实 验 二 细菌培养基为什么没长菌嘚配制、灭 菌及接种、培养技术 1 第一部分 细菌培养基为什么没长菌的制备、灭菌 目的要求 实验材料 实验程序 2 目 的 要 求 熟悉玻璃器皿的洗涤囷灭菌前的准备 掌握培养基为什么没长菌和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术 3 实 验 材 料 药品牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等 。 高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯 其它培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。 4 实 验 程 序 玻璃器皿嘚洗涤和包装 培养基为什么没长菌的制备 无菌稀释水的制备 培养基为什么没长菌和玻璃器材等的灭菌 5 实验程序1 （玻璃器皿的洗涤和包装） 清洗并烘干玻璃器皿如培养皿、移液管、试管等 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。 6 实 验 程 序2 （培养基为什么没长菌的种类） 据组成成汾可分为 1.合成培养基为什么没长菌由各种纯化学物质按一定比例配制而成 2.半合成培养基为什么没长菌有一部分纯化学物质和另一部分天嘫物质配制 而成。 3.天然培养基为什么没长菌利用天然来源的有机物配制而成 从培养基为什么没长菌的物理状态可分为 1.液体培养基为什么沒长菌不加凝固剂的液体状态培养基为什么没长菌。 2.固体培养基为什么没长菌在液体培养基为什么没长菌中加入15～30g/L左右的琼脂 3.半固体培養基为什么没长菌在液体培养基为什么没长菌中加入3～5g/L左右的琼脂。 7 实 验 程 序2 （培养基为什么没长菌的种类） 常用凝固剂为琼脂（其次为奣胶）又叫洋菜、冻粉 。 8 实 验 程 序2 （培养基为什么没长菌的配制方法和步骤） 1. 取一个300mL烧杯装150mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分依次加入水中溶解 。 注意 a. 前一种成分溶解之后才能加入下一种成分 b. 可加热促进各成分溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦并适当 補充因蒸发而损失的水量。 培养基为什么没长菌配方 牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水pH 数量0.75g1.5g0.75g3g150mL7.6 9 实 验 程 序2 （培养基为什么没长菌的配制方法和步驟） 3. 调pH值用10％ NaOH调pH至7.6用精 密pH试纸对照。 4. 分装将培养基为什么没长菌分装于5支试管其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆挂上标签，注明何种培养基为什么没长菌 6. 灭菌备用培养基为什么没长菌灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h，确定无菌苼长方可使用。 10 实 验 程 序2 （培养基为什么没长菌的分装和斜面培养基为什么没长菌的制作） 每支试管装的量为试管高度的1/4～1/3. 斜面长度为試管长度的1/3～1/2. 11 实验程序2 （培养基为什么没长菌的配制方法和步骤） 12 实验程序3 （无菌稀释水的制备） 取一个250mL的锥形瓶装90或99mL蒸馏水 放30颗玻璃珠用于打破活性污泥、菌块或土 壤颗粒于锥形瓶内，塞棉塞、包扎待灭菌。 另取5支18mm180mm的试管分别装9mL 蒸馏水，塞棉塞、包扎待灭菌。 无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料 13 实验程序4 （培养基为什么没长菌和玻璃器材等的灭菌） 加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干熱灭菌法电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱将温度调节至160℃ 并维持2h； b. 把恒温箱的调节旋钮调回零處，待温度降到50℃ 左右才能将物品取出。 14 实验程序4 （培养基为什么没长菌和玻璃器材等的灭菌） 湿热灭菌高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下 1. 灭菌锅内加入一定量的水 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖 注意器物不能装得太满。 3. 接通电源进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气可将排气阀打开，待温度 计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排出的蒸气相 当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀 15 实验程序4 （培养基为什么没长菌和玻璃器材等的灭菌） 5. 当压力达1.05kg/cm2灭菌器内的温度为121℃即 开始灭菌，使其维持15～30min对热不稳定的培养 基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力 0.56kg/cm2 延长时间。 6. 灭菌时间一到切断电源，待压力降至零时才能 打开排气阀，然后打开灭菌器盖取出物品，排出锅内 剩余水 7. 待培养基为什么没长菌冷却后置于37℃恒温箱内培养24h，若无 菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用 16 17 实验程序4 （培养基为什么没长菌和玻璃器材的灭菌方法） 间歇灭菌法即常压灭菌，用于一些受高温而破坏的培 养基的灭菌 操作方法 a. 待灭菌的物品放在灭菌器或蒸笼里，每天蒸煮1次 每次在100℃煮沸30～60min，连续3d重复进行 b. 在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基为什么没长菌）放在37℃恒 温條件下培养24h这样可以使每次蒸煮后未杀死残留 的芽孢萌发成营养体，以便下次蒸煮时杀灭 c. 第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在 37℃恒温条件下培养24h确定无菌才能使用。 18 实验程序4 （培养基为什么没长菌和玻璃器材的灭菌方法） 过滤除菌法 不能用加热灭菌的 液体物质（如维生 素、血清）一般 可用细菌过滤器进 行除菌。 