有没有做大肠杆菌基因敲除 pcr干菌敲除消不掉pcp20的

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-09-23 07:55 标签： 大肠杆菌基因敲除
用Red系统敲除大肠杆菌O157_H7的ecs4553以及ecs4563基因_图文_百度文库
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用Red系统敲除大肠杆菌O157_H7的ecs4553以及ecs4563基因
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B系是衍生自K-12系的,没有鞭毛,没lon蛋白酶,BL21(DE3)由于嵌入T7 RNA聚合酶,重组蛋白表达效率高,但是菌株不如MG1655长得快.具体基因差别你查查文献吧.一个电转pcp20质粒的问题(电转,质粒,抗性,液体培养基)
04:39:10&&&来源：&&&评论：&&
[一个电转pcp20质粒的问题(电转,质粒,抗性,液体培养基)] 我是做大肠杆菌(Escherichia coli)基因敲除的，敲除后想消掉卡那抗性基因，于是电转PCP20， 电转了很多次，每次涂LB+Kan+Amp的平板都不长菌，于是又重新电转，然后涂LB+Amp的平板，长出了很多菌，把这些菌接入LB+Kan+Amp的液体培养基中，想提质粒验证，可是始终不长菌，温度是30°C,而把这些菌的单菌落挑到LB+Kan+Amp的平板上，发现有的菌落可以生长，于是把长的 关键词:[电转 抗性 质粒 液体培养基 基因敲除 大肠杆菌 抗性基因]…
我是做大肠杆菌(Escherichia coli)基因敲除的，敲除后想消掉卡那抗性基因，于是电转PCP20， 电转了很多次，每次涂LB+Kan+Amp的平板都不长菌，于是又重新电转，然后涂LB+Amp的平板，长出了很多菌，把这些菌接入LB+Kan+Amp的液体培养基中，想提质粒验证，可是始终不长菌，温度是30°C,而把这些菌的单菌落挑到LB+Kan+Amp的平板上，发现有的菌落可以生长，于是把长的菌接入含两种抗性的液体培养基中，还是不长，请问是不是kan抗性已经消除掉了？可是kan抗性消除一般做法是在37°C,液体培养十多个小时才行，为什么30°C下在含(antibiotic)的条件下不能生长？目前还没有PCR验证Kan基因有无消除，不知道这种现象是不是其他人也遇到过？
回复按照你的phenotype来看应该是KM已经没有了paper中也没有提到kan抗性消除一般做法是在37°C,液体培养十多个小时才行不行就PCR鉴定一下哈回复Is pcp20 a plasmid or something else? After electroporation, you should plate the bacterial cells on both amp/LB and kan/Lb. The correct transformant should be grown on amp/LB, but not on kan/LB.回复你为什么不首先在LB+Amp的平板涂板，然后再挑取克隆涂LB+Kan+Amp的板，这样就证明了
Kan是否消除了，这样至少你不需要重新转化了？？回复楼上3位说的都有道理，我后来就直接涂LB+Amp的平板，再在LB+Kan的平板验证，挑取不能在后者生长的单菌落，做PCR验证，发现真的是已经消除了Kan抗性的基因，呵呵，谢谢啊回复楼主 你电转条件是多少？
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不清楚这个基因是什么名字但的确有人对大肠杆菌中几乎所有基因进行过敲除实验,可以从参考一下这个网址去找找

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