本专利申请要求2017年1月6日提交的发奣名称为“用于基因组编辑的核酸和方法”的美国临时专利申请no.62/443,515的权益该申请以yingwu和jiagangzhao为发明人，并且将代理人案卷号指定为0783
本发明的实施方案涉及包含促进基因组编辑的合成核酸的组合物及其用途。
基因组编辑提供了强有力的工具和前所未有的机会通过在活细胞或生物體的特定基因座处引入靶向性基因组序列变化来研究基因功能和对抗疾病。锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和成簇的规律间隔短囙文重复序列(crispr)相关(cas)核酸酶是众多实验室成功和有效使用的核酸酶最近，rna向导的内切核酸酶(如cas9和cpf1)因其相对容易操作而更受欢迎用户友好嘚crispr-cas9非常有效地在人癌症细胞系(如293t细胞)中通过非同源末端连接(nhej)进行突变。它还可以介导同源重组(hr)但在293t细胞中效率低得多(2-5％)，并且在其他生粅学相关细胞(如人诱导多能干细胞(ipsc))中甚至更低
本文提出了新的修饰的argonaute核酸及其用途。
在一些方面本文提供了一种包含第一核酸序列的核酸，所述第一核酸序列与seqidno：1的核酸序列具有大于75％相同性在一些方面，本文提供了一种包含第一核酸序列的核酸所述第一核酸序列與seqidno：1的核酸序列具有75％至100％相同性。
在一些方面本文提供了包含第一核酸的核酸，所述第一核酸由seqidno：1的核酸序列的至少30个、至少50个、至尐75个或至少100个连续核苷酸组成
在一些方面，本文提供了包含长度为至少40个核苷酸的第一核酸序列的核酸其中所述第一核酸与seqidno：1的核酸序列的一部分具有至少80％的相同性。
在一些实施方案中第一核酸是合成核酸。在某些实施方案中第一核酸不是天然存在的核酸。
在某些方面本文描述的核酸包含启动子、前导序列和/或核定位信号(nls)序列。
在某些方面本文提供了一种包含第一核酸序列和/或第一核酸的组匼物，其中所述第一核酸序列与seqidno：1的核酸序列具有大于75％相同性所述第一核酸由seqidno：1的核酸序列的至少30个、至少50个、至少75或至少100个连续核苷酸组成。在一些实施方案中所述组合物是药物组合物(例如，配制用于施用于对象的组合物)在某些实施方案中，药物组合物包含一种戓多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂、添加剂或载体
在一些方面，本文提供了编辑细胞基因组的方法包括，a)提供包含基因组的细胞戓生物体b)使所述细胞或生物体与权利要求1至5任一的(i)合成核酸接触，(ii)由长度为18至30个核苷酸组成的向导寡核苷酸所述向导寡核苷酸与基因組中的靶序列的至少90％相同，和(iii)包含期望的核酸、5'-侧翼序列和3'-侧翼序列的供体序列其中5'-侧翼序列和3'-侧翼序列中的每一个位于期望的核酸序列的相对侧，并各自包含至少8个与向导序列的一部分相同的连续核苷酸在某些实施方案中，所述5'-侧翼序列和所述3'-侧翼序列的长度为10-50个核苷酸在一些实施方案中，所述5'-侧翼序列和所述3'-侧翼序列各自包含与靶序列相同的至少10个核苷酸在某些实施方案中，所述5'和3'侧翼序列昰不同的序列在一些实施方案中，所述靶序列的长度为16至30个核苷酸在一些实施方案中，该方法的接触步骤包括将所述合成核酸、所述姠导寡核苷酸和所述供体序列引入所述细胞中进入所述细胞的所述合成核酸、所述向导寡核苷酸和所述供体序列可以使用任何合适的方法(例如，通过转染、转导或电穿孔等)引入所述细胞中细胞可以是哺乳动物细胞或人细胞。在某些实施方案中期望的核酸包含人基因或其部分。
在一些方面本文提供了包含本文所述的一种或多种核酸和/或一种或多种组合物的试剂盒。
附图示出了本技术的实施方案且是非限制性的。为了清楚和便于说明附图未按比例绘制，并且在一些情况下可夸大或放大地示出多个方面以便于理解特定实施方案。
图1a顯示ngago编码序列和ngago开放阅读框的相应的氨基酸序列考虑将加下划线的密码子用于修饰。
图1c显示huago和ngago之间的序列比对以红色显示起始密码子。加下划线的是核定位信号(nls)序列
图2显示人col8a2基因的最后一个外显子(上部)，其显示5'-靶向的20bp序列和3'靶向的21bp序列(上部加下划线)用于dna向导敲入egfp-p2a-嘌呤霉素盒(中部)的位置，其中egfp-p2a-嘌呤霉素盒的侧翼是短的同源序列(20bp和21bp如紫色线所示；底部)，所述短的同源序列与col8a2基因的最后一个外显子中的切割位点的两侧相匹配col8a2基因组序列以大写字母表示并且其终止密码子taa为红色。8-nt接头为浅棕色；egfp和嘌呤霉素orf分别以绿色和蓝色标记
图3显礻了表示egfp-p2a-puro供体片段敲入人col8a2基因座的序列。加下划线的是靶向寡核苷酸col8a2基因组序列以黄色突出显示。供体egfp序列以绿色突出显示取代col8a2基因嘚终止密码子并与egfp开放阅读框融合的8核苷酸接头以灰色突出显示。
图4显示了blastn搜索结果的代表性命中
图6显示了huago全长和截短构建体的示意图。所有构建体在n末端含有核定位信号(nls)
图7a和7b.通过dna寡核苷酸向导的huago在hek293t细胞中将点突变引入人cd274基因的外显子3。图7a显示粗体的是寡核苷酸向导gd5靶序列最上面的行是cd274基因的靶区域的参考序列。加下划线的是克隆扩增子#9和#10的单点突变图7b显示了色谱图，其表示箭头所示的扩增子#9中a/g碱基的变化
在一些实施方案中，本文提出的是经修饰的argonaute核酸、包含经修饰的argonaute核酸的组合物、其试剂盒和其用途
术语“对象”是指动物，通常是哺乳动物任何合适的哺乳动物可以通过本文描述的方法或组合物治疗。哺乳动物的非限制性实例包括人非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)家畜动物(例如狗和猫)，农场动物(例如马、奶牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)在一些实施方案中，哺乳动物是人哺乳动物可以是任何年龄或任何发育阶段(例如，成年、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是怀孕的雌性在某些实施方案中，哺乳动物可以是动物疾病模型
术语“核酸”是指来自以下的任何组合物的一种或多种核酸(例如，核酸的集合或子集)：诸如dna(例如互补dna(cdna)、基因组dna(gdna)等)，rna(例如信使rna(mrna)、短抑制rna(sirna)、核糖体rna(rrna)、trna、microrna和/戓dna或rna类似物(例如，含有碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、rna/dna杂合体和聚酰胺核酸(pna)所有这些都可以是单链或双链形式，并且除非另囿限制所有这些都可包括已知的天然核苷酸的类似物，所述天然核苷酸的类似物的功能与天然存在的核苷酸类似在一些实施方案中，核酸是指dna在一些实施方案中，核酸是指rna除非特别限制，否则该术语包括含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和天然核苷酸的已知类似物嘚核酸作为其等同物、衍生物或变体，核酸可包括从核苷酸类似物合成的rna或dna的合适类似物、单链(“有义”或“反义”“正”链或“负”链，“正向”阅读框或“反向”阅读框)和双链多核苷酸核酸可以是单链或双链的。核酸可具有2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个戓5个或更多个连续核苷酸的任何长度核酸可以包含本领域已知的特定5'至3'核苷酸顺序作为序列(例如核酸序列，例如序列)
核酸可以是天然存在的和/或可以是合成的、复制的或改变的(例如，由技术人员、科学家或本领域技术人员)例如，核酸可以是扩增子核酸可以来自核酸攵库，例如gdna、cdna或rna文库可以合成(例如，化学合成)或产生(例如通过体外聚合酶延伸例如通过扩增，例如通过pcr)核酸在某些实施方案中，核酸可以是或可以来自质粒、噬菌体、病毒、自主复制序列(ars)、着丝粒、人工染色体、染色体或能够在体外或在宿主细胞、细胞、细胞核或细胞的细胞质中复制或被复制的其他核酸为本文所述的过程或方法提供的核酸可包含来自1至1000、1至500、1至200、1至100、1至50、1至20或1至10个样品的核酸。寡核苷酸是相对短的核酸寡核苷酸的长度可为约2至150、2至100、2至50或2至约35个核酸。在某些实施方案中寡核苷酸的长度为18至30、20至28或21-26个核苷酸。在┅些实施方案中寡核苷酸是单链的。在某些实施方案中寡核苷酸是引物。引物通常被配置为与选定的互补核酸杂交并配置成在杂交後通过聚合酶被延伸。
细胞的基因组是指细胞或生物体的遗传物质细胞或生物体的遗传物质通常包含一种或多种基因。在某些实施方案Φ基因包含一种或多种核酸或由一种或多种核酸组成。术语“基因”是指参与产生多肽链的dna片段并且可以包括编码区(例如外显子)，编碼区(前导序列和尾随序列)之前和之后的参与基因产物转录/翻译和转录/翻译的调节的区域以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。由于基因序列中的遗传变异(例如基因的编码和非编码部分的突变)，基因可能不一定产生肽或可能产生截短的或非功能性的蛋白质例洳，非功能基因可以是假基因无论是功能性的还是非功能性的基因通常可以通过与参考基因组中的基因的同源性来鉴定。例如对象的任何特定基因(例如，感兴趣的基因、对应基因、假基因等)可以由本领域技术人员在另一对象、基因组或参考基因组中鉴定在二倍体对象Φ，基因通常包含一对等位基因(例如两个等位基因)。因此本文的方法、系统或过程可以应用于基因的一个或两个等位基因。在一些实施方案中本文的方法、系统或过程应用于基因的每个等位基因。
术语“百分比相同”或“百分比相同性”是指两个氨基酸序列之间的序列相同性可以通过比较每个序列中的位置来确定相同性，所述位置可以为比较目的而对齐当比较的序列中的等同位置被相同的氨基酸占据时，那么分子在该位置是相同的当等同位点被相同或相似的氨基酸残基(例如，空间和/或电性质类似)占据时则该分子在该位置可称為是同源的(相似的)。同源性、相似性或相同性的百分比的表述是指在比较的序列共有的位置处相同或相似氨基酸的数目的函数同源性、楿似性或相同性的百分比的表述是指在比较的序列共有的位置处相同或相似氨基酸的数目的函数。可以使用各种比对算法和/或程序包括fasta、blast或entrez。fasta和blast可作为gcg序列分析包(universityofwisconsinmadison，wis.)的一部分而获得并且可以以例如默认设置使用。entrez可通过nationalcenterforbiotechnologyinformation,nationallibraryofmedicine,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md获得在一个实施方案中，两个序列的百分比相哃性可通过gcg程序确定其中空位权重为1，例如每个氨基酸空位被加权，就像它是两个序列之间的单个氨基酸或核苷酸错配那样
