATAT 500CGAAGCAATGATTGAAAGAGACCAATTGCT
ATCTGCCCAT ATGGGGAATT 550TTATTGCCATTCCTCATGGAACAGAAGAAG
CCAAAAAATT AGTGAAAAAA 600TCAGGAATCTGTGTAGTGCAAGTCCCAGAG
GGCGTTAATT TTGGCACCGA 650AGAAGATGAAAAAATTGCTACCGTATTATT
TGGGATTGCC GGAGTCGGTG 700AAGAACATTTGCAATTAGTCCAACAAATTG
CACTTTATTG TAGTGATATG 750GATAACGTGGTGCAACTTGCCGATGCATTA
AGTAAAGAAG AAATAACAGA 800(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度227个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(xi)序列描述
SEQ ID NO3GATCCGCCAT
GGGTTGTTTT
CCGATTGAGG ATTTTATAGA
TGGTTTCTGG
50CGACCTGCAC
AGGAGTACGG
TGATTTTTAA TTATTGCAAT
TGCACAAGAG
100TCAGTTCTCC
CCCAAAGACA
GCACCGGTAT CAATATAATG
CAGGTTGCCA
150ATATCCACGC
GATGGCGCAA
AGGTGTATGA CCAAACCAGA
AATGATCGGC
200CACCTGCATC
GCCAGTTCGC
GAGTCGG 227(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度278个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(xi)序列描述SEQ ID NO4GATCTAAATC
AAATTAATTGGTTAAAGATA
ACCACAGCGGGGCCGACATA
50AACTCTGACA
AGAAGTTAACAACCATATAA
CCTGCACAGGACGCGAACAT
100GTCTTCTCAT
CCGTATGTCACCCAGCAAAA
TACCCCGCTGGCGGACGACA
150CCACTCTGAT
GTCCACTACCGATCTCGCTT
TCCAGCGTCATATTGGGGCG
200CGCTACGTTG
GGGCGTGGGCGTAATTGGTC
AATCAGGCGCGGGGTCAGCG
250GATAAACATT
CACCATTTTGTCGAGATC278(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度1596个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(xi)序列描述SEQ ID NO5ATGGCTGACA TTCTGCTGCT CGATAATATC GACTCTTTTA CGTACAACCT 50GGCAGATCAG TTGCGCAGCA ATGGGCATAA CGTGGTGATT TACCGCAACC 100ATATACCGGC GCAAACCTTA ATTGAACGCT TGGCGACCAT GAGTAATCCG 150GTGCTGATGC TTTCTCCTGG CCCCGGTGTG CCGAGCGAAG CCGGTTGTAT 200GCCGGAACTC CTCACCCGCT TGCGTGGCAA GCTGCCCATT ATTGGCATTT 250GCCTCGGACA TCAGGCGATT GTCGAAGCTT ACGGGGGCTA TGTCGGTCAG 300GCGGGCGAAA TTCTCCACGG TAAAGCCTCC AGCATTGAAC ATGACGGTCA 350GGCGATGTTT GCCGGATTAA CAAACCCGCT GCCGGTGGCG CGTTATCACT 400CGCTGGTTGG CAGTAACATT CCGGCCGGTT TAACCATCAA CGCCCATTTT 450AATGGCATGG TGATGGCAGT ACGTCACGAT GCGGATCGCG TTTGTGGATT 500CCAGTTCCAT CCGGAATCCA TTCTCACCAC CCAGGGCGCT CGCCTGCTGG 550AACAAACGCTGGCCTGGGCGCAGCATAAAC
TAGAGCCAGCCAACACGCTG
600CAACCGATTCTGGAAAAACTGTATCAGGCG
CAGACGCTTAGCCAACAAGA
650AAGCCACCAGCTGTTTTCAGCGGTGGTGCG
TGGCGAGCTGAAGCCGGAAC
700AACTGGCGGCGGCGCTGGTGAGCATGAAAA
TTCGCGGTGAGCACCCGAAC
