汞蒸气对波长253.7nm的紫外光具有强烈的吸收作用试样经适当处理后，将各种形态的汞转变成汞离子用氯化亚锡将汞離子还原成元素汞，再用测汞仪进行测定汞浓度与吸收值成正比。

加氧燃烧-冷原子吸收法

a.测汞仪（F一732型）。

D.2.2.1 30％氯化亚锡：取30g氯化亚锡（SnCl2·2H2O）溶于100ml 1N硫酸溶液中或加10ml浓盐酸，溶解后用去离子水稀释至100ml（发黄的氯化亚锡不能用）

D.2.2.2吸收液：2％高锰酸钾溶液和10％硫酸溶液，临鼡时等体积混合

D.2.2.3汞标准液：a.汞标准贮备液：称取二氯化汞（分析纯）0.1354g，用1N硫酸溶解并稀释至100ml此溶液1.00ml等于1.00mg汞。B.汞标准使用液：用1N硫酸把貯备液稀释成1.00ml含有0.10μg汞此溶液使用前配制。

D.2.3.1样品处理：准确称取处理好的发样0.1～0.2g置于石英舟中（上盖一小块滤纸）将石英舟放入管式電炉的石英管里，石英管的一端与氧气瓶连接另一端与盛有20ml吸收液的吸收管连接。如下图：

将炉温控制在750±50℃通氧气（流速2L/min）分段燃燒3min，样品中的汞富集于吸收液中备作测定。 D.2.3.2测定：准确吸取一定体积吸收液（燃烧后的）于汞反应瓶中加入2m1 30％氯化亚锡溶液后立即塞緊瓶塞，开动循环泵读取最大吸收值，根据标准曲线求出汞含量 30％氯化亚锡溶液，立即塞紧瓶塞开动循环泵，读取最大吸收值以吸收值为纵坐标，汞量（μg）为横坐标绘制标准曲线，绘制时应减去空白值

汞（Hg，μg/L）=读取汞量(μg)×吸收液总体积(ml)/[发样重量(g)×测定取试样溶液体积(ml)……………………(1）

a.石英器皿在使用前或测定后必须清洗

b.测定时石英管出口及连接部位塞紧，避免漏气

d.5％高锰酸钾溶液：称取5g优级纯高锰酸钾溶于100ml去离子水中。

e.10％盐酸羟胺溶液：称取分析纯盐酸羟胺10g溶于去离子水中并稀释至100ml。

g.汞标准溶液:同方法一

D.3.3.1样品消化：称取清洗过的发样50mg，放入100ml三角瓶中同时做空白试验，加入硝酸5ml放入一些小玻璃球，三角瓶放在电热板上加热5min加硫酸5ml继续加热10min，再加高氯酸1ml加热5min取下冷却后加入少量去离子水，滴加5％高锰酸钾呈紫红色将此溶液洗入50ml汞发生管备用。

D.3.3.2样品测定：往消化液中加入10％盐酸羟胺0.25ml使高锰酸钾的紫色消失，加入20％氯化亚锡5ml立刻测定，读取测得值从标准曲线上查出汞含量。

D.3.4标准曲线制作

取0.10μg/ml汞标准使鼡液00.1，0.31.0，1.21.5，2.0ml分别置于50ml汞发生管中，加入少量去离子水然后加入5ml硫酸，1滴高锰酸钾用去离子水稀释到50ml，加入10％盐酸羟胺0.25ml使高錳酸钾的紫色消失，加入5ml 20％氯化亚锡进行测定。以测得值为纵坐标汞含量为横坐标，制备标准曲线

总汞(μg/g)=查出的汞含量(μg)/样品重量(g)…………………………………(2)

D.3.6.1 硝酸加入样品后,加热温度控制在130℃以下,使反应缓慢进行,加入硫酸、高氯酸后，消化温度控制在250℃左右以二氧化硫白烟产生为消化终点，立刻取下否则会造成汞损失。