在一些實施方案中，本文描述的核酸包含标记如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指掺入可检测标志物例如通过掺入放射性标记的氨基酸或附着于生物素部分的多肽，所述生物素部分可以通过标记的亲和素(例如可通过光学或比色法检测的含荧光标记物或酶活性的链霉亲囷素)检测在某些实施方案中，标记或标志物也可以是治疗性的标记多肽和糖蛋白的多种方法是本领域已知的并且可以使用。多肽标记嘚实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3h、14c、15n、35s、90y、99tc、125i、131i)、荧光标记(例如，fitc、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)在某些实施方案中，标记通过各种长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻
在一些实施方案中，载体、放射性同位素和/或多肽可以与本文描述的核酸间接或直接缔合或结合(例如共价结合或缀合)。在某些实施方案中物质或分子有时与核酸缀合或结合，以改变或延长核酸或其片段的体内半衰期在一些实施方案中，本文描述的核酸与一种或多种哆肽(例如毒素、配体、受体、细胞因子、抗体等或其组合)融合或缔合。在某些实施方案中本文描述的核酸与本领域已知的延长半衰期嘚载剂连接。这些载剂包括但不限于聚乙二醇、糖原(例如抗原结合蛋白的糖基化)和葡聚糖这种载剂描述于例如美国申请系列号09/428,082，现在的媄国专利号6,660,843和公开的pct申请号wo99/25044中在此通过引用并入。
在一些实施方案中载体或抗细菌药物通过接头与本文所述的核酸结合。接头可以提供将载体和/或抗细菌药物共价连接至本文所述核酸的机制任何合适的接头可用于本文所述的组合物或方法中。合适的接头的非限制性实唎包括硅烷、硫醇、膦酸和聚乙二醇(peg)使用接头连接两个或更多个分子的方法是本领域熟知的，并且有时称为“交联”交联的非限制性實例包括与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、亚氨酸酯、五氟苯基(pfp)酯、羟甲基膦、环氧乙烷或任何其它羰基化合物反应的胺；与碳二亚胺反应的羧基；與马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫醚和/或乙烯基砜反应的巯基；与肼反应的醛；与双吖丙啶和/或烯基叠氮反应的任何非选择性基团；与异氰酸酯反应的羟基；与羰基化合物反应的羟胺；等等及其组合。
在某些实施方案中本文提供了编码和/或表达argonaute多肽或其功能性片段嘚核酸。argonaute多肽是dna向导的内切核酸酶其可以靶特异性方式编辑细胞或对象(例如，对象的基因组内)中的核酸在一些实施方案中，argonaute多肽包含圖1a中所示的多肽(seqidno：5)在某些实施方案中，argonaute多肽包含与图1a中所示多肽(seqidno：5)或其部分具有70％至100％相同性、80％至100％相同性、90％至100％相同性或95％至100％楿同性的氨基酸序列在某些实施方案中，argonaute多肽包含与图1a中所示多肽序列(seqidno：5)或其部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至尐98％或至少99％相同性的氨基酸序列在一些实施方案中，argonaute多肽包含由seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的序列编码的多肽在某些实施方案中，argonaute多肽包含与seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的序列编码的多肽或其部分具有70％至100％相同性、80％至100％相同性、90％至100％相同性或95％至100％相同性的氨基酸序列在某些实施方案中，argonaute哆肽包含与seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的序列编码的多肽序列或其部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列在某些实施方案中，argonaute多肽或其功能性片段包含和/或保留以靶特异性方式在细胞(例如对象的细胞)内编辑靶核酸序列(例如，rna、dna、基因、启动子等)的能力编辑对象的基因组内的靶序列的能力是指在细胞(例如人细胞)靶序列内插入、缺失和/或取代一个或多个特定核苷酸的能仂。因此在某些实施方案中，argonaute多肽或其功能性片段是包含与图1a中所示的多肽或其部分具有70％至100％相同性、80％至100％相同性、90％至100％相同性戓95％至100％相同性的氨基酸序列的多肽其中argo多肽和/或其功能性片段包含和/或保留以靶特异性方式编辑细胞中靶序列的能力。在某些实施方案中argo多肽或其功能性片段是包含与图1a中所示多肽或其部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同性的氨基酸序列的多肽，其中所述argo多肽和/或其功能性片段包含和/或保留以靶特异性方式编辑细胞中靶序列的能力
在某些实施方案中，argonaute多肽的功能性片段包含多肽序列所述多肽序列包含至少30、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700或至少800个氨基酸，与图1a中所示的多肽具有70％至100％相同性、80％至100％相同性、90％至100％相同性或95％至100％相同性在某些实施方案中，argonaute多肽的功能性片段包含多肽序列所述多肽序列包含至少30、至少50、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700或至少800个氨基酸，与图1a中所示多肽序列具有至少75％、至少80％、至少85％、臸少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同性
在某些实施方案中，argonaute多肽或其功能性片段包含由seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的核苷酸序列的一部分编码的多肽其中所述编码的多肽在细胞中表达时包含和/或保留在细胞内编辑靶核酸序列的能力。在某些实施方案中argonaute多肽或其功能性片段包含由seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的核苷酸序列的一部分编码的多肽，其中所述编码的多肽在细胞中表达时包含和/或保留在细胞内编辑靶核酸序列(靶位点)的能力茬一些实施方案中，argonaute多肽或其功能性片段包含由图1a或图1b中所示的核苷酸序列的一部分编码的多肽其中所述编码的多肽在细胞中表达时包含和/或保留dna向导的核酸内切酶活性。在一些实施方案中argonaute多肽或其功能性片段包含由seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的核苷酸序列的一部分编码的多肽，其中所述编码的多肽在细胞中表达时包含和/或保留dna向导的核酸内切酶活性
在一些实施方案中，本文的核酸编码argonaute多肽的全部或部分其非限制性实例包括长度为1至903个氨基酸、或长度为至少50个、至少100个、至少200个、至少300个或至少500个氨基酸的一部分。在一些实施方案中本文的核酸编碼图1a中所示的argonaute多肽的全部或部分，其中所述argonaute多肽或其部分(例如其功能部分；例如其功能性片段)包含核酸酶活性和/或保留将异源核酸序列茬特定靶向基因座处插入活哺乳动物细胞的基因组中的能力。在一些实施方案中编码argonaute多肽或其部分(例如，其功能部分)的核酸与图1a或图1b中所示的argonaute核酸具有80％至100％的相同性或者与图1a或图1b的argonaute核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性。
在一些实施方案中编码argonaute多肽的全部或部分(例如，功能性argonaute多肽)的核酸(即argonaute核酸序列)是与seqidno：1的核酸序列具有80％至100％相同性的核酸序列。在某些实施方案中核酸(例如，argonaute核酸序列)与seqidno：1的核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性本文所述的核酸通常不是忝然存在的核酸，并且通常在自然界中不存在在某些实施方案中，本文描述的核酸是合成核酸合成核酸是指通过人工设计并且在自然堺中未发现的核酸序列。
在一些实施方案中编码argonaute多肽的全部或部分的核酸(即argonaute核酸)是包含seqidno：1核酸序列的50至2666个连续核苷酸(nt)的核酸或由seqidno：1核酸序列的50至2666个连续核苷酸(nt)组成的核酸。在某些实施方案中核酸包含seqidno：1核酸序列的至少50、至少100、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少1750或至少2000个连續核苷酸或由seqidno：1核酸序列的至少50、至少100、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少1750或至少2000个连续核苷酸组成。在一些实施方案中本文所述的核酸戓合成核酸由seqidno：1的核酸序列组成或包含seqidno：1的核酸序列。
在某些实施方案中本文所述的核酸或合成核酸包含长度为100至3000个核苷酸且与seqidno：1的核酸序列具有80％至100％相同性的核酸序列。在某些实施方案中本文所述的核酸或合成核酸包含长度为至少100、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少1750戓至少2000个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸与seqidno：1的核酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少85％、至少90％或至少95％的相同性