750GAGATCGCCGGGGCAGCAACCGCGCTACTG
GAAAACGCAGCGCCGTTCCC
800GCGCCCGGATTATCTGTTTGCTGATATCGT
CGGTACTGGCGGTGACGGCA
850GCAACAGTATCAATATTTCTACCGCCAGTG
CGTTTGTCGCCGCGGCCTGT
900GGGCTGAAAGTGGCGAAACACGGCAACCGT
AGCGTCTCCAGTAAATCTGG
950TTCGTCCGATCTGCTGGCGGCGTTCGGTAT
TAATCTTGATATGAACGCCG
1000ATAAATCGCGCCAGGCGCTGGATGAGTTAG
GTGTATGTTTCCTCTTTGCG
1050CCGAAGTATCACACCGGATTCCGCCACGCG
ATGCCGGTTCGCCAGCAACT
1100GAAAACCCGCACCCTGTTCAATGTGCTGGG
GCCATTGATTAACCCGGCGC
1150ATCCGCCGCTGGCGTTAATTGGTGTTTATA
GTCCGGAACTGGTGCTGCCG
1200ATTGCCGAAACCTTGCGCGTGCTGGGGTAT
CAACGCGCGGCGGTGGTGCA
1250CAGCGGCGGGATGGATGAAGTTTCATTACA
CGCGCCGACAATCGTTGCCG
1300AACTGCATGACGGCGAAATTAAAAGCTATC
AGCTCACCGCAGAAGACTTT
1350GGCCTGACACCCTACCACCAGGAGCAACTG
GCAGGCGGAACACCGGAAGA
1400AAACCGTGACATTTTAACACGTTTGTTACA
AGGTAAAGGCGACGCCGCCC
1450ATGAAGCAGCCGTCGCTGCGAACGTCGCCA
TGTTAATGCGCCTGCATGGC
1500CATGAAGATCTGCAAGCCAATGCGCAAACC
GTTCTTGAGGTACTGCGCAG
1550TGGTTCCGCTTACGACAGAGTCACCGCACT
GGCGGCACGAGGGTAA
1596(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度2703个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(xi)序列描述
SEQ ID NO6GACGACTTAG
TTTTGACGGAATCAGCATAG
TTAATCACTTCACTGTGGAA
50AATGAGGAAA
TATTATTTTTTTTGCGCTTC
GTAATTAATGGTTATAAGGT
100CGGCCAGAAA
CCTTTCTAATGCAAGCGATG
ACGTTTTTTTATGTGTCTGA
150ATTTGCACTG
TGTCACAATTCCAAATCTTT
ATTAACAACTCACCTAAAAC
200GACGCTGATC
CAGCGTGAATACTGGTTTCC
CTTATGTTCATCAGATTCAT
250TTAAGCAAGG
GTTTCTTCTTCATTCCTGAT
GAAAGTGCCATCTAAAAAGA
300TGATCTTAAT
AAATCTATTAAGAATGAGAT
GGAGCACACTGGATATTTTA
350CTTATGAAAC
TGTTTCACTCCTTTACTTAA
TTTATAGAGTTACCTTCCGC
400TTTTTGAAAA
TACGCAACGGCCATTTTTTG
CACTTAGATACAGATTTTCT
450GCGCTGTATT
GCATTGATTTGATGCTAATC
CTGTGGTTTGCACTAGCTTT
500AAGTGGTTGA
GATCACATTTCCTTGCTCAT
CCCCGCAACTCCTCCCTGCC
550TAATCCCCCG
CAGGATGAGGAAGGTCAACA
TCGAGCCTGGCAAACTAGCG
600ATAACGTTGT
GTTGAAAATCTAAGAAAAGT
GGAACTCCTATGTCACAACC
650TATTTTTAAC
GATAAGCAATTTCAGGAAGC
GCTTTCACGTCAGTGGCAGC
700GTTATGGCTT
AAATTCTGCGGCTGAAATGA
CTCCTCGCCAGTGGTGGCTA
750GCAGTGAGTG
AAGCACTGGCCGAAATGCTG
CGTGCTCAGCCATTCGCCAA
800GCCGGTGGCG
AATCAGCGACATGTTAACTA
CATCTCAATGGAGTTTTTGA
850TTGGTCGCCT
GACGGGCAACAACCTGTTGA
ATCTCGGCTGGTATCAGGAT
900GTACAGGATT
CGTTGAAGGCTTATGACATC
AATCTGACGGACCTGCTGGA
950AGAAGAGATC
GACCCGGCGCTGGGTAACGG