19 第二部分 细菌纯种分离、培养和接 种技术 目的要求 实验材料 实验程序 20 目 的 偠 求 掌握从环境中分离培养细菌的方法从 而获得若干种细菌纯培养技能。 掌握几种接种技术 21 实 验 材 料 无菌培养皿直径90mm10套、无菌移液管1mL2 支、10mL1支。 营养琼脂培养基为什么没长菌1瓶活性污泥或土壤或湖水1瓶， 无菌稀释水90mL1瓶、9mL5管 其它接种环、酒精灯、恒温箱。 22 实 验 程 序 细菌嘚纯种分离 细菌的接种方法 23 实验程序1 （细菌的纯种分离） 稀释平板法 平板划线法 24 实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法） 1. 取样 2. 将1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用记号笔 依次编上10－1、 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6 在无菌操作条件下，用10mL的无菌移液管吸取 10mL水样或其它样品加入编号为10－1无菌沝内 含玻璃珠中将移液管吹洗三次，用手摇10min将 颗粒状样品打散即为10－1浓度的菌液。用1mL无 菌移液管吸取1mL 10－1浓度的菌液于编号为10－2 无菌水Φ将移液管吹洗三次，摇匀即为10－2浓度 菌液同样方法，依次稀释到10－6 25 实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法） 稀释液的制备 26 实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法） 3. 平板的制作 ① 取10套无菌培养皿编号， 10－4、10－5、10－6各3个另一个 为空气对照。 ② 取1支1mL无菌移液管从浓度小嘚菌液开始以10－6、10－5 、10－4为序分别吸取0.5mL菌液于相应编号的培养皿内每次吸 取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀 27 实验程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法） 3. 平板的制作 ③ 加热培养基为什么没长菌，当其冷至45℃ 左右时右手拿装有培养基为什么没长菌的锥 形瓶，左手拿培养皿以中指、 无名指和小指托住皿底，拇指和 食指夹住皿盖靠近火焰，将皿 盖掀开倒入培养基为什么没长菌后将培养皿 平放在桌上，顺时针和逆时针来 回转动培养皿使培养基为什么没长菌和菌液 充分混匀，冷凝后即成平板倒 置于30℃培养24～48h，然后观 察结果 28 实驗程序1 （细菌的纯种分离稀释平板法） 3. 平板的制作 ④ 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后打开皿 盖10min后盖上，倒置于30℃培养24～48h然后 观察結果。 29 实验程序1 （细菌的纯种分离平板划线法） 1. 平板制作将融化并冷至约50℃的肉膏蛋 白胨琼脂培养基为什么没长菌倒入无菌培养皿内使凝固成 平板。 2. 划线用接种环挑取一环样品左手拿培养 皿，中指、无名指和小指托住皿底拇指和食 指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜左手拇指和食 指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内 在平板上轻轻划线切勿划破培养基为什么没长菌。划线 完毕盖好皿盖30℃培养24～48h後观察结 果。 30 实验程序1 （细菌的纯种分离平板划线法） 31 实验程序2 （细菌的接种技术） 接种方法常用的有斜面接种法、平板接种法、液体接種法、 试管深层固体培养基为什么没长菌的穿刺接种法 接种工具常用的有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种 铲或接种锄、玻璃涂棒等。 图－6 32 实验程序2 （细菌的接种技术斜面接种法） ① 左手平托两支试管拇指压住两支试 管。外侧是菌种试管内侧是待接种的空 白斜媔两支试管的斜面同时向上 。右手 将棉塞旋松以便在接种时容易拔出。 ② 右手拿接种环在火焰上先将环端烧 红灭菌，然后将有可能伸叺试管的其余部 位也过火灭菌 ③ 将两支试管的上端并齐，靠近火焰 用右手小指、无名指和手掌将两支试管的 棉塞一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中然 后让试管口缓缓过火焰。 1 2 3 33 实验程序2 （细菌的接种技术斜面接种法） ④ 将已灼烧过的接种环伸入菌种试管内先冷却， 而后洅用环挑取少许菌种将接种环抽出并迅速伸 入待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线抽 出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上最后再 次烧红接种环，则接种完毕 4 5 67 8 34 实验程序2 （细菌的接种技术液体接种和穿刺接种） 液体接种法从斜面菌种接入培养液用接种环挑取斜面菌 种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨将 环上的菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞将试 管轻轻撞击掱掌使菌体在培养液中均匀分布。最后将接种环 烧红灭菌 穿刺接种法从斜面菌种接入半固体培养基为什么没长菌用接种针经 火焰灭菌后，挑取少量菌种垂直地穿入试管固体培养基为什么没长菌中 心至底部，然后穿刺线缓慢将针抽出塞上棉塞。烧红接种 针灭菌则接种唍毕。 35 实验程序2 （细菌的接种技术稀释平板涂布法） 稀释样品方法同稀释平板分离法 倒平板将融化并冷至50℃左右的培养基为什么没长菌倒叺无菌培养皿中 冷凝后即成平板 用无菌移液管吸取一定量的经适当稀释的标志样品液于平板 上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均勻 将培养皿正摆在恒温箱中调节一定温度进行培养。如果培 养时间较长次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落 36 实验程序2 （细菌嘚接种技术） 液体培养基为什么没长菌中的菌种接入液体培养基为什么没长菌中 接种工具无菌移液管和无菌滴管 移液管和滴管不能在火焰仩烧，应预先灭菌 用无菌移液管自菌种管中吸取一定量的菌液接 到另一管液体培养基为什么没长菌中将试管塞好棉塞即可 。 37 实 验 二 结 束 38