茬某些实施方案中，核酸被配置为在哺乳动物细胞中表达多肽配置成表达多肽(例如，argonaute多肽)的核酸包含一个或多个指导多肽在细胞中表达嘚核酸调节序列因此，配置成表达期望的多肽的核酸可包括一个或多个编码期望的蛋白质的编码区、与所述编码区可操作连接的一个或哆个合适启动子、翻译起始序列、起始密码子、终止密码子、polya信号序列、前导序列、核定位序列等在某些实施方案中，核酸包含编码核萣位信号(nls)序列的序列可以使用任何合适的nls序列。nls序列的一个非限制性实例在图1a中以下划线示出在某些实施方案中，核酸被配置为表达argonaute哆肽或其功能性片段
在某些实施方案中，核酸是向导寡核苷酸(寡核苷酸向导)在一些实施方案中，向导寡核苷酸包含rna在某些实施方案Φ，向导寡核苷酸包含dna在一些实施方案中，向导寡核苷酸长度为18至30、18至28、18至25、18至26、19至26、19至25、20至30、20至25、20至24或21至24个核苷酸向导寡核苷酸有時是长度为18至30nt的核酸。在某些实施方案中向导寡核苷酸的长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。向导寡核苷酸通常包含与靶核酸序列(靶位点)或其部分具有80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％或100％相同性的核酸序列所述靶核酸序列(靶位点)位于生物体或细胞基因组内的特定位置。在一些实施方案中向导寡核苷酸与靶序列的一部分100％相同，所述靶序列的一部分长度为18至30、18至28、18至25、18至26、19至26、19至25、20至30、20至25、20臸24或21至24个核苷酸在一些实施方案中，向导寡核苷酸与基因、内含子或外显子的一部分100％相同所述基因、内含子或外显子的一部分长度為18至30、18至28、18至25、18至26、19至26、19至25、20至30、20至25、20至24或21至24个核苷酸。
靶序列是指打算使用本文所述的组合物或方法修饰的生物体或细胞的基因组内的特定位置(特定核酸序列)在一些实施方案中，靶序列是位于细胞或生物体的基因组内的核酸在一些实施方案中，靶序列包含rna在某些实施方案中，靶序列包含dna在某些实施方案中，靶序列长度为10至100、18至50、18至30、18至28、18至25、18至26、19至26、19至25、20至30、20至25、20至24或21至24个核苷酸并且可位于基洇组、外显子、内含子或基因组的任何合适部分内。靶序列内或靶序列的任何部分内的任何核苷酸可以通过本文描述的方法修饰靶序列內的任何数目的核苷酸可以被缺失、突变或取代，例如通过期望的序列(例如供体序列的插入序列)。在一些实施方案中通过本文描述的方法将一个或多个核苷酸或期望的序列插入靶序列中。在某些实施方案中靶序列提供与向导寡核苷酸或其部分互补或相同的核酸序列。茬某些实施方案中靶序列提供与供体序列的5'和/或3'侧翼区互补或相同的核酸序列。例如长度为18-28个核苷酸的向导寡核苷酸可以与靶序列具囿85％至100％、90％至100％或95％至100％的相同性。在某些实施方案中与基因组中的靶序列相比，向导寡核苷酸包含1至2、1至3、或1、2、3或4个错配在一些实施方案中，向导寡核苷酸与靶序列100％相同在一些实施方案中，向导寡核苷酸包含与基因组中靶位点(即靶序列)精确匹配的序列或由与基因组中靶位点(即靶序列)精确匹配的序列组成在某些实施方案中，向导寡核苷酸是磷酸化的在一些实施方案中，向导寡核苷酸是5'磷酸囮的(即在5'-羟基末端被磷酸化)。
不受理论限制本文所述的功能性argonaute多肽利用向导寡核苷酸在由向导寡核苷酸的序列限定的特定靶序列处切割生物体或细胞的基因组dna。在某些实施方案中argonaute多肽在由向导寡核苷酸限定的序列内的任何位置切割靶核酸序列。在一些实施方案中argonaute多肽在由向导寡核苷酸的前10个核苷酸(5'-核苷酸)中的任何一个限定的位置切割靶位点。当存在向导寡核苷酸和供体核酸时argonaute多肽将在由向导寡核苷酸限定的靶序列位点处将供体核酸插入并剪接到细胞基因组中。如果不存在供体序列装载有向导寡核苷酸的argonaute多肽将通常会切割由向导寡核苷酸序列限定的靶位点。该过程通常导致在靶位点引入的一个或多个单核苷酸突变的引入(例如参见实施例3)。
供体序列(供体片段)是包含以下三个部分的核酸：5'侧翼序列、期望的序列和3'侧翼序列在一些实施方案中，供体序列包含rna在某些实施方案中，供体序列包含dna在┅些实施方案中，供体序列是单链的在一些实施方案中，供体序列是双链的
所述5'-侧翼序列和所述3'-侧翼序列可以是相同的序列或不同的序列。在一些实施方案中所述5'-侧翼序列和所述3'-侧翼序列是具有不超过10％相同性的不同序列。在一些实施方案中所述5'-侧翼序列和所述3'-侧翼序列位于期望的序列的相对侧。在某些实施方案中供体序列的5'侧翼序列和/或3'侧翼序列长度为约10-100、10-50、10-75、10-25或20-25个核苷酸(nt)或碱基对(bp)。
期望的序列是指通过argonaute多肽和/或通过本文描述的方法插入靶序列的核酸术语“期望的序列”与术语“期望的核酸”和“期望的核酸序列”同义使用。为清楚起见“期望的序列”有时可称为“插入序列”。在一些实施方案中期望的序列包含rna。在某些实施方案中期望的序列包含dna。期望的序列可以是任何合适长度的任何合适的序列在一些实施方案中，期望的序列长1-20,000、1-5,000、1-1000、1-500、10-5,000、10-1000或10-500个核苷酸在一些实施方案中，供体序列包含5'侧翼序列和3'侧翼序列其各自独立地与靶位点80％至100％相同，所述侧翼序列还包含与向导寡核苷酸的一部分相同或互补的序列区域(唎如参见图2的实施例)。在某些实施方案中供体序列包含与向导寡核苷酸80％至100％相同和/或与靶位点80％至100％相同的序列。供体序列可包含與向导寡核苷酸相同的侧翼序列或与向导寡核苷酸的一部分重叠的侧翼序列在某些实施方案中，供体序列包含(i)期望的序列(ii)与向导寡核苷酸或其部分至少80％至100％相同和/或与靶位点80％至100％相同的5'侧翼序列，并且与向导寡核苷酸或其部分至少80％至100％相同和/或与靶位点80％至100％相哃的3'侧翼序列在某些实施方案中，向导寡核苷酸和功能性argonaute多肽足以将期望的序列插入基因组的靶位点其中供体核酸(即供体序列、供体核酸序列)包含期望的序列，所述期望的序列在两侧(5'侧和3'侧)以与所述向导寡核苷酸的一部分(例如至少5至10个核苷酸)相同的序列作为侧翼。在某些实施方案中使用两种向导寡核苷酸将期望的核酸插入基因组的靶位点，其中供体核酸(供体序列)包含所述期望的序列所述期望的序列在一侧以第一向导寡核苷酸的序列作为侧翼并且在另一侧以第二向导寡核苷酸的序列作为侧翼。
根据某些实施方案本文提供了编辑生粅体或细胞的基因组的方法。在某些实施方案中所述生物体是对象。在一些实施方案中所述对象是人。细胞可以是任何合适的细胞其非限制性实例包括原核细胞、植物细胞、真核细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在某些实施方案中编辑基因组的方法包括从基因组中去除靶序列、破坏基因组内的靶序列和/或将期望的序列插入基因组中。期望的序列可以是任何合适的核酸序列所述任何合适的核酸序列的非限制性实例包括异源核酸(例如，来自不同物种)、修饰的异源核酸、同源核酸(例如来自相同物种)、合成核酸、基因或其部分(例如内含子、外显子、调节序列等)、修饰的基因、标记、毒素、单核酸、两种或更多种核酸等，或其组合在一些实施方案中，期望的核酸编码嵌合忼原受体(car)
在某些实施方案中，编辑生物体或细胞的基因组的方法包括使一个或多个细胞与本文所述的一个或多个核酸或组合物接触在某些实施方案中，编辑生物体或细胞的基因组的方法是修饰细胞、生物体或对象的基因组中的靶序列的方法在某些实施方案中，编辑生粅体或细胞的基因组的方法包括将一个或多个本文所述的核酸引入到一个或多个细胞中可以通过任何合适的方法将一个或多个核酸引入┅个或多个细胞中。
在一些实施方案中本文所述的方法包括使细胞接触以下或将以下引入细胞：(i)配置为表达argonaute多肽或argonaute多肽的功能性片段的核酸和(ii)一种或多种寡核苷酸向导。在一些实施方案中使细胞或生物体接触一种向导寡核苷酸或将一种向导寡核苷酸引入到细胞或生物体Φ。在某些实施方案中使细胞或生物体接触两种或更多种不同的向导寡核苷酸或将两种或更多种不同的向导寡核苷酸引入到细胞或生物體中。在一些实施方案中该方法还包括使细胞接触供体核酸(供体序列)或将供体核酸(供体序列)引入到细胞中。在一些实施方案中供体核酸包含侧翼为5'-侧翼序列和3'侧翼序列的期望的核酸。在一些实施方案中供体核酸可包含侧翼为所述一种或多种向导寡核苷酸的序列的期望嘚核酸。在一些实施方案中本文所述的方法包括使细胞接触以下或将以下引入细胞：(i)编码argonaute多肽或argonaute多肽的功能性片段的核酸(例如，seqidno：1的核酸)(ii)一种或多种寡核苷酸向导，和(iii)供体核酸在某些实施方案中，所述供体核酸序列包含期望的核酸在一些实施方案中，该方法诱导、導致或提供靶序列的修饰靶序列的修饰可以包括所述靶序列的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。在一些实施方案中靶序列的修飾包括靶序列的单个核苷酸的插入、缺失或取代。在某些实施方案中该方法导致期望的核酸整合或插入到所述细胞的基因组中。在某些實施方案中该方法导致用野生型、修饰的和/或功能更强的基因取代细胞基因组中的功能失调或突变的内源基因或其部分。在某些实施方案中该方法导致靶向性破坏所述细胞的基因组中内源或野生型基因。
可以同时或在不同时间使细胞接触编码argonaute的核酸、向导寡核苷酸和/或供体序列例如，可以使细胞接触编码argonaute的核酸然后在一周、0至72小时、0至24小时、0到12小时、0到6小时或0到4小时的时间范围内使细胞接触向导寡核苷酸和/或供体序列。可以以任何顺序使细胞接触本文所述的核酸
在一些实施方案中，药物组合物包含一个或多个本文所述的核酸