TGGTCTGGGACGTCTGGCGG
1000CGTGCTTCCT
CGACTCAATGGCAACTGTCG
GTCAGTCTGCGACGGGTTAC
1050GGTCTGAACT
ATCAATATGGTTTGTTCCGC
CAGTCTTTTGTCGATGGCAA
1100ACAGGTTGAA
GCGCCGGATGACTGGCATCG
CAGTAACTACCCGTGGTTCC
1150GCCACAACGA
AGCACTGGATGTGCAGGTAG
GGATTGGCGGTAAAGTGACG
1200AAAGACGGAC
GCTGGGAGCCGGAGTTTACC
ATTACCGGTCAAGCGTGGGA
1250TCTCCCCGTT
GTCGGCTATCGTAATGGCGT
GGCGCAGCCGCTGCGTCTGT
1300GGCAGGCGAC
GCACGCGCATCCGTTTGATC
TGACTAAATTTAACGACGGT
1350GATTTCTTGC
GTGCCGAACAGCAGGGCATC
AATGCGGAAAAACTGACCAA
1400AGTTCTCTAT
CCAAACGACAACCATACTGC
CGGTAAAAAGCTGCGCCTGA
1450TGCAGCAATA
CTTCCAGTGTGCCTGTTCGG
TAGCGGATATTTTGCGTCGC
1500CATCATCTGG
CGGGGCGTGAACTGCACGAA
CTGGCGGATTACTAAGTTAT
1550TCAGCTGAAC
GATACCCACCCAACTATCGC
GATTCCAGAACTGCTGCGCG
1600TGCTGATCGA
TGAGCACCAGATGAGCTGGG
ATGACGCTTGGGCCATTACC
1650AGCAAAACTT
TCGCTTACACCAACCATACC
CTGATGCCAGAAGCGCTGGA
1700ACGCTGGGAT
GTGAAACTGGTGAAAGGCTT
ACTGCCGCGCCACATGCAGA
1750TTATTAACGA
AATTAATACTCGCTTTAAAA
CGCTGGTAGAGAAAACCTGG
1800CCGGGCGATG
AAAAAGTGTGGGCCAAACTG
GCGGTGGTGCACGACAAACA
1850AGTGCATATG
GCGAACCTGTGTGTGGTTGG
CGGTTTCGCGGTGAACGGTG
1900TTGCGGCGCT
GCACTCGGATCTGGTGGTGA
AAGATCTGTTCCCGGAATAT
1950CACCAGCTAT
GGCCGAACAAATTCCATAAC
GTCACCAACGGTATTACCCC
2000ACGTCGCTGG
ATCAAACAGTGCAACCCGGC
ACTGGCGGCTCTGTTGGATA
2050AATCACTGCA
AAAAGAGTGGGCTAACGATC
TCGATCAGCTGATCAATCTG
2100GTTAAATTGG
CTGATGATGCGAAATTCCGT
CAGCTTTATCGCGTGATCAA
2150GCAGGCGAAT
AAAGTCCGTCTGGCGGAGTT
TGTGAAAGTTCGTACCGGTA
2200TTGACATCAA
TCCACAGGCGATTTTCGATA
TTCAGATCAAACGTTTGCAC
2250GAGTACAAAC
GCCAGCACCTGAATCTGCTG
CGTATTCTGGCGTTGTACAA
2300AGAAATTCGT
GAAAACCCGCAGGCTGATCG
CGTACCGCGCGTCTTCCTCT
2350TCGGCGCGAA
AGCGGCACCGGGCTACTACC
TGGCTAAGAATATTATCTTT
2400GCGATCAACA
AAGTGGCTGACGTGATCAAC
AACGATCCGCTGGTTGGCGA
2450TAAGTTGAAG
GTGGTGTTCCTGCCGGATTA
TTGCGTTTCGGCGGCGGAAA
2500AACTGATCCC
GGCGGCGGATATCTCCGAAC
AAATTTCGACTGCAGGTAAA
2550GAAGCTTCCG
GTACCGGCAATATGAAACTG
GCGCTCAATGGTGCGCTTAC
2600TGTCGGTACG
CTGGATGGGGCGAACGTTGA
AATCGCCGAGAAAGTCGGTG
2650AAGAAAATAT
CTTTATTTTT GGTCATACGG
TCAAACAAGTGAAGGCAATC
2703(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度1391个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体大肠杆菌(xi)序列描述SEQ ID NO7AGAGAAGCCT
GTCGGCACCG TCTGGTTTGC
TTTTGCCACTGCCCGCGGTG
50AAGGCATTAC