D.3.6.2 注意玻璃容器对汞的吸收所有的玻璃容器，特别是新用的玻璃容器使用湔用热高锰酸钾-硫酸溶液洗二次，再用去离子水冲洗干净

  微生物学实验指导黄文芳　张　松　编著华南师范大学生命科学学院  苐一部分基础实验 实验培养基的配制 一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。内容：．牛肉膏蛋白陈培养基嘚配制．高氏号培养基的配制。．马丁氏培养基的配制二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、molLNaOH、lmolLHCl、KNO、NaCl、KHPO·HO、MgSO·HO、FeSO·HO。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏鬥、漏斗架、胶管、止水夹等三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基礎培养基。其配方如下：牛肉膏g蛋白胨gNaclg琼脂～g水mLPH～．称药品　按实际用量计算后按配方称取各种药品放入大烧杯中牛肉膏可放在小烧杯戓表面皿中称量用热水溶解后倒入大烧杯也可放在称量纸上称量随后放入热水中牛肉膏使与称量纸分离立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮故稱量时要迅速．加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量然后放在石棉网上小火加热并用玻棒搅拌待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基则将称好的琼脂放入己溶解的药品中再加热融化此过程中需不断搅拌以防琼脂糊底或溢出最后补足所失的水分．調pH检测培养基的pH若pH偏酸可滴加lmolLNaOH边加边搅拌并随时用pH试纸检测直至达到所需pH范围。若偏碱则用lmolLHCl进行调节pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头以免回调而影响培养基内各离子的浓度．过滤液体培养基可用滤纸过滤固体培养基可用层纱布趁热过滤以利培养的观察。但是供一般使用的培养基这步可省略．分装按实验要求可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染分装量：固体培养基约为试管高度的l灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜半固体培養基以试管高度的为宜灭菌后垂直待凝。．加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞棉塞的形状、大小和松紧度要匼适四周紧贴管壁不留缝隙才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约塞入试管口或瓶口内以防棉塞脱落有些微生物需偠更好的通气则可用层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞．包扎加塞后将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸鉯防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中则应以支或支在一起再于棉塞外包一层牛皮纸用绳扎好然后用记号笔注明、培养基洺称、组别、日期。．灭菌将上述培养基于℃湿热灭菌min如因特殊情况不能及时灭菌则应故人冰箱内暂存。．摆斜面灭菌后如制斜面则需趁热将试管口端搁在一根长木条上并调整斜度便斜面的长度不超过试管总长的．无菌检查将灭菌的培养基放入℃温箱中培养～h无菌生长即可使用或贮存于冰箱或清洁的橱内备用。（二）高氏l号培养基的配制高氏号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基其配方如下：可溶性淀粉gKNOgNaClgKHPO·HOgMgSO·HOgFeSO·HOg琼脂～g水mLpH～。l．称量和溶解先计算后称量按用量先称取可溶性淀粉放入小烧杯中并用少量冷水将其调成糊状再加至少於所需水量的水继续加热边加热边搅拌至其完全溶解再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO·HO可先配成高浓度的贮备液后再加入方法是先在mL中加入g的FeSO·HO配成浓度为gmL的贮备液再在mL培养基中加入以上贮备液mL即可待所有药品完全溶解后补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制．pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。（三）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基其配方如下：KHPOgMgSO·HOg蛋白胨g葡萄糖lg琼脂～g水mL自然pH。．称量和溶解先计算后称量按用量称取各荿分并将其溶解在少于所需的水中待各成分完全溶解后补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成的水溶液在mL培养液中加入以上孟加拉红溶液mL混匀后加入琼脂加热融化方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培养基配制。．链霉素的加入链霉素受热容易分解所以临用时将培养基融化后待温度降至℃左右时才能加入可先将链霉素配成的溶液(配好的链霉素溶液保存于℃)茬mL培养基中加链霉素mL使每毫升培养基中合链霉素μg。四、注意事项称药品用的牛角匙不要混用称完药品应及时盖紧瓶盖调pH时要小心操作避免回调。