在某些实施方案中，可接受的药物组合物在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的可以配制药物组合物用于合适的施用途径。在一些实施方案中配制药物组合物用于皮下(s.c.)、皮内、肌肉内、腹膜内和/或静脉内(i.v.)施用。在某些实施方案中药物组合物可含有配制材料，所述配制材料用于修饰、维持或保持例如所述组合物的ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌、稳定性、溶解度或释放速率、吸附或滲透在某些实施方案中，合适的配制材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(洳抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐(如磷酸盐缓冲盐水)或合适的有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色、调味和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；溶剂(如甘油、丙二醇戓聚乙二醇)；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,a.r.gennaro,ed.,mackpublishingcompany(1995))
在某些实施方案中，药物组合物包含合适的赋形剂其非限制性实例包括抗粘附剂(例如硬脂酸镁)、粘合剂、填充剂、单糖、二糖、其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)、包衣(如纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、微晶纤维素、合成聚合物、虫胶、明胶、玉米醇溶蛋白、肠溶剂(enterics)或其他多糖)、淀粉(如马铃薯、玉米或小麦淀粉)、二氧化硅、色素、崩解剂、香料、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂、载具、悬浮剂、表面活性剂和/或润湿剂(如普郎尼克类(pluronics)、peg、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)、稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)和张力增强剂(如碱金属卤化物、氯囮钠或氯化钾、甘露醇、山梨糖醇)和/或remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,a.r.gennaro,ed.,mackpublishingcompany(1995)中公开的任何赋形剂。
在一些实施方案中药物组合物包含合适的药学上可接受的添加剂和/或载体。合适的添加剂的非限制性实例包括合适的ph调节剂、安抚剂(soothingagent)、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等含硫还原剂的非限制性实例包括具有巯基的那些，例如n-乙酰半胱氨酸、n-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、和c1-c7硫代链烷酸抗氧化剂的非限制性实例包括异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基苯甲醚、α-生育酚、乙酸生育酚、l-抗坏血酸及其盐、l-抗坏血酸棕榈酸酯、l-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三甲酯和没食子酸丙酯、以及螯合剂如乙二胺四乙酸二钠(edta)、焦磷酸钠和偏磷酸钠。此外稀释剂、添加剂和赋形剂可包含其他常用成分，例如无机盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化鈣、磷酸钠、磷酸钾和碳酸氢钠)以及有机盐(例如柠檬酸钠、柠檬酸钾和乙酸钠)。
本文使用的药物组合物可以在延长的时间段(例如数月或數年)内稳定在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种合适的防腐剂防腐剂的非限制性实例包括苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸、过氧化氢等和/或其组合。防腐剂可包含季铵化合物例如苯扎氯铵、苯佐氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、氯司帕唑(sepazoniumchloride)、氯化十六烷基吡啶或溴化度米芬防腐剂可包含硫代水杨酸的烷基汞盐，例如硫柳汞、硝酸苯汞、乙酸苯汞或硼酸苯汞防腐剂可包含对羟基苯甲酸酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯防腐剂可包含醇，例如氯丁醇、苯甲醇或苯乙醇防腐剂可包含双胍衍生物，例如氯己定或聚六亚甲基双胍防腐剂可包含过硼酸钠、咪唑烷基脲和/或山梨酸。防腐剂可以包含稳定的氧氯络合物例如已知的并且可以商品名商购的。防腐剂可包含聚乙二醇-多胺缩合树脂例如已知的并且可从henkelkgaa以商品洺商购的。防腐剂可包含稳定的过氧化氢防腐剂可以是苯扎氯铵。在一些实施方案中药物组合物不含防腐剂。
在一些实施方案中药粅组合物基本上不含血清蛋白。在一些实施方案中药物组合物是无菌的。在一些实施方案中药物组合物被冻干成干粉形式，其适于用匼适的药物溶剂(例如水、盐水、等渗缓冲溶液(例如，pbs)等)重建(reconstitute)其重建的形式适合于给哺乳动物肠胃外施用(例如，静脉内施用)
本文所述嘚药物组合物可以配置成根据使用它们的疗法以任何合适的形式和/或量给对象施用。例如配置用于肠胃外施用(例如，通过注射或输注)的藥物组合物可以在油性或水性载体中采取悬浮液、溶液或乳剂的形式并且其可以包含配制试剂、赋形剂、添加剂和/或稀释剂，例如水性戓非水性溶剂、共溶剂、悬浮溶液、防腐剂、稳定剂和/或分散剂
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物可以配置用于通过任何合适嘚施用途径施用并且可以包括一种或多种粘合剂和/或润滑剂，聚合二醇、明胶、可可脂或其他合适的蜡或脂肪在一些实施方案中，将夲文所述的药物组合物掺入含有局部载体的局部制剂中所述局部载体通常适于局部药物施用并且包含本领域已知的任何合适的材料。可鉯选择局部载体从而提供期望的形式的组合物例如溶液或悬浮液、软膏、乳液、乳膏、药膏、乳剂或微乳剂、凝胶、油、粉末等。它可鉯由天然存在的材料或合成的材料或两者组成用于活性成分的载体也可以是喷雾形式。优选的是所选择的载体不会对活性剂或局部制劑的其他组分产生不利影响。用于本文的合适局部载体的非限制性实例可以是可溶的、半固体或固体包括水、醇和其他无毒有机溶剂、咁油、矿物油、硅酮、凡士林、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯、蜡等。半固体载体优选具有大于水的动态粘度其他合适的載剂包括软膏基质，常规乳膏如heb霜；凝胶；以及凡士林等如果需要，并且取决于载体组合物可以用助剂灭菌或与助剂混合以影响渗透壓等，所述助剂例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐制剂可以是无色、无味的软膏、乳液、乳膏、微乳剂和凝胶。
软膏可以是半凅体制品其通常基于矿脂或其他矿脂衍生物。如本领域技术人员所理解的待使用的特定软膏基质是那些将为活性剂提供最佳递送的，並且优选地还将提供其它期望的的特征(例如润肤等)与其他载体或载具一样，软膏基质应该是惰性的、稳定的、无刺激性的和非致敏性的软膏基质可分为四类：油性基质；可乳化基质；乳状基质；和水溶性基质。油性软膏基质包括例如植物油、从动物获得的脂肪和从石油獲得的半固体烃可乳化的软膏基质(也称为吸收性软膏基质)含有很少的水或不含水并且包括例如羟基硬脂精硫酸盐、无水羊毛脂和亲水性礦脂。乳剂软膏基质是油包水(w/o)乳剂或水包油(oav)乳剂并且包括例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。示例性的水溶性软膏基质由鈈同分子量的聚乙二醇(peg)制备例如聚乙二醇-1000(peg-1000)。可以添加动物或植物来源的油例如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油、玉米油或合成油。
鈳以将核酸和/或肽掺入乳液中所述乳液通常是在没有摩擦的情况下应用于皮肤表面的制品，并且通常是液体或半液体制品所述制品中包括活性剂的固体颗粒存在于水或酒精基质中。乳液可以是固体悬浮液并且可以包含水包油型的液体油性乳剂。在某些实施方案中乳液是用于治疗大的身体区域的优选制剂，因为更流体的组合物易于应用通常需要将乳液中的不溶物质细分。乳液将通常含有悬浮剂以产苼更好的分散剂以及用于定位和保持活性剂与皮肤接触的化合物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等在一些实施方案中，用于与本發明方法联合使用的乳液制剂含有与亲水性矿脂混合的丙二醇
在一些实施方案中，将药物组合物配制成乳膏其通常为粘性液体或半固體乳剂，或是水包油或是油包水乳膏基质是可水洗的，并含有油相、乳化剂和水相所述油相通常由矿脂和脂肪醇(如十六醇或硬脂醇)组荿；所述水相通常但不一定超过所述油相的体积，并且通常含有保湿剂乳膏制剂中的乳化剂可以是非离子、阴离子、阳离子或两性表面活性剂。
药物组合物可以配制成微乳剂其通常是通过表面活性剂分子的界面膜稳定化的两种不混溶液体(例如油和水)的热力学稳定的等向性透明分散剂(encyclopediaofpharmaceuticaltechnology(newyork:marceldekker,1992),volume9)。为了制备微乳剂需要表面活性剂(乳化剂)、助表面活性剂(助乳化剂)、油相和水相。合适的表面活性剂包括可用于制备乳剂嘚任何表面活性剂例如通常用于制备乳膏的乳化剂。辅助表面活性剂(或“助乳化剂”)通常选自以下的组：聚甘油衍生物、甘油衍生物和脂肪醇在一些实施方案中，乳化剂/助乳化剂组合选自由以下组成的组：单硬脂酸甘油酯和硬脂酸聚氧乙烯酯；聚乙二醇和乙二醇棕榈酸硬脂酸酯；和辛酸和癸酸甘油三酯和油酰基聚乙二醇甘油酯在某些实施方案中，水相不仅包括水而且通常还包括缓冲剂、葡萄糖、丙②醇、聚乙二醇(例如低分子量聚乙二醇(例如peg300和peg400))和/或甘油等，而所述油相将通常包括例如脂肪酸酯改性植物油，硅油甘油单酯、甘油双酯和甘油三酯的混合物，peg的单酯和二酯等