CCGGCGGGAT GCTTCAGCGG
CGACCGTGATGCGGTGCGTC
100GTCAGGCTAC
TGCGTATGCA TTGCAGACCT
TGTGGCAACAATTTCTACAA
150AACACTTGAT
ACTGTATGAG CATACAGTAT
AATTGCTTCAACAGAACATA
200TTGACTATCC
GGTATTACCC GGCATGACAG
GAGTAAAAATGGCTATCGAC
250GAAAACAAAC
AGAAAGCGTT GGCGGCAGCA
CTGGGCCAGATTGAGAAACA
300ATTTGGTAAA
GGCTCCATCA TGCGCCTGGG
TGAAGACCGTTCCATGGATG
350TGGAAACCAT
CTCTACCGGT TCGCTTTCAC
TGGATATCGCGCTTGGGGCA
400GGTGGTCTGC
CGATGGGCCG TATCGTCGAA
ATCTACGGACCGGAATCTTC
450CGGTAAAACC
ACGCTGACGC TGCAGGTGAT
CGCCGCAGCGCAGCGTGAAG
500GTAAAACCTG
TGCGTTTATC GATGCTGAAC
ACGCGCTGGACCCAATCTAC
550GCACGTAAAC
TGGGCGTCGA TATCGACAAC
CTGCTGTGCTCCCAGCCGGA
600CACCGGCGAG
CAGGCACTGG AAATCTGTGA
CGCCCTGGCGCGTTCTGGCG
650CAGTAGACGT
TATCGTCGTT GACTCCGTGG
CGGCACTGACGCCGAAAGCG
700GAAATCGAAG
GCGAAATCGG CGACTCTCAC
ATGGGCCTTGCGGCACGTAT
750GATGAGCCAG
GCGATGCGTA AGCTGGCGGG
TAACCTGAAGCAGTCCAACA
800CGCTGCTGAT
CTTCATCAAC CAGATCCGTA
TGAAAATTGGTGTGATGTTC
850GGTAACCCGG
AAACCACTAC CGGTGGTAAC
GCGCTGAAATTCTACGCCTC
900TGTTCGTCTC
GACATCCGTC GTATCGGCGC
GGTGAAAGAGGGCGAAAACG
950TGGTGGGTAG
CGAAACCCGC
GTGAAAGTGG
TGAAGAACAAAATCGCTGCG
1000CCGTTTAAAC
AGGCTGAATT
CCAGATCCTC
TACGGCGAAGGTATCAACTT
1050CTACGGCGAA
CTGGTTGACC
TGGGCGTAAA
AGAGAAGCTGATCGAGAAAG
1100CAGGCGCGTG
GTACAGCTAC
AAAGGTGAGA
AGATCGGTCAGGGTAAAGCG
1150AATGCGACTG
CCTGGCTGAA
AGATAACCCG
GAAACCGCGAAAGAGATCGA
1200GAAGAAAGTA
CGTGAGTTGC
TGCTGAGCAA
CCCGAACTCAACGCCGGATT
1250TCTCTGTAGA
TGATAGCGAA
GGCGTAGCAG
AAACTAACGAAGATTTTTAA
1300TCGTCTTGTT
TGATACACAA
GGGTCGCATC
TGCGGCCCTTTTGCTTTTTT
1350AAGTTGTAAG
GATATGCCAT
GACAGAATCA
ACATCCCGTCG
1391(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度238个碱基对(B)类型核酸(C)链型 链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述
SEQ ID NO8TCGCCAGGAA
GGCGGCATTC GGCTGGGTCA
GAGTGACCTGCAGCGTGGTG
50TCGTTCAGCG
CTTTCACCCC CAACGTCTCG
GGTCCCTTTTGCCCGAGGGC
100AATCTCGCGG
GCGTTGGCGA TATGCATATT
GCCAGGGTAGCTCGCGTAGG
150GGGAGGCTGT
TGCCGGCGAG ACCAGCCGTT
GCCAGCTCCAGACGATATCC
200TGCGCTGTAA
TGGCCGTGCC GTCAGACCAG
238(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度385个碱基对(B)类型核酸(C)链型 链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述
SEQ ID NO9CAGCGTAATGCGCCGCGGCATAACGGCGCC
ACTATCGACAGTCAGTTCGT
50CAGCCTGCAGCCTGGGCTGAATCTGGGACC
ATGGCGCCTGCCGAACTACA