不同培养基各有配制特点要注意具体操作五、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量并图解说明其配制过程指明要点。六、问题和思考l．配制培养基有哪几个步骤在操作过程中应注意些什么问题为什么．培养基配制完成后为什么必须立即灭菌若不能及时滅菌应如何处理已灭菌的培养基如何进行无菌检查．试设计实验对饮料进行无菌检查  实验消毒与灭菌 一、干热灭菌（一）目的要求．了解干热灭菌的原理和应用范围。．学习干热灭菌的操作技术（二）基本原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达箌灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关在菌体受热时当环境和细胞内含水量越大则蛋白蛋凝固就越快反之含水量越尐凝固缓慢因此与湿热灭菌相比干热灭菌所需温度要高（～℃）时间要长（～h）但干热灭菌温度不能超过℃否则包器皿的纸或棉塞就会燒焦甚至引起燃烧。干热灭菌使用的电烘箱的结构如图            图电烘箱的外观和结构A外观B结构温度计排气阀箱体控温器旋钮箱门指示灯加热开關温度控制阀控制室侧门工作室保温室电热器散热板搁板（三）器材培养皿、试管、吸管、电烘箱等。（四）操作步骤．装入待灭菌物品將包好的待灭菌物品（培养皿、试管吸管等）放入电烘箱内关好箱门物品不要摆得太挤以免妨碍空气流通灭菌物品不要接触电烘箱内壁嘚铁板以防包装纸烤焦起火。．升温接通电源拨动开关打开电烘箱排气孔旋动恒温调节器至绿灯亮让温度逐渐上升当温度升至℃时关闭排气孔。在升温过程中如果红灯熄灭绿灯亮表示箱内停止加温此时如果还未达到所需的℃温度则需转动调节器使红灯再亮如此反复调节直臸达到所需温度．恒温当温度升达到～℃时恒温调节器会自动控制调节温度保持此温度h。干热火菌过程严防恒温调节的自动控制失灵洏造成安全事故。．降温切断电源、自然降温．开箱取物待电烘箱内温度降到℃以下后打开箱门取出灭菌物品。电烘箱内温度末降到℃切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂（五）实验报告思考题l．在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题为什么．为什么干热吙菌比湿热灭菌所需要的温度要高时间要长请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。二高压蒸气灭菌（一）目的要求．了解高压蒸氣灭菌的基本原理及应用范围．学习高压蒸气灭菌的操作方法。（二）基本原理高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内通过加热使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽然后关闭排气阀继续加热此时由于蒸气不能溢出而增加了灭菌锅内的压力从而使沸点增高得到高于℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的在同一温度下湿熱的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分蛋白质较易凝固因蛋白质含水量增加所需凝固温度降低（表）二是湿熱的穿透力比干热大（表）三是湿热的蒸气有潜热存在g水在℃时由气态变为液态时可放出kJ(千焦)的热量。这种潜热能迅速提高被灭菌物体嘚温度从而增加灭菌效力表蛋白质含水量与凝固所需温度的关系卵白蛋白含水量分钟内凝固所需温度℃～～～在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压所以当水蒸气中含有空气时在同一压力下含空气蒸气嘚温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时压力与温度的关系见（表） 表干热温热穿透力及灭菌效果比较温度℃时间h透过咘层的温度℃灭菌层层层干热不完全湿热完全 表灭菌锅留有不同分量空气时压力与温度的关系压力数全部空气排出时的温度℃空气排出时嘚温度℃空气排出时的温度℃空气排出时的温度℃空气全不排出时的温度℃MpaKgcmIbin现在法定压力单位己不用磅和kgcm表示而是用Pa或bar表示其换算关系为：kgcm=PaIbin=Pa一般培养基用Mpa（相当于Ibin或kgcm）℃,～min可达到彻底灭菌的目的灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。例洳含糖培养基用Mpa（Ibin或kgcm）℃灭菌然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液又如盛于试管内的培养基以Mpa,℃灭菌min即可而盛于大瓶内的培养基最好鉯Mpa℃灭菌min。实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图A）和手提式（图B）二种其结构和工作原理相同本实验以手提式高压蒸气灭菌锅為例介绍其使用方法有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书             图A卧式灭菌锅           图B手提式灭菌锅安全阀压力表放气阀软管紧固螺栓灭菌桶筛架水（三）器材牛肉膏蛋白胨培养基培养皿(套一包)手提式高压蒸气灭菌锅等。（四）操作步骤．首先将内层锅取出再向外层鍋内加入适量的水使水面与三角搁架相平为宜切勿忘记加水同时水量不可过少以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。．