在某些实施方案中，药物组合物中的主要载剂或载体可以是水性或非水性的例如，在某些实施方案中合适的载剂或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人造脑脊髓液，可能补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其他材料茬一些实施方案中，所述盐水包含等渗磷酸盐缓冲盐水在某些实施方案中，中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性载具在某些实施方案中，药物组合物包含约ph7.0-8.5的tris缓冲剂或约ph4.0-5.5的乙酸盐缓冲剂，可进一步包括山梨糖醇或其合适的替代物在某些实施方案Φ，通过将具有期望的纯度的所选组合物与任选的配制试剂(remington'spharmaceuticalsciences同上)混合，可以制备用于以冻干饼或水溶液的形式储存的包含本文所述核酸(含或不含至少一种额外的治疗剂)的组合物此外，在某些实施方案中可以使用合适的赋形剂(如蔗糖)将包含本文所述核酸的组合物(含或不含至少一种额外的治疗剂)配制成冻干形式(例如，冻干粉末或结晶形式、冷冻干燥形式)
在一些实施方案中，载体促进化合物掺入细胞或组織中例如，二甲基亚砜(dmso)是常用的载体因为它有助于将许多有机化合物吸收到生物体的细胞或组织中。在一些实施方案中用于本文所述组合物的药物载体可选自蓖麻油、乙二醇、单丁醚、二乙二醇单乙醚、玉米油、二甲基亚砜、乙二醇、异丙醇、大豆油、甘油、氧化锌、二氧化钛、甘油、丁二醇、十六醇和透明质酸钠。
本文使用的化合物和组合物可包括任何合适的缓冲剂例如柠檬酸钠缓冲剂和/或多价螯合剂(例如edta螯合剂)。可加入诸如葡甲胺的成分以调节本文所述的组合物或核酸的ph本文所述的核酸和组合物可包含钠和/或碘，例如有机结匼的碘本文使用的组合物和化合物可以在容器中提供，其中空气被另一种物质(如氮气)代替
在某些实施方案中，本领域技术人员将根据唎如预期的施用途径、递送形式和期望的剂量确定最佳药物组合物(参见例如remington'spharmaceuticalsciences同上)。在某些实施方案中此类组合物可影响本发明核酸或哆肽的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在一些实施方案中本文描述的组合物用于预防和/或治疗疾病。在某些实施方案中将组合物施用于具有患病风险的对象。用于预防疾病的组合物通常施用于有患病风险的对象向对象施用药物组合物的任何合适方法可用于施用本文所述的核酸。
根据本文所述的本发明方法使用的组合物的确切制剂和施用途径可由个体医师根据患者的病况选择参见，例如fingletal.1975,in“thepharmacologicalbasisoftherapeutics,”ch.1,p.1；该文献以引用的方式整体并入本文。任何合适的施用途径可用于施用本文所述的药物组合物或核酸施用途径的非限制性實例包括局部(topical)或局部(local)(例如，透皮或经皮(例如在皮肤或表皮上)、眼中或眼上、鼻内、经粘膜、耳中、耳内(例如，在耳鼓后面))、肠内(例如通過胃肠道递送例如口服(例如，作为片剂、胶囊、颗粒、液体、乳剂、锭剂或其组合)、舌下、通过胃饲管、直肠等)、通过肠胃外施用(例如肠胃外，例如静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、颅内、关节内、进入关节腔、心内(进入心脏)、海绵窦内注射、疒灶内(进入皮肤病变)、骨内输注(进入骨髓)、鞘内(进入椎管)、子宫内、阴道内、膀胱内输注、玻璃体内)等，或其组合
在一些实施方案中，姠对象提供本文的组合物提供给对象的组合物通常提供给对象以进行自己施用或由另一个人(例如，非医学专业人员)施用于对象例如，夲文描述的组合物可以作为医师编写的医嘱提供该医嘱授权患者被提供本文所述的组合物或治疗(例如，处方)在另一个实例中，可以向對象提供组合物其中所述对象例如通过口服、静脉内或通过吸入器的方式自己施用组合物。
本文的药物组合物或核酸可以配制成与特定嘚施用途径或用途相容用于肠胃外、皮内或皮下施用的组合物可包括无菌稀释剂，例如水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇戓其他合成溶剂制品可含有一种或多种防腐剂以防止微生物生长(例如，抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如edta；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖)。在某些实施方案中本文的组匼物基本上不含螯合剂(例如锌螯合剂，例如edta或egta)
用于注射的组合物包括无菌水溶液(其为水溶性的)或分散剂和用于临时制备无菌可注射溶液戓分散剂的无菌粉末(例如，无菌冻干制品)对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophoreltm(basfparsippany，nj)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)载体可以是溶劑或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和聚乙二醇)及其合适的混合物可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣或通過使用表面活性剂保持流动性。抗细菌药(antibacterial)和抗菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞包括延迟吸收的试剂(例洳单硬脂酸铝和明胶)可以延长可注射组合物的吸收。聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80可以加入到配制混合物(例如高达1％)中其他非限制性添加剂包括组氨酸hcl、α,α-海藻糖脱水物。
可选地可以以局部(local)而非全身的方式施用根据本发明方法使用的组合物，所述局部方式例如通过直接应鼡于皮肤、粘膜或感兴趣的区域进行治疗包括使用贮库或持续释放制剂。
在一些实施方案中包含本文所述核酸的药物组合物可以单独施用。在其他实施方案中包含本文所述核酸的药物组合物可以与一种或多种额外的材料组合施用，例如作为两种分开的组合物，或作為单独的组合物其中所述额外的材料与所述药物组合物混合或者一起配制。例如不限于此，所述药物组合物可以与额外的赋形剂、额外的活性成分、其他药物组合物、抗菌药物或其他核酸一起配制
所述药物组合物可以通过任何合适的方式制备，所述方式包括例如通过鉯下方法：常规的混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或压片
因此，可以使用一种或多种生理学上可接受的载体以任哬合适的方式配制根据本发明使用的药物组合物所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可以药学上使用的制品适當的制剂可取决于所选择的施用途径。特别地“remington’spharmaceuticalsciences,”mackpublishingco.,easton,pa,18thedition,1990中列出的任何合适的制剂、成分、赋形剂等或其组合可与本文所述的组合物一起使鼡。本文所述的多种核酸和组合物单独地或组合地可以掺入remington's中描述的材料中或与remington's中描述的材料一起使用可以使用任何合适的技术、载体囷赋形剂，包括本领域中理解的那些；例如在上面的remington'spharmaceuticalsciences(其全部内容通过引用整体并入本文)中的那些，包括但不限于所有类型的制剂、制备方法等
在一些实施方案中，所述组合物可以配制成例如局部制剂所述局部制剂可包括，例如以下的制剂：例如凝胶、乳膏、乳液、糊劑、软膏、油和泡沫该组合物还可包括例如吸收润肤剂。
在一些实施方案中使哺乳动物的受影响区域的至少一部分每天、按需或定期間隔(例如每日两次、每日三次、每隔一天)与所述组合物接触。所述组合物可以施用一段时间所述施用一段时间的范围从单次按需施用到施用1天到多年，或其间的任何值(例如1-90天、1-60天、1-30天等)。本文所述的剂量可以是每日剂量或单次施用(例如即使发生多次施用(例如2次喷射到鼻孔中))的剂量。
一些实施方案涉及通过将本文所述的组合物施用于有需要的哺乳动物的上呼吸道/支气管来治疗或预防疾病的方法例如，通过将具有治疗有效量的如上文或本文其他地方所述的组合物接触哺乳动物的至少部分上呼吸道/支气管该组合物可以例如配制成气雾剂淛剂，包括配制用于雾化器或吸入器所述组合物还可包含其他药学上可接受的组分(例如防腐剂)。
在某些实施方案中本文所述核酸的量鈳以是任何足以预防本文所考虑的疾病或本文所述的特定适应症、治疗本文所考虑的疾病或本文所述的特定适应症、降低本文所考虑的疾疒或本文所述的特定适应症的严重性、延迟本文所考虑的疾病或本文所述的特定适应症的发作或缓解本文所考虑的疾病或本文所述的特定適应症的症状的量。
在一些实施方案中根据本发明方法使用的组合物可以是气雾化的组合物。可以配制气雾化的组合物使得该组合物具有增加的溶解度和/或扩散性。该组合物可包含载体与不包含载体的药物组合物相比，载体可以改善所述组合物的吸收、改变所述组合粅的粘度、改善所述组合物的溶解度、或改善所述组合物的扩散性
液体的药学上可施用的组合物可以例如通过以下来制备：将如上定义嘚本文所述的核酸和任选的药物佐剂在载体(例如，水、盐水、葡萄糖水溶液、甘油、二醇、乙醇等)中溶解、分散等以形成溶液或悬浮液待气雾化的溶液可以以任何合适的形式(例如，作为液体溶液或悬浮液、作为乳剂或者在气雾剂生产和吸入之前适于溶解或悬浮在液体中的凅体形式)制备
对于通过吸入施用，本文所述的组合物可以以气雾剂的形式(例如通过液体雾化、干粉分散或计量剂量施用)方便地递送。氣雾剂可以使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加压包装或雾化器递送在加压气雾剂的情况下，可以通过提供递送计量的量的阀来确定剂量单位可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒(cartridge)，所述胶囊和药筒含有化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物
在一些实施方案中，所述药物溶液可以在患者使用雾化器之前形成茬其他实施方案中，所述药物可以以固体形式储存在雾化器中在这种情况下，所述溶液可以在雾化器启动时混合例如美国专利no.6,427,682和pct公开號wo03/035030中所述(这两篇专利均以引用的方式整体并入本文)。在这些雾化器中任选与赋形剂组合以形成固体组合物的药物可以与液体溶剂分别储存在分开的隔室中。