100GCACCTATAGCCACAGCGATAACAACAGCC
GCTGGGAGTCGGTTTACTCC
150TATCTTGCCCGCGATATTCACACCCTACGC
AGCCAGCTGGTGGTCGGTAA
200TACGTATACCTCTTCCGGCATTTTCGACAG
TTTGAGTTTTACCGGTCTGC
250AGCTCAGTTCGACAAAGAGATGCTGCCGGA
TAGCCTGCATGCTTTGCGCC
300GACGATTCGAGGGATCGCGCGCACCACCGC
GGAGGTCTCGGTTTATCAGA
350ATGGTTACAGCATTTATAAAACCACCGTCG
CTACC 385(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度462个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO10CTCTATATTCAGGACGAACATATCTGGACC
TCTGGCGGGGTCAGTTCCGG 50CTTTGATCGCCCTGCACCCGCAGCGGGTGA
TCGCCCCTCATCTGCTACTG 100CGGCGCTGCAACAGGCGACGATCGATGACG
TTATTCCTGGCCAGCAAACA 150GCAGACCAATTAAGGTCTGATAGTGGCTCT
CTTCCTCCGGCGCGCGACGG 200TCCAGGCGGCTCAACAGTTTGGTGCATAGC
GCTTTGCGGTTGAGATGACG 250CCCTTCGTTAAGAATATCCATCACGATCTC
CGTCCATGGAGAGTAGCGTT 300TATTCCAGAATAGGGTTTTTCAGGATCTCA
TGGATCTGCGCCTGCTTATC 350GCTATTTTGTAACCAGATCGCATAAAGTGG
ACGGGATAACGTAGCGCTGT 400CCATGACCGTATGTAACCCATGCTTCTCTT
TCGCCCAGCGAGCAGGTAGC 450CAACAGCAGCCG
462(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度730个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体肺炎克雷伯氏菌(xi)序列描述SEQ ID NO11GCTGACCGCT
AAACTGGGTT ACCCGATCAC
TGACGATCTGGACATCTACA 50CCCGTCTGGG
CGGCATGGTT TGGCGCGCTG
ACTCCAAAGGCAACTACGCT 100TCAACCGGCG
TTTCCCGTAG CGAACACGAC
ACTGGCGTTTCCCCAGTATT 150TGCTGGCGGC
GTAGAGTGGG CTGTTACTCG
TGACATCGCTACCCGTCTGG 200AATACCAGTG
GGTTAACAAC ATCGGCGACG
CGGGCACTGTGGGTACCCGT 250CCTGATAACG
GCATGCTGAG CCTGGGCGTT
TCCTACCGCTTCGGTCAGGA 300AGATGCTGCA
CCGGTTGTTG CTCCGGCTCC
GGCTCCGGCTCCGGAAGTGG 350CTACCAAGCA
CTTCACCCTG AAGTCTGACG
TTCTGTTCAACTTCAACAAA 400GCTACCCTGA
AACCGGAAGG TCAGCAGGCT
CTGGATCAGCTGTACACTCA 450GCTGAGCAAC
ATGGATCCGA AAGACGGTTC
CGCTGTTGTTCTGGGCTACA 500CCGACCGCAT
CGGTTCCGAA GCTTACAACC
AGCAGCTGTCTGAGAAACGT 550GCTCAGTCCG
TTGTTGACTA CCTGGTTGCT
AAAGGCATCCCGGCTGGCAA 600AATCTCCGCT
CGCGGCATGG GTGAATCCAA
CCCGGTTACTGGCAACACCT 650GTGACAACGT
GAAAGCTCGC GCTGCCCTGA
TCGATTGCCTGGCTCCGGAT 700CGTCGTGTAG
AGATCGAAGT TAAAGGTATC730(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度225个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体奇异变形菌(xi)序列描述
SEQ ID NO1 2CGCTACTGTT TAAATCTCAT
TTGAAACATC GCAAAGTCAG
TGAACCACAT
50ATTCGAGGAT GGCATGCACT
AGAAAATATT AATAAGATTT
