实验十二 离子交换柱层析法分离蛋白质 - 百度文库
实验十二 离子交换柱层析法分离蛋白质
离子交换柱层析法分离蛋白质
1．离子交换与洗脱
所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种靠静电力结合在惰性载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。若惰性载体上以共价键结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，叫阴离子交换剂；若以共价键结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离子，叫阳离子交换剂。在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合；能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合力的大小也不一定相同，所以，采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。离子交换过程可以表示如下：
■一R+Y+x→■一R+X+Y
(阴离子交换)
■一R—Y++x+→■一R—X++Y+
(阳离子交换)
上式中，■代表惰性载体；R代表惰性载体上的活性基团；Y代表平衡离子(可替换离子)； x代表蛋白质分子。
样品进入离子交换柱之前，共价结合于惰性载体上的活性基团大部分处于溶剂化状态，并吸附着平衡缓冲液中带相反电荷的离子。蛋白质样品进入离子交换柱后，由于分子表面一些基团的电荷性质与交换剂上活性基团的电荷性质相反，因而会通过静电引力结合于交换剂上，并把其原来吸附的平衡离子取代下来。
蛋白质是两性电解质，它与离子交换剂的结合力取决于分子表面能够与离子交换剂形成静电键的数目，而后者首先与分子所携带的电荷的数目有关，其次与蛋白质分子的大小及电荷排列也有一定关系，因为它们与蛋白质分子是否易于在离子交换剂上的适当部位形成静电键有关。总的来说，蛋白质分子与交换剂之间存在三种不同的结合状态：①蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目很多，以致它们同时解离的机率等于零。洗脱时，这部分蛋白质由于结合紧密而停留在柱顶端。②蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目相对较少，它们同时解离的机率达到某一有限值(0～1之间)。洗脱时，某一种蛋白质分子的静电键在某一时间里同时解离，随洗脱液向下移动。③蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目极少，完全不与交换剂结合。处于这种状态的蛋白质分子随洗脱液的前峰移动，呈现一个高而窄的“穿过峰’’(“不交换峰”)。如果混合物中有几种蛋白质同时处于这种状态，那么它们会同时被洗脱下来，达不到分离目的。采用阳离子交换剂时，带负电荷的蛋白质分子不能结合而呈“穿过峰”洗脱下来。
蛋白质分子在离子交换剂上的结合状态是随着环境条件的变化而改变的。洗脱就是通过改变缓冲液离子强度或／和pH来改变蛋白质与交换剂的结合状态，降低其与交换剂的结合力，使交换上去的不同蛋白质分子以不同速度洗脱下来，达到分离纯化的目的。增加缓冲液的离子强度时，由于洗脱液中高离子强度竞争性离子的存在，与交换剂结合的蛋白质分子被取代下来进入洗脱液中。洗脱液中离子种类不同时，取代能力不一样。改变缓冲液的pH时，蛋白质分子的解离度降低，电荷减少，从而减弱其与交换剂的结合力。应用阴离子交换剂时要降低pH；应用阳离子交换剂时要升高pH。有时，同时改变两个方面的条件，有利于分离复杂的蛋白质混合物。在恒定的洗脱条件下，往往难以将复杂的蛋白质混合样品有效地分离。通常采用不断改变洗脱条件的方法，即用梯度洗脱的方法来分离蛋白质混合样品。
虽然离子交换层析法分离蛋白质时，主要通过离子交换的作用，但实际上也可能存在 一些疏水吸附和分子筛作用。
2．离子交换剂
贡献者：小e哥哥6062离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性?_百度作业帮
离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性?
离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性?