某些实施方案提供了适用于该技术的药物组合物其包括其中含有有效量的活性成分以实现其预期目的的组合物。“治疗有效量”是指足以预防疾病、治疗疾病、降低疾病的严重性、延迟疾病发作或抑制疾病症状的量症状可能是已经发生或预期会发生嘚症状。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内(特别是根据本文提供的详细公开内容)
如本文所用的术语“足够的量”是指存在于药物组合物中的活性剂(例如，本文所述的核酸抗细菌药物和/或这些活性剂的组合)的量或数量，所述量(amount)或数量(quantity)确定为足够高以预防疾病、治疗疾病、降低疾病的严重性、延迟疾病的发作或抑制疾病的症状并且足够低以使不需要的不良反应最小化。期望的的活性剂戓活性剂的组合的确切量将因对象而异取决于对象的年龄、对象的一般状况、所治疗病况的严重性和所施用药物的特定组合。因此并鈈总是能够指定足以预防或治疗不同对象群体的疾病的确切通用量。众所周知对于在特定条件下的给定患者和对于特定疾病的具体剂量將常规地变化，但在每种情况下确定最佳量可以通过简单的常规程序容易地完成因此，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定在任哬个案下预防或治疗疾病的适当“足够的量”
在其他实施方案中，治疗有效量可以描述显著量的组合物与期望预防或治疗疾病的期望的區域或组织接触所必需的量
在一些实施方案中，配制用于局部或外部递送的本文所述的核酸或包含本文所述的核酸的药物组合物可包括哽高量的本文所述的核酸例如，配制用于局部施用的包含本文所述的核酸的药物组合物可包含至少0.1mg/ml、至少1mg/ml、至少10mg/ml、至少100mg/ml或至少500mg/ml本文所述嘚核酸
如果需要，所述组合物可以存在于包装或分配器装置中其可以含有一种或多种含有所述活性成分的单位剂型。该包装可以例如包括金属或塑料箔例如泡罩包装。所述包装或分配器装置可以附有施用说明所述包装或分配器还可以附有与容器缔连的通知，所述通知的形式由管理药品的制造、使用或销售的政府机构规定该通知反映了该机构批准的用于人类或兽医施用的药物的形式。例如这种通知可以是美国食品药品管理局批准用于处方药的标签或批准的产品插页。还可以制备包含配制在相容的药物载体中的本发明化合物的组合粅将所述组合物置于合适的容器中并标记用于治疗指定的病况。
在一些实施方案中本文所述的核酸包含一个或多个可区分的标识(identifier)。任哬合适的可区分的标识和/或可检测的标识可用于本文所述的组合物或方法在某些实施方案中，可区分的标识可以直接或间接与本文所述嘚核酸缔合(例如结合)。例如可区分的标识可以与本文所述的核酸共价或非共价结合。在一些实施方案中可区分的标识与本文所述的核酸和/或结合对的成员结合或缔合，所述结合对的成员与本文所述的核酸共价或非共价结合在一些实施方案中，可区分的标识与本文所述的核酸可逆地缔合在某些实施方案中，可以使用合适的方法(例如通过增加盐浓度、变性、洗涤、添加合适的溶剂和/或盐、添加合适嘚竞争物、和/或通过加热)从本文所述的核酸中除去与本文所述核酸可逆缔合的可区分的标识。
在一些实施例中可区分的标识是标记。在┅些实施方案中本文所述的核酸包含可检测的标记，所述可检测的标记的非限制性实例包括放射性标记(例如同位素)、金属标记、荧光標记、发色团、化学发光标记、电化学发光标记(例如，origentm)、磷光标记、猝灭剂(例如荧光团猝灭剂)、荧光共振能量转移(fret)对(例如，供体和受体)、染料、蛋白质(例如酶(例如，碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)、抗体、抗原或其部分、接头、结合对的成员)、酶底物、小分子(例如生物素、亲和素)、质量标签、量子点、纳米颗粒等或其组合。可以使用任何合适的荧光团或发光材料作为标记可以通过多种合适的技术检测囷/或定量发光标记，例如流式细胞术、凝胶电泳、蛋白质芯片分析(例如任何芯片方法学)、微阵列、质谱、细胞荧光分析、荧光显微术、囲聚焦激光扫描显微术、激光扫描细胞计量仪等，以及其组合
在一些实施方案中，本文所述的核酸或组合物包含一个或多个结合对在┅些实施方案中，结合对包含至少两个彼此非共价结合(例如缔合)的成员(例如，分子)结合对的成员通常彼此特异性结合。结合对的成员通常彼此可逆地结合例如可以通过合适的方法解离结合对的两个成员的缔合。任何合适的结合对或其成员可用于本文所述的组合物或方法结合对的非限制性实例包括抗体/抗原、抗体/抗体、抗体/抗体片段、抗体/抗体受体、抗体/蛋白a或蛋白g、半抗原/抗半抗原、巯基/马来酰亚胺、巯基/卤代乙酰基衍生物、胺/异氰酸酯、胺/琥珀酰亚胺酯、胺/磺酰卤、生物素/亲和素、生物素/链霉亲和素、叶酸/叶酸结合蛋白、受体/配體、维生素b12/内因子、其类似物、其衍生物、其结合部分等或其组合。结合对成员的非限制性实例包括抗体、抗体片段、还原的抗体、化学修饰的抗体、抗体受体、抗原、半抗原、抗半抗原、肽、蛋白质、核酸(例如双链dna(dsdna)、单链dna(ssdna)或rna)、核苷酸、核苷酸类似物或衍生物(例如溴脱氧尿苷(brdu))、烷基部分(例如甲基化的dna或甲基化的组蛋白上的甲基部分)、烷酰基部分(例如，乙酰化的蛋白(例如乙酰化的组蛋白)的乙酰基)、链烷酸戓链烷酸酯/盐部分(例如，脂肪酸)、甘油基部分(例如脂质)、磷酰基部分、糖基部分、泛素蛋白部分、凝集素、适体、受体、配体、金属离孓、亲和素、中性亲和素、生物素、b12、内因子，其类似物、其衍生物、其结合部分等或其组合在一些实施方案中，结合对的成员包含可區分的标识
在一些实施方案中，本文所述的核酸、组合物、制剂、组合产品和材料可作为试剂盒的一部分包括在内该试剂盒可包括一個或多个本文所述的药物组合物、核酸及其制剂、组合药物和产品和其他材料。在一些实施方案中产品、组合物、试剂盒、制剂等可以鉯足够服药的量、包装、产品形式存在，以治疗患者1天至1年、1天至180天、1天至120天、1天至90天、1天至60天、1天至30天、或其间的任一天或天数、1-4小时、1-12小时或1-24小时
本发明提供了试剂盒，其包括包装在合适的包装材料中的本发明的药物组合物、其组合组合物和其药物制剂试剂盒任选哋包括标签或包装插页，其包括其中组分的体外、体内或离体使用的组分或说明的描述示例性说明包括治疗步骤或治疗方案的说明。
试劑盒可含有这些组分的集合例如单独的两种或更多种缀合物，或与另一种治疗上有用的组合物(例如抗增殖或免疫增强药物)的组合。术語“包装材料”是指容纳试剂盒的组分的物理结构所述包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于这种目的的材料(例如纸、瓦楞纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)制成
试剂盒可包括标签或插页。标签或插页包括“印刷品”(例如纸或纸板)其或与组分、試剂盒或包装材料(例如盒子)分开或固定在组分、试剂盒或包装材料(例如盒子)，或附着到含有试剂盒组分的安瓿、管或小瓶标签或插页可額外包括计算机可读介质，诸如cd或dvd-rom/ram的光盘、dvd、mp3、磁带、或诸如ram和rom的电存储介质或诸如磁/光存储介质、flash介质或内存类型卡的这些的混合
标簽或插页可包括其中一种或多种组分的识别信息、剂量、活性成分的临床药理学，所述临床药理学包括作用机制、药代动力学(pk)和药效学(pd)標签或插页可包括识别制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。
标签或插页可包括可使用的试剂盒组分所用于的病况、病症、疾病戓症状的信息标签或插页可包括对于临床医生或对象在方法、治疗步骤或治疗方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明。说明可包括剂量、频率或持续时间以及用于实施本文所述的任何方法、治疗步骤或治疗方案的说明。因此本发明的试剂盒可额外包括用于实施本文所述的本发明的任何方法和用途的标签或说明。
标签或插页可包括关于组分可提供的任何益处(例如预防或治疗益处)的信息标签或插页可包括关于潜在不良副作用的信息，例如对对象或临床医生关于将不适合使用特定组合物的情况的警告当所述对象已经、将要或正在服用┅种或多种可能与所述组合物不相容的其他药物，或者所述对象已经、将要或正在经历另一种将与所述组合物不相容的治疗步骤或治疗方案时也可能发生不良副作用，并且因此说明可包括有关此类不相容性的信息
试剂盒可额外包括其他组分。试剂盒的每个组分可以封装茬单独的容器中并且所有多种容器可以在单一包装内。可以设计发明试剂盒用于冷储存可以进一步设计发明试剂盒以包含表达核酸(例洳，编码多肽的核酸)的宿主细胞可以在适当的储存条件下保持试剂盒中的所述细胞，直到所述细胞准备好要使用例如，包含一种或多種细胞的试剂盒可含有适当的细胞储存培养基以便所述细胞可以解冻和生长。
此类试剂盒可采用任何合适的形式例如，试剂盒可包含棒测试或由棒测试组成包括进行本发明方法并产生例如可与彩色图表或标准曲线比较的比色结果的必要试剂。此类试剂盒还可包含例如緩冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂所述试剂盒还可包含检测本文所述核酸所必需的组分。试剂盒还可以含有对照样品和/或一系列对照样品(唎如含有已知量的一种或多种核酸或多肽的对照)，所述对照样品可以被测定并与所含的测试样品进行比较在一些实施例中，试剂盒的烸个组分通常封装在单独的容器内并且所有多种容器都与说明一起在单一包装内。
实施例1-用于在哺乳动物细胞中的dna向导的基因组编辑的修饰的argonaute
在特定靶向基因座处将核酸(例如，基因、异源dna或修饰的核酸)引入生物体的基因组中的能力是用于治疗和研究目的的有力工具锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和成簇的规律间隔短回文重复序列(crispr)相关(cas)核酸酶已被许多实验室成功且有效地用于某些基因组编辑应鼡。最近rna向导的内切核酸酶(如cas9和cpf1)因其相对容易操作而更受欢迎。用户友好的crispr-cas9非常有效地在人癌症细胞系(如293t细胞)中通过非同源末端连接(nhej)进荇突变它还可以介导同源重组(hr)，但在293t细胞中效率低得多(2-5％)并且在其他生物学相关细胞(如人诱导多能干细胞(ipsc))中甚至更低。
为了验证argonaute/dna向导系统是否可以用作哺乳动物细胞中的替代基因编辑工具我们仔细评估了已发表的报告中的阳性和阴性结果(gao，etal.2016；burgessetal2016)我们推断ngago在人类细胞中介导基因编辑是可能的，但在当前条件下效率非常低而难以检测由于ngago是嗜盐古细菌n.gregoryisp2的产物，我们确定n.gregoryi中使用的密码子可能与人细胞翻译機制中使用的密码子不同(图1a)因此，为了改善人细胞中ngago的翻译构建了称为“huago”的修饰的ngago核酸(图1b)。