TAGCGAAACC
100TAATCAGCGC AATATCGCTT
AATTATTTTA GGTATGTTCT
CTTCTATCCT
150ACAGTCACGA GGCAGTGTCG
AACTTGATCC TCATTTTATT
AATCACATGA
200CCAATGGTAT AAGCGTCGTC
ACATA225(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度402个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体奇异变形菌(xi)序列描述SEQ ID NO13ACATTTTAAA
TAGGAAGCCACCTGATAACA
TCCCCGCAGTTGGATCATCA 50GATTTATAGC
GGCATTTGGTATCCGCTAGA
TAAAAGCAGTCCAACGATCC 100CGCCAATTGTTAGATGAAATTGGACTATTC
TTTTTATTTGCTCCGCTTTA
150TCACAGTGGTTTTCGCTTTGCCGCCCCTGT
GCGCCAACAGCTAAGAACAC
200GCACGCTCTTTAATGTGTTAGGCCCATTAA
TTAATCCAGCGCGTTCCGCC
250TTTAGCATTAATTGGTGTTTATAGTCCTGA
ATTATTAATGCCTATTGCAG
300ATACCTTAAATGTCTTGGGCTACAAACGTG
CGGCAGTGGTCCATAGTGGT
350GGAATGGATGAAGTGTCATTACATGCTCCC
ACACAAGTGGCTGAGTTACA
400CA 402(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度157个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体奇异变形菌(xi)序列描述SEO ID NO14CTGAAACGCA
TTTATGCGGG
AGTCAGTGAA
ATCATCACTC
AATTTTCACC
50CGATGTATTT
TCTGTTGAAC
AAGTCTTTAT
GGCAAAAAAT
GCAGACTCAG
100CATTAAAATT
AGGCCAAGCA
AGAGGTGTGG
CGATTTTAGC
GGCAGTCAAT
150AATGATC
157(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度1348个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体奇异变形菌(xi)序列描述SEQ ID NO15TTTCTCTTTA
AAATCAATTCTTAAAGAAAT
TATTAATAATTAACTTGATA
50CTGTATGATT
ATACAGTATAATGAGTTTCA
ACAAGCAAAATCATATACGT
100TTTAATGGTA
GTGACCCATCTTTATGCTTC
ACTGCCCAGAGGGAGATAAC
150ATGGCTATTG
ATGAAAACAAACAAAAAGCA
TTGGCCGCAGCACTTGGTCA
200AATTGAAAAG
CAATTTGGTAAAGGTTCTAT
CATGCGTCTGGGCGAAGACC
250GTTCCATGAA
CGTAGAAACTATCTCTACAG
GATCTTTATCATTAGACGTT
300GCTTTAGGTG
CAGGTGGATTGCCACGTGGC
CGTATTGTTGAAATCTATGG
350CCCTGAATCT
TCTGGTAAAACAACCTTGAC
TCTACAAGTTATTGCCTCTG
400CTCAGCGTGA
AGGAAAAATTTGTGCATTTA
TTGATGCTGAACATGCATTA
450GACCCAATTT
ATGCTCAAAAGCTAGGTGTC
GATATCGATAATCTACTCTG
500CTCTCAACCT
GACACAGGTGAACAAGCTCT
GGAAATTTGTGATGCATTAT
550CTCGCTCTGG
TGCGGTCGATGTTATTGTCG
TGGACTCCGTGGCAGCATTA
600ACACCAAAAG
CTGAAATTGAAGGTGAAATT
GGTGATTCACACGTTGGTTT
650AGCCGCACGT
ATGATGAGCCAAGCTATGCG
TAAACTAGCGGGTAACCTTA
700AAAACTCTAA
TACACTGCTGATTTTCATTA
ACCAAATTCGTATGAAAATC
750GGTGTTATGT
TTGGTAACCCAGAAACCACG
ACCGGTGGTAATGCGCTTAA
800ATTCTATGCT
TCTGTTCGTTTAGACATTCG
TCGCATTGGCTCTGTCAAAA
850ATGGTGATGA