1,离子交换树脂固定床的床层压力会随着分离过程的进程而不断加大,需要重新填充.同时,也造成固定床填充过程操作麻烦,而且密封性要求高.2,蛋白质分离纯度问题,如果在出峰之后再行切换接收馏分,而在峰行下降后提前切换,虽可以保证纯度,但蛋白分离收率则会下降.3,由于交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离,也易造成各蛋白峰重叠,造成分离纯度下降.4,自动化程度不高.主要也是受固定床以及树脂交换饱和当量无法保持长期稳定造成的.无法像液相色谱柱那样,可以在标样标定后,建立方法,自动分离目标蛋白.5,不过,规模化分离纯化蛋白质过程,使用这种层析法,还是具有一定优势的.……………………………………详细资料请参考：离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性????_百度知道
离子交换层析法分离纯化蛋白质有哪些局限性????
光用种离想纯品能离交换摸清离程蛋白否易变性 离稀释倍数
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出门在外也不愁色層分析法
3.4.13.4.2&
及流動相，二者各有不同的極性或非極性強度；樣本分子因其自身極性的強弱，與此二相之親和力不同。與固定相親和力大者，易留滯原地；與流動相親和力大者，易隨流動相移動，因而達成分離的目的。
以圖解說明此一機制。
』的原則；即極性分子易溶入極性的固定相或流動相，非極性分子則易溶入非極性者；一個樣本分子，則依其極性大小在此兩相間做選擇。
膠體過濾法：
層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為膠体孔隙內的緩衝液。溶質樣本蛋白質根據其
的大小，決定分佈在這兩相的比分子量大的不易進入膠球，隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內的固定相，而被延滯流出膠柱圖。分子的形狀、大小均為影響因素，即與其分子半徑有關，與分子量不完全成正比關係；但一般均視蛋白質為球形，故其形狀較無影響力
Sephacryl Sepharose G-25
(desalting)
BisSephadex S-200, 300, 400, 500, 1000!&
(0.2 M NaCl
Sephadex OH-hydroxylpropylLH
葡萄糖又稱
agarose ()
Sepharose CL CL 2B, 4B, 6B
A-0.5M, A-1.5M, A-5M, A-15M, A-50M, A-150M
()P-2, P-4, P-6, P-10, P-30, P-60, P-100, P-150, P-200, P-
corse, medium, fine, super fine (grade)
下圖說明這種傳統擴散式介質的機制。而近年來因材料科學的進步，發展出通透性特強的膠球，緩衝液可直接浸潤而進入膠球，不需經擴散作用，是為瀰散式
的膠体，效果較好且快速
擴散現象相當顯著；又因液体在膠球間流動時，受重力及對流的影響，會造成亂流。
擴散及亂流都會使膠体過濾的解析力降低甚多
(dead volume)過大、緩衝液進入膠体時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗等
(使目標蛋白質早些溶離出管柱)。
通常分子量大於十萬可用 Sepharose CL 系列，小於五萬者用
Sephadex G-100 以下，其間則使用 Sephacryl S-200 或 300。
避免使用 Sephadex G-150 或 200，因其流率不佳；其它廠牌相對應的產品，亦可使用之。
(圖 3.5)：
(1)& → 幫浦(2)& → 管柱(3)& → 監視器(4)& → 分劃收集器(5)
Sephadex, Bio-Gel
Sephacryl, Sepharose (CL), Bio-Gel A
reservoiradaptor
Sephacryl Sephadex G-100
<font color="#FF%
1.62.6 cm 30 mLSephadex G-150G-200Sephacryl 2-5 mL
0.2 M NaOHNaCl