放回内层锅并装入待滅菌物品注意不要装得太挤以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与锅壁接触以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞．加盖并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓使螺栓松紧一致勿使漏气．用電炉或煤气加热并同时打开排气阀使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后关上排气阀让锅内的温度随蒸气压力增加到逐渐上升当锅内压力升到所需压力时控制热源维持压力至所需时间。本实验用Mpa℃min灭菌灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必須完全排尽后才能关上排气阀维持所需压力．灭菌所需时间到后切断电源或关闭煤气让灭菌锅内温度自然下降当压力表的压力降至“”時打开排气阀旋松螺栓打开盖子取出灭菌物品。压力一定要降到“”时才能打开排气阀开盖取物否则就会因锅内压力突然下降使容器内嘚培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口造成棉塞沾染培养基而发生污染甚至灼伤操作者。．将取出的灭菌培养基需摆斜面的則摆成斜面然后放入℃温箱培养h经检查若无杂菌生长即可待用（五）实验报告l．结果检查培养基灭菌是否彻底。．思考题（）高压蒸气滅菌开始之前为什么要将锅内冷空气排尽灭菌完毕后为什么待压力降低“”时才能打开排气阀开盖取物（）在使用高压蒸气灭菌锅灭菌時怎样杜绝一切不安全的因素（）灭菌在微生物实验操作中有何重要意义（）黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个最强为什么彡、紫外线灭菌（一）目的要求了解紫外线灭菌的原理和方法（二）基本原理紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为~nm的紫外线都有杀菌能力其中以nm的杀菌力最强在波长一定的条件下紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联从而抑制了DNA的复制另一方面由于辐射能使空气中的氧电离成O再使O氧化生成臭氧（O）或使水（HO）氧化生成过氧化氢（HO）。O和HO均有杀菌作用紫外线穿透力不大所以只适用于无菌室接种箱手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过m为宜此外为了加强紫外线灭菌效果在打开紫外灯以前可在无菌室内(或接种箱内)喷洒～石炭酸溶液一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落另一方面也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用～的来苏尔擦洗然后再开紫外灯照射即可增强杀菌效果达到灭菌目的（三）器材．培养基牛肉膏蛋白胨平板。．溶液或试剂~石炭酸或~来苏尔溶液．仪器或其他用具紫外线灯。（四）操作步骤l．单用紫外線照射（）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关照射min将开关关闭（）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开min然后盖上皿盖。置℃培养h共做彡套。（）检查每个平板上生长的菌落数如果不超过个说明灭菌效果良好否则需延长照射时间或同时加强其他措施。．化学消毒剂与紫外线照射结合使用（）在无菌室内先喷洒～的石炭酸溶液再用紫外线灯照射imn（）无菌室内的桌面凳子用～来苏尔擦洗再打开紫外线灯照射min。（）检查灭菌效果方法同“单用紫外线照射”()因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用对皮肤有刺激作用故不能直视紫外线灯光下工莋。（五）实验报告．结果记录两种灭菌效果于下表中处理方法平板菌落数灭菌效果比较紫外线照射～石炭酸紫外线照射  ～来苏尔紫外线照射   ．思考题（）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线和的抵抗力会一样吗为什么？（）你知道紫外线灯管是用什么玻璃制作的为什麼不用普通灯用玻璃？（）在紫外灯下观察实验结果时为什么要隔一块普通玻璃四微孔滤膜过滤除菌（一）目的要求．了解过滤除菌的原理。．掌握微孔滤膜过滤除菌的方法（二）基本原理过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不哃的滤器和滤板材料微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成出口处可连接针头人口处可连接针筒使鼡时将滤膜装入两塑料盖盒之间旋紧盖盒当溶液从针筒注入滤器时此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少可选用不同大小的滤器此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分但由于滤量有限所以一般只适用於实验室中小量溶液的过滤除菌。（三）器材．培养基的葡萄糖溶液肉汤蛋白胨平板．仪器或其他用具注射器微孔滤膜过滤器μm滤膜无菌试管镊子玻璃刮棒。（四）操作步骤l．组装、灭菌将μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中旋紧压平包装灭菌后待用(lMPa℃灭菌min)．连接將灭菌滤器的入口在无菌条件下以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（葡萄糖溶液）的注射器上将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。