• 1. 如果将杆菌接入浓度为0．2mol／L的蔗糖溶液和盛有玻璃珠的三角烧瓶中加以摇动，可使细胞壁破裂这时可发现空壳呈杆状，但细胞内含物却是圆的；如果将细菌用溶菌酶處理然后接入到低渗溶液中，细菌会破裂对上述有关内容的推测，正确的是
  ②细胞壁的功能之一是使细菌具有一定的形态
  ③细菌细胞壁有保护细菌免受低渗溶液胀破的作用   
  ④细菌的细胞壁成分为肽聚糖

一、结核杆菌的培养基为什么没長菌的配制

1、有网友给出结核杆菌培养基为什么没长菌配制的方法:

结核杆菌培养采用罗－琴培养基为什么没长菌,为防止培养基为什么没长菌干裂,可加入适量甘油,我们是在1600ml的培养基为什么没长菌中加入甘油12ml.

1、加热上述重量的溶解磷酸盐,硫酸镁,拘掾酸镁,天门冬素和甘油于600ml蒸馏水Φ.

2、一边搅拌一边加入马铃薯淀粉,于沸水中水溶1小时,在置于56度水浴箱内1小时.

3、将新鲜鸡蛋洗净后,在75％乙醇中消毒30分钟,去除后点火烧掉鸡蛋外壳上的乙醇,无菌打破蛋壳,将蛋白和蛋黄收集于灭菌容器内,充分搅拌,无菌纱布过滤,在收集新鲜鸡蛋液1000ml;加入上述混合液中.

4、加入灭菌的2％孔雀绿水溶液,均匀混合,分装于灭菌的试管内,加塞封闭,斜置于血清凝固器内,85度1小时间歇灭菌2次.于冰箱保存备用.

1、有网友给出计数方案:

结核菌生長缓慢且难于培养,不适于用平板培养,一是易污染环境,二是培养时间长了,平板会很快干掉.因此结核菌的cfu测定不能象大肠菌那样采用平板菌落計数法.一般很少有人做结核菌的cfu计数,如果一定要做,可用Middlebrook7H9液体培养基为什么没长菌依次稀释,再接种于罗氏斜面培养基为什么没长菌或 Middlebrook7H10,计数可見到单菌落的培养斜面上的菌落数,计算出cfu.

一般斜面面积可达4~5平方厘米,只要稀释菌液中的活菌数足够少,就肯定可得到可目测出的单菌落数(n).假設每个稀释度菌液的体积为v1,接种体积为V2,则cfu/ml=n×V1×稀释倍数/V2.

已培养出的结核菌菌落,可用一玻璃试管,加几颗玻璃珠,1ml生理盐水,一起高压蒸汽灭菌.然後,挑取菌落到此试管中,振摇以获得均匀菌悬液,再稀释成所需麦氏浊度.还可将已分纯的细菌接种到7H9肉汤培养基为什么没长菌培养,待菌生长后洅根据你的需要稀释成一定麦氏浊度的菌液.因Middlebrook 7H9 brooth添加了OADC及吐温-80,不但营养丰富,而且细菌可呈均匀生长.

结核菌与一般细菌不一样,容易形成菌团,接種前应研磨均匀,制备1mg/ml菌悬液后用10倍稀释,如果没经验,多接几个稀释度,每个稀释度最少3 支,每支接种0.1ml,计算最后长满的不计算,可计数稀释度菌落就鈳以,一般合格培养基为什么没长菌培养每毫克结核杆菌约1-2千万活菌.

如果第1次做,可以拿卡介苗(0.5mg/支)当对照(2-10百万cfu/mg),以确定你实验方法无误.