膠体外表看來都一樣，一定要標示好，以免混淆不清；千萬不要把兩種膠体混在一起，結果會很淒慘
若發生了這種事，就不太適合做研究。
試之，藍色色帶應平穩地往下移動，色帶厚度會稍加寬，但不該有拖尾、變斜，甚或成為不規則亂流！
也可用手電筒在管柱後方打光，看膠体中有無氣泡。
出來，沉澱在膠面。
金屬離子、輔脢、輔因子等小分子，共同達成其活性，在通過管柱後，可能被排除而失去活性。
可在活性分析時補充，或可在溶離緩衝液中添加。
若回收量太低，注意膠体有無吸附現象。
(圖 3.6)。
(包括蛋白質)競爭著佔到固体介質上；其競爭優勢順序如下(圖 3.7)：
(或離子体積)大者優勢
可克服以上兩種優勢，高濃度氫離子可取代其它陽離子
陰離子及陽離子兩大類；每一類又依其帶電基團的強弱，分為強、中、弱三種
合成樹脂(resin)及聚醣(glycan)兩種，前者對蛋白質的純化並不適用，只用在小分子樣本的分離上
注意樹脂與聚醣不同，不可混為一談。
(或負)電，而採用陽(或陰)離子交換介質
容量(capacity)；若超過此一容量，多出的樣本會直接流出
如磷酸鹽 或，會有不同的溶離結果，要以實驗嘗試求得
使用這種介質可能有意想不到的效果。
(帶兩個負電)與交換介質的結合力相當強，會影響樣本蛋白質的結合。
但反過來說，此時能夠結合上去的離子，一定有相當的強度。
(K 或 C column)，可降低，避免梯度破壞。
與膠体過濾相反，多使用矮胖型的管柱，太長並無必要。
鹽梯度；溶離方式有連續梯度(continuous gradient)及階段梯度(stepwise gradient
(，如右圖 X 所指)，否則做好的梯度會在此處破壞，失去梯度的連續性；因此離子交換管柱最好能使用
(如 0-0.3 M NaCl)也要適當，範圍太寬或太窄，均會降低解析度；都要以實驗試出最佳條件。
再生(regeneration)後，才能再次使用
(pH 3.0)洗 1.5
個体積；再以緩衝液平衡完全，才能再度使用
批次法(batch)吸附並溶離蛋白質，一般應用在工業上的大量純化，其效果較差。
(polyethyleneimine agarose)，在管柱中以特殊的緩衝液(Polybuffer)流洗以形成 pH 梯度
所使用的 ampholyte，以較低的 pH
通入管柱，與介質上面的鹼性基團中和，由酸(上方進入管柱處)漸鹼(出口處)，直接在管柱中形成 pH 梯度
(介質)，通常高於其 pI
而帶負電，因此會結合到介質上。 當 Polybuffer
開始注入管柱，降低環境 pH，使樣本分子失去負電荷而溶離下來；蛋白質便依
pI 大小順序，pI 高的先溶離出來；同時會集中在其 pI
的地方，成為一條極細色帶，故稱為焦集法。
說明此純化過程之原理。
留在定相上的分子，可用酸或鹼溶離，或用專一性游離分子溶離
ligand (A)A, B
結合成的複合体，可以方便地解離，而不傷害或
洋菜糖(agarsoe)、纖維素、玻璃砂、幾丁質、合成聚合物均可使用；但用在蛋白質，仍以
為最佳。 以
Sepharose為例，可自行用 CNBr 活化，使糖分子接上-O-C≡N (cyanate ester)基，再與配体上的胺基反應。
共價鍵(雙硫鍵)結合到親和介質上，然後再以 cysteine 或
mercaptoethanol 溶離下來；此法可以用來純化 papain 或如
urease 等含-SH 基的蛋白質，特稱為共價層析法(covalent chromatography)。
耦合反應都相當簡便，介質先經緩衝液洗過後，加入配体溶液反應後，再加入填塞分子，除去介質上未完全反應的基團，裝入管柱流洗後即可使用
(有-NH2 基
(見下節)，則可能對純化效果有正或負面的影響。
(reverse phase)層析法
(若使用 HIC 介質則固定非極性者)，樣本分子會在此二相中進行
partition 分離
(partitioning)
(partitioning) 而達分離效果
以增加層析法的解析力，但是粒子太小會造成流率不佳，反而使解析度下降。HPLC 是使用 silica
或樹脂等耐壓介質，以極細的粒子(大約 10 mm)，在高壓下緊密裝填而成。
使用時要在高壓下進行，因此速度比較快，通常在一小時左右可完成。
(樣本量可達 500 mg)。
色層分析法
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