AGTCATTGGTAGTGAGACTC
GCGTTAAAGTTGTTAAAAAT
900AAAGTGGCTG
CACCGTTTAAACAAGCTGAA
TTCCAAATTATGTACGGTGA
950AGGTATTAAT
ACCTATGGCGAACTGATTGA
TTTAGGTGTTAAACATAAGT
1000TAGTAGAGAA
AGCAGGTGCTTGGTATAGCT
ACAATGGCGAAAAAATTGGT
1050CAAGGTAAAG
CTAACGCAACCAATTACTTA
AAAGAACATCCTGAAATGTA
1100CAATGAGTTA
AACACTAAATTGCGTGAAAT
GTTGTTAAATCATGCTGGTG
1150AATTCACAAG
TGCTGCGGATTTTGCAGGTG
AAGAGTCAGACAGTGATGCT
1200GACGACACAA
AAGAGTAATTAGCTGGTTGT
CATGCTGTTTGTGTGAAAAT
1250AGACCTTAAA
TCATTGGCTATTATCACGAC
AGCATCCCATAGAATAACTT
1300GTTTGTATAA
ATTTT(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度2167个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)原始来源(A)有机体铜绿假单胞菌(xi)序列描述SEQ ID NO16GGTACCGCTG
GCCGAGCATC TGCTCGATCA
CCACCAGCCGGGCGACGGGA50ACTGCACGAT
CTACCTGGCG AGCCTGGAGC
ACGAGCGGGTTCGCTTCGTA100CGGCGCTGAG
CGACAGTCAC AGGAGAGGAA
ACGGATGGGATCGCACCAGG150AGCGGCCGCT
GATCGGCCTG CTGTTCTCCG
AAACCGGCGTCACCGCCGAT200ATCGAGCGCT
CGCACGCGTA TGGCGCATTG
CTCGCGGTCGAGCAACTGAA250CCGCGAGGGC
GGCGTCGGCG GTCGCCCGAT
CGAAACGCTGTCCCAGGACC300CCGGCGGCGA
CCCGGACCGC TATCGGCTGT
GCGCCGAGGACTTCATTCGC350AACCGGGGGG
TACGGTTCCT CGTGGGCTGC
TACATGTCGCACACGCGCAA400GGCGGTGATG
CCGGTGGTCG AGCGCGCCGA
CGCGCTGCTCTGCTACCCGA450CCCCCTACGA
GGGCTTCGAG TATTCGCCGA
ACATCGTCTACGGCGGTCCG500GCGCCGAACC
AGAACAGTGC GCCGCTGGCG
GCGTACCTGATTCGCCACTA550CGGCGAGCGG
GTGGTGTTCA TCGGCTCGGA
CTACATCTATCCGCGGGAAA600GCAACCATGT
GATGCGCCAC CTGTATCGCC
AGCACGGCGGCACGGTGCTC650GAGGAAATCT
ACATTCCGCT GTATCCCTCC
GACGACGACTTGCAGCGCGC700CGTCGAGCGC
ATCTACCAGG CGCGCGCCGA
CGTGGTCTTCTCCACCGTGG750TGGGCACCGG
CACCGCCGAG CTGTATCGCG
CCATCGCCCGTCGCTACGGC800GACGGCAGGC
GGCCGCCGAT CGCCAGCCTG
ACCACCAGCGAGGCGGAGGT850GGCGAAGATG
GAGAGTGACG TGGCAGAGGG
GCAGGTGGTGGTCGCGCCTT900ACTTCTCCAG
CATCGATACG CCCGCCAGCC
GGGCCTTCGTCCAGGCCTGC950CATGGTTTCT
TCCCGGAGAA CGCGACCATC
ACCGCCTGGGCCGAGGCGGC1000CTACTGGCAG
ACCTTGTTGC TCGGCCGCGC
CGCGCAGGCCGCAGGCAACT1050GGCGGGTGGA
AGACGTGCAG CGGCACCTGT
ACGACATCGACATCGACGCG1100CCACAGGGGC
CGGTCCGGGT GGAGCGCCAG
AACAACCACAGCCGCCTGTC1150TTCGCGCATC
GCGGAAATCG ATGCGCGCGG
CGTGTTCCAGGTCCGCTGGC1200AGTCGCCCGA
ACCGATTCGC CCCGACCCTT
ATGTCGTCGTGCATAACCTC1250GACGACTGGT
CCGCCAGCAT GGGCGGGGGA
CCGCTCCCATGAGCGCCAAC1300TCGCTGCTCG
GCAGCCTGCG CGAGTTGCAG
GTGCTGGTCCTCAACCC