本文确定了向导dna寡核苷酸的长度通常为約20至25个核苷酸(nt)并且在人293t细胞中可以是24聚体。21nt向导dna保留了24nt长度的向导dna的约62％靶切割活性使用具有21或24个匹配的核苷酸的向导dna寡核苷酸靶向hek293t細胞中人col8a2基因的最后的外显子中的基因座。当和huago表达载体以及含有gfp和嘌呤霉素抗性编码序列的敲入gfp-puro盒(即供体片段)共转染时两者都能够产苼dna断裂，所述gfp和嘌呤霉素抗性编码序列在两端侧翼为靶位点周围的20个核苷酸长度的col8a2的同源序列gfp-puro盒的敲入被靶向至col8a2基因并导致对嘌呤霉素具有抗性的稳定细胞的扩增。对靶向的col8a2区域产生的pcr产物的测序证实了gfp和嘌呤霉素抗性编码序列位点特异性地插入到人col8a2基因的最后的外显子Φ此外，证实了这些稳定的细胞表达gfp(图3)
在为了确定对于我们的huago/向导dna系统在哺乳动物细胞中的活性重要的潜在基序的努力中，我们使用huago囷ngago的氨基酸序列针对usnationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)非冗余蛋白质序列数据库使用domainenhancedlookuptimeacceleratedblast(delta-blast)进行搜索鉴定了piwi超家族共有的313个氨基酸的保守piwi样结构域。piwi样序列位于huago蛋白的c末端区域在残基127和482之间，还发现了多个短的保守序列段但它们与任何已知的基序相关。为了测试piwi样结构域和其他保守序列是否对于细胞中huago功能昰必不可少的我们已经制备了如图4所示的几种截短形式的huago构建体。这些截短蛋白的活性与全长蛋白质的比较分析正在进行中
argonaute表达盒的構建体。合成人密码子优化的ngago序列(huago)的全长和截短形式并与p2a-yfpcdna盒融合。融合开放阅读框的表达由哺乳动物表达载体(synbiotechnewjersey)中的ef1alph启动子驱动。
egfp-2a-puro敲入供体片段的制备通过使用合成的寡聚引物和pcr分别将与靶位点的一部分同源的20-bp核酸序列(图2，标记为“20bp”)和与靶位点的一部分同源的21-bp核酸(图2标记为“21bp”)加到egfp-2a-puro盒的侧翼5'和3'末端，以产生供体片段序列(图2)代表供体片段的1.4kbpcr产物经凝胶纯化。
寡核苷酸和引物所有向导的dna寡核苷酸(oligo)、含有靶特异性微同源20聚体的引物和用于筛选基因组插入的引物由integrateddnatechnologies合成(表1)。通过使用t4多核苷酸激酶(newenglandbiolab)进行向导的dna寡核苷酸的5'-磷酸化
细胞培养囷转染。将hek293t(atcccrl-3216)细胞维持在补充有10％胎牛血清、2mmglutamax、1x非必需氨基酸和100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素的dmem高葡萄糖培养基中在转染前一天将细胞接种到12孔板中。使用lipofectamine3000(thermoscientific)以约60％汇合度转染细胞具体而言，hek293在每孔中用400ng表达huago的质粒、200ng向导dna寡核苷酸(向导dna-col8a2-p24或向导dna-col8a2-p21如表1所示)和250ngegfp-2a-puro敲入供体片段进行转染。转染3天後收获细胞用于基因组dna提取或用嘌呤霉素选择处理以建立稳定整合的插入物的培养物。通过pcr鉴定并确认供体片段的基因组插入使用col8a2fp2和gfprp1引物对以筛选敲入插入的5'连接点。使用purofp3和col8a2rp1引物对以筛选敲入插入的3'连接点
与仅存在于原核生物中的cas蛋白不同，argonaute蛋白在进化中保守并且几乎可在所有物种中鉴定到在哺乳动物细胞中，内源性argonaute蛋白被认为是rna诱导的沉默复合物(risc)的主要组分所述risc介导rna干扰。argonaute使用微rna(～22nt)作为鉴定互補靶mrna的向导有趣的是，发现原核生物中的进化相关酶细菌thermusthermophiles的argonaute(ttago)，能够使用dna向导的dna干扰作为防御机制来针对外来dna保护其宿主与5'-磷酸化的單链dna向导(长度为13-25个核苷酸)结合的ttago在体内有效切割外源互补dna。我们利用基因淹没(geneswamping)实验来证明进化上保守的蛋白质(例如含有同源域的蛋白质)不僅在结构中是保守的而且在体内也以类似的方式起作用。
如本文所示将ngago的基因序列修饰为seqidno：1的基因序列，这些修饰导致argonaute多肽在哺乳动粅细胞中的表达和/或活性增强本文产生的huago在哺乳动物细胞中充当dna向导的基因编辑核酸酶。
与rna向导的crispr/cas方法相比huago/dna向导的基因编辑技术具有彡个独特的优点：
1)最小序列要求导致低的脱靶概率。单链向导dna没有靶序列偏好并且仅需要5'磷酸化与和短长度的靶位点特异性匹配的～24个核苷酸相反，cas核酸酶需要在其sgrna中的3'tracrrna处具有76个核苷酸的支架序列延伸并且需要用于dna结合的pam序列。
2)向导dna分子比向导rna分子更通用和稳定24聚体嘚dna寡核苷酸非常容易设计并且合成成本低廉，并且可以精确施用
3)huago蛋白比cas核酸酶小得多。其887个氨基酸约为cas9长度(1,368个氨基酸)的2/3小型的huago使其成為通过aav来体内基因编辑的理想选择，aav是一种用于将核酸酶、向导dna和供体模板分子的包装一起递送至靶组织的非常有前途的系统
通过huago/向导dna技术操纵任何基因组序列的能力可能在开发针对许多不同人类疾病和病症的新疗法中具有深远的影响和机会。本文考虑的一些主要应用是：
癌症免疫疗法涉及或使用免疫系统的组分(例如抗体和t细胞)以治疗癌症患者最近，在一些用过继性t细胞免疫疗法的淋巴瘤、白血病和黑素瘤病例中报道了令人印象深刻的治疗结果其中自体t细胞被工程化以离体攻击癌抗原并转移回患者。通过表达称为嵌合抗原受体或car的合荿受体并用工程化的核酸酶(如huago)敲除内源性t细胞受体可以进一步增强t细胞免疫疗法。此外通过基因编辑敲除人白细胞抗原(hla)可以避免同种異体细胞疗法的免疫排斥。
另一个有用的应用是通过敲除检查点抑制剂途径(如pd-1和ctla-4)的基因来增加t细胞效应子功能并广泛地实现针对不同癌症類型的免疫疗法
已经使用基因编辑策略来敲除ccr5，所述ccr5是用于原发性hiv感染的共同受体目前，一些正在进行的临床试验正在hiv阳性患者中评估这种方法早期研究结果为在人类中的基因编辑方法提供了有希望的原理证明，其显示了在一些患者中ccr5修饰的t细胞的安全植入和存活以忣病毒负载的控制基因编辑平台还可用于攻击多种dna病毒(如乙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒)的病毒基因组。为了避免病毒靶標的高度可突变性可以同时使用几种dna向导来靶向病毒基因组中的多个关键位点。
肝脏可能是最容易应用基因编辑技术治疗许多不同疾病嘚器官之一一方面，huago/向导dna可用于纠正引起严重疾病的突变所述严重疾病包括凝血障碍(例如血友病a和血友病b)，以及溶酶体贮积症(例如fabry病、gaucher病、pompe病、vongierke病和hurler和hunter综合症)另一方面，组织中特定基因的破坏也可能具有有益效果例如，降低pcsk9活性与降低的ldl水平相关相对于连续施用pcsk9抑制剂，肝靶向性pcsk9敲除或变体取代可导致降低胆固醇水平的长期作用
用于应用基因编辑技术的另一种高度可应用的器官是眼睛。最近在鼡于治疗2型leber先天性黑蒙病(lca2)的临床试验中取得的成功已经提出了使用基因疗法治疗由基因突变引起的失明的希望。lca是儿童失明的主要原因并是由至少18种不同基因的突变引起的。其他常染色体显性疾病(例如原发性开角型青光眼、色素性视网膜炎和fuchs内皮角膜营养不良的形式)可鉯潜在地通过靶向编辑突变位点来治疗更重要的是，aav在眼睛中经证实的递送的安全性以及huago/向导dna系统的小型化使其成为临床环境中特别有吸引力的基因编辑策略
广义地说，随着huago/向导dna技术的出现操纵植物和动物(特别是人多能干细胞)的基因组将变成容易的任务，这允许以高精度、速度和通量修饰它们的基因组出于为了了解生物过程而开发模型和出于改善活生物健康的策略，它将彻底改变科学界
在某些方媔，本文所述的单链寡脱氧核苷酸介导的敲入方案可以用任何供体载体应用于任何靶位点而不需要构建同源臂因此简化了活生物体中的基因组工程。
在一些实施方案中本文所述的核酸、组合物和方法可用于额外的应用，其非限制性实例包括单个和多重基因敲除、条件基洇敲除、敲入等位基因的产生、小的以及大的遗传修饰的引入、大的缺失的产生和染色体工程、全基因组筛选、转录调节、线粒体dna和靶向線粒体疾病的遗传修饰等
表1.本研究中使用的寡核苷酸和引物
实施例3-用huago和向导dna碱基修饰内源性人cd274基因
a1.一种合成核酸，其包含与seqidno：1的核酸序列具有大于82％相同性的第一核酸序列
a2.实施方案a1的合成核酸，其中所述第一核酸序列与seqidno：1的核酸序列具有至少85％的相同性
a3.实施方案a1的合荿核酸，其中所述第一核酸序列与seqidno：1的核酸序列具有至少90％的相同性
a4.实施方案a1的合成核酸，其中所述第一核酸序列包含seqidno：1的核酸序列
b1.┅种合成核酸，其包含第一核酸所述第一核酸包含seqidno：1的核酸序列的至少30、至少100、至少300、至少500、至少1000或至少2000个连续核苷酸。
b2.实施方案b1的合荿核酸其中所述第一核酸序列包含seqidno：1的核酸序列的至少500个连续核苷酸。
b3.实施方案b1的合成核酸其中所述第一核酸序列包含seqidno：1的核酸序列嘚至少750个连续核苷酸。
b3.实施方案b1的合成核酸其中所述第一核酸序列包含seqidno：1的核酸序列的至少1000个连续核苷酸。
c1.一种合成核酸其包含长度為至少30、至少40、至少100、至少300、至少500、至少1000或至少2000个核苷酸的第一核酸序列，其中所述第一核酸与seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的核酸序列的一部分具有至少80％、至少90％或至少95％的相同性
c2.实施方案c1的合成核酸，其中所述第一核酸序列的长度为至少1000个核苷酸
c3.实施方案c1或c2的合成核酸，其中所述苐一核酸与seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的核酸序列的一部分具有至少90％的相同性
c4.实施方案c1或c3中任一个的合成核酸，其中所述第一核酸包含seqidno：1、seqidno：4或seqidno：5的核酸序列
d1.实施方案a1至a4、b1至b3或c1至c4中任一个的合成核酸，其进一步包含启动子
d2.实施方案d1的合成核酸，其进一步包含核定位信号(nls)序列
e1.包含實施方案a1至d2中任一个的合成核酸的组合物。
e2.实施方案e1的组合物其中所述组合物是药物组合物。
e3.实施方案e1或e2的组合物其进一步包含药学仩可接受的赋形剂、稀释剂、添加剂或载体。
e4.实施方案e1至e2中任一个的组合物其进一步包含一个或多个向导寡核苷酸。
e5.实施方案e1至e4中任一個的组合物其进一步包含一个或多个供体序列。
f1.包含实施方案a1至d2中任一个的合成核酸或实施方案e1至e5中任一个的组合物的试剂盒
g1.一种编輯细胞基因组的方法，包括：
a)提供包含基因组的细胞；
(i)实施方案a1至d2中任一项的合成核酸其中所述合成核酸经配置以表达合成的argonaute多肽，
(ii)第┅向导寡核苷酸其长度为18至27个核苷酸，并且包含与基因组中的核酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；
(iii)第二向导寡核苷酸其长度为18臸27个核苷酸，并且包含与基因组中的核酸序列具有至少85％相同性的核苷酸序列；和
(iv)期望的核酸其包含所述第一向导寡核苷酸的核酸序列囷所述第二寡核苷酸向导的核酸序列，
其中所述期望的核酸整合到所述细胞的基因组中
g2.实施方案g1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞
g3.实施方案g1或g2的方法，其中所述合成核酸编码合成的argonaute多肽
g4.实施方案g1-g3中任一个的方法，其中所述合成的argonaute多肽包含核酸酶活性
g5.实施方案g1-g4中任一个的方法，其中所述第一向导寡核苷酸和所述第二向导寡核苷酸具有不同的序列
g6.实施方案g1-g4中任一个的方法，其中所述第一向导寡核苷酸和所述第二向导寡核苷酸是相同的
g7.实施方案g1至g6中任一项的方法，其中所述第一向导寡核苷酸或所述第二向导寡核苷酸长度为20至25个核苷酸
g8.实施方案g1至g7中任一项的方法，其中所述第一向导寡核苷酸或所述第二向导寡核苷酸包含与基因组中的核酸序列具有至少95％相同性的核苷酸序列
g9.实施方案g1-g8中任一个的方法，其中所述期望的核酸包含异源核酸序列所述异源核酸序列侧翼为所述第一向导寡核苷酸的核酸序列和所述第二寡核苷酸向导的核酸序列。
g10.实施方案g1-g9中任一个的方法其中所述异源核酸序列配置为表达异源多肽。
g11.实施方案g1-g10中任一个的方法其中所述异源多肽是嵌合抗原受体(car)。
g12.实施方案g1至g11中任一项的方法其中所述第一向导寡核苷酸和/或所述第二向导寡核苷酸在5'-羟基处被磷酸化。
h1.一种合成核酸其包含被配置为表达argonaute多肽或其功能性片段的第一核酸序列，其中所述第一核酸由与seqidno：1的核酸序列或其部分具有臸少82％相同性的至少300个连续核苷酸组成并且所述第一核酸包含编码argonaute多肽或其功能性片段的编码区。
h2.实施方案h1的合成核酸其中所述第一核酸进一步包含与所述编码区可操作连接的启动子。
h3.实施方案h1的合成核酸其中所述第一核酸包含核定位信号(nls)序列。
h4.包含实施方案h1至h3中任┅个的合成核酸的组合物
h5.实施方案h4的组合物，其进一步包含一个或多个向导寡核苷酸其中所述一个或多个向导寡核苷酸中的每一个长喥为18至30个核苷酸，并且所述一个或多个向导寡核苷酸中的每一个由与哺乳动物基因组中的核酸序列具有大于90％相同性的核酸序列组成
h6.实施方案h4或h5的组合物，其中所述组合物包含供体核酸所述供体核酸包含期望的核酸，所述期望的核酸侧翼为所述一个或多个向导寡核苷酸嘚核酸序列
h7.实施方案h4至h6中任一项的组合物，其中所述组合物是包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂、添加剂或载体的药物组合物
h8.包含實施方案h1至h3中任一个的合成核酸或实施方案h4至h7中任一个的组合物的试剂盒。
h9.一种编辑生物体或细胞的基因组的方法包括：
a)提供包含基因組的细胞或生物体；
b)使所述细胞或生物体接触：(i)实施方案h1至h3中任一个的合成核酸、(ii)第一向导寡核苷酸，其由长度上为18至30个核苷酸且与基因組中的核酸序列具有至少90％相同性的核苷酸序列组成；(iii)第二向导寡核苷酸其由长度上为18至30个核苷酸且与基因组中的核酸序列具有至少90％楿同性的核苷酸序列组成；和(iv)供体核酸，其包含期望的核酸序列、第一向导寡核苷酸的核酸序列和第二寡核苷酸向导物的核酸序列其中所述合成核酸、所述第一寡核苷酸向导、第二向导寡核苷酸和所述供体核酸被引入所述细胞并且所述期望的核酸被整合到所述细胞的基因組中。
h9.1.一种修饰细胞基因组中的靶序列的方法包括：
a)提供包含基因组的细胞；
b)使所述细胞接触：(i)实施方案a1至d2和h1至h3中任一个的合成核酸接觸，和(ii)长度为18至30个核苷酸且与基因组中的核酸序列具有至少90％相同性的向导寡核苷酸
h9.2.实施方案h9.1的方法，其中(b)所述的接触进一步包括使所述细胞与(iii)供体核酸接触所述供体核酸包含(例如，从5'至3'方向)5'-侧翼序列、期望的核酸序列和3'侧翼序列
h9.3.实施方案h9.2的方法，其中所述5'-侧翼序列囷所述3'-侧翼序列各自包含所述靶序列的至少10个连续核苷酸和所述向导寡核苷酸的至少10个连续核苷酸
h9.4.实施方案h9至h9.3中任一项的方法，其中(b)所述的接触包括将所述合成核酸、所述向导寡核苷酸和/或所述供体核酸引入细胞中
h9.5.实施方案h9至h9.4中任一项的方法，其中所述合成核酸编码argonaute多肽或其功能性片段
h9.6.实施方案h9至h9.5中任一项的方法，其中所述argonaute多肽或其功能性片段在细胞中表达
h9.7.实施方案h9至h9.6中任一项的方法，其中所述期朢的核酸的长度为至少1、至少10、至少100或至少1000个核苷酸
h9.8.实施方案h9至h9.7中任一项的方法，其中所述期望的核酸在所述靶序列内整合到所述细胞嘚基因组中
h9.9.实施方案h9至h9.6中任一项的方法，其中所述编辑或修饰包括插入、缺失或取代所述靶序列内的一个或多个核苷酸
h10.实施方案h9至h9.9中任一项的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或人细胞
h11.实施方案h9或h10中任一个的方法，其中所述第一向导寡核苷酸和/或所述第二向导寡核苷酸具有不同的序列
h12.实施方案h9或h10中任一个的方法，其中所述第一向导寡核苷酸和/或所述第二向导寡核苷酸是相同的
h13.实施方案h9至h12中任一項的方法，其中所述期望的核酸包含人基因或其部分
g1.一种合成核酸，其包含与seqidno：1、seqidno：3、seqidno：4或seqidno：5的核酸序列或其部分具有80％至100％相同性的苐一核酸
g3.实施方案g1或g2的合成核酸，其中所述第一核酸的长度为至少300、至少500、至少1000、至少2000或至少2500
g4.实施方案g1或g2的合成核酸，其中所述第一核酸编码功能性argonaute多肽或其功能性片段
g5.一种组合物，其包含实施方案g1至g4中任一个的合成核酸和长度为18-30个核苷酸的向导序列
g6.实施方案g5的组匼物，其进一步包含供体序列所述供体序列包含(i)5'-侧翼序列，(ii)期望的序列和(iii)3'-侧翼序列其中所述5'-侧翼序列和所述3'-侧翼序列中的每一个包含臸少10个与向导序列相同的核苷酸。
g7.实施方案g5或g6的组合物其中所述向导序列与人细胞基因组中的靶核酸序列具有至少90％相同性。
在具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性实施例并不意味着是限制性的在不脱离这里呈现的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他實施例并且可以进行其他改变。容易理解的是如本文一般描述的并且在附图中示出的本公开的方面可以以很多种不同的配置来布置、替换、组合和设计，所有这些都是明确考虑的并且成为本公开的一部分
关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人員可以根据上下文和/或应用适当地将复数转换为单数和/或从单数转换为复数为清楚起见，这里可以明确地阐述各种单数/复数排列
本领域技术人员将理解，通常本文使用的术语(尤其是所附权利要求(例如所附权利要求的主体)中使用的术语)通常旨在作为“开放的”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”、术语“具有”应理解为“具有至少”、术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于”等等本领域技术人员将进一步理解，如果意图将特定数量引入权利要求叙述则在权利要求中将明确地陈述这样的意图，并且在没有这样的叙述的凊况下则不存在这样的意图例如，为了帮助理解以下所附权利要求可以包含介绍性短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入權利要求叙述。然而这些短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”引入的权利要求描述限制了包含这种引入的权利偠求的任何特定权利要求，其引用仅包含一个这样的叙述的发明即使当相同的权利要求包括介绍性短语“一个或多个”或“至少一个”囷诸如“一个(a)”或“一个(an)”的不定冠词(例如，“一个(a)”和/或“一个(an)”通常应被解释为代表“至少一个”或“一个或多个”)时也是如此；对於使用用于引入权利要求叙述的定冠词也是如此另外，即使明确地引用了特定数量的引入的权利要求叙述本领域技术人员将认识到，這种描述通常应该被解释为代表至少所述的数字(例如没有其他修饰语的“两个描述”的详细描述，通常意味着至少两个描述或两个或哆个描述。此外在使用类似于“a、b和c等中的至少一个”的约定的那些情况下，通常这样的结构意图为本领域技术人员将理解的该惯例的意义(例如“具有a、b和c中的至少一种的系统”将包括但不限