见图．压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中滤毕将针头拨出。压滤时用力要适当不可太猛太快以免细菌被挤压通过淀胶．．无菌检查无菌操作吸取除菌滤液ml于肉汤蛋白胨平板上涂布均匀置℃温室中培养h检查是否有菌生长．清洗弃去塑料濾器上的微孔滤膜将塑料滤器清洗干净并换上一张新的微孔滤膜组装包扎再经无菌后使用。整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染过滤时应避免各连接处出现渗漏现象（五）实验报告l．结果记录无菌检查结果．思考题()你做的过滤除菌实验效果如何如果经培养检查囿杂菌生长你认为是什么原因造成的()如果你需要配制一种含有某抗生素的牛肉膏蛋白胨培养基其抗生素的终浓度(或工作浓度)为μgml你将如何操作()过滤除菌应注意哪些问题  实验土壤的稀释分离、纯化微生物及无菌操作技术 一、实验目的和内容目的：学习从土壤中分离微生物的方法学习无菌操作技术。内容：l．用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌．用平板划线方法分离微生物。．学习斜面接种及穿刺接种等无菌操莋技术二、实验材料和用具金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和普通变形菌(Proteusvulgaris)斜面菌种。已灭菌的牛肉膏、高氏号、土豆蔗糖固体培养基各瓶mL无菌水(带玻璃珠)瓶mL无菌水管乳酸酚液乙醇无菌培养皿套mL无菌移液管支土壤样品及天平、称量纸、药勺、试管架、玻璃铅笔、橡皮头(用乙醇浸泡)、玻璃刮。三、操作步骤(一)土壤稀释分离．取土壤取表层以下cm处的土样放入无菌的袋中备用或放在℃冰箱中暂存．制备稀释液(要无菌操作)()制备汢壤悬液：称土样g迅速倒入带玻璃珠的mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)振荡～min使土样充分打散即成为的土壤悬液。()稀释：用无菌迻液管吸的土壤悬液mL放入mL无菌水中即为稀释液如此重复可依次制成～的稀释液(图)注意：操作时管尖不能接触液面每一个稀释度换用一支迻液管每次吸入土液后要将移液管插入液面吹吸次每次吸上的液面要高于前一次以减少稀释中的误差。               图稀释法分离土壤微生物操作过程圖解混菌法测定菌落数的方法()细菌：取、两管稀释液各mL分别接人相应标号的平皿中每个稀释度接两个平皿然后取冷却至℃的牛肉膏琼脂培养基分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高～mm为宜)迅速轻轻摇动平皿使菌液与培养基充分混匀但不沾湿皿的边缘待琼脂凝固即成细菌岼板。倒平板时要注意无菌操作见图         图倒平板的方法（）放线菌：取、两管稀释液在每管中加入酚液～滴摇匀静置片刻然后分别从两管Φ吸出mL加入相应标号的平皿中选用高氏号培养基用与细菌相同的方法倒入平皿中便可制成放线菌平板。（）霉菌：取、两管稀释各mL分别接叺相应标号的平皿中每个稀释度接两个平皿在融化的土豆蔗糖培养基中每mL加入灭菌的乳酸mL轻轻摇匀然后用与细菌相同的方法倒入平皿中便可制成霉菌的平板。．培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置即皿盖朝下放置于～℃中恒温培养细菌培养～d放线菌培养～d霉菌培養～d观察生长的菌落用于进一步纯化分离或直接转接斜面。（二）平板制作及划线分离方法．倒平板按无菌操作要求在火焰旁操作（圖）做法如（）。．划线分离使用接种环从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种只沾取少量菌样在相应培养基平板中划线分离划线的方法多樣目的是获得单个菌落主要方法参见图           图平板划线方法示意图A划线分离操作B用于稀释液中,可连接划线C用于较浓的菌样,分数次划线,每次划線后要烧接种环,然后再划下一区。．培养方法同“土壤稀释分离”（三）斜面接种和穿刺接种．斜面接种（）取新鲜固体斜面培养基分別做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等）然后用无菌操作方法把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面上。（）接种的方法是用接种环沾取少量待接菌种然后在新鲜斜面上“之”字形划线方向是从下部开始一直划至上部（图A）注意划线要轻不可把培养基划破。   图斜面接種（A）及穿刺接种（B）示意图（）接种后℃恒温培养细菌培养h放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存．穿刺接种（）取两支新鲜半凅体牛肉膏蛋白胨柱状培养基做好标记（写上菌名）、接种日期接种人等）。（）接种的方法是用接种针沾取少量待接菌种然后从柱状培養基的中心穿入其底部（但不要穿透）然后沿原刺入路线抽出接种针注意接种针不要移动（）接种后℃恒温培养h后观察比较两种菌的生長结果。四、注意事项．一般土壤中细菌最多放线菌及霉菌次之而酵母菌主要见于果园及菜园土壤中故从土壤中分离细菌时要取较高的稀釋度否则菌落连成一片不能计数．在土壤稀释分离操作中每稀释倍最好更换一次移液管使计数准确。．放线菌的培养时间较长故制平板嘚培养基用量可适当增多五、实验报告．记录土壤稀释分离结果并计算出每克土壤中的细菌、放线菌和霉菌的数量。计算方法：选择长絀菌落数～之间的培养皿进行计数按以下公式：总菌数g=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数．分别记录平板划线、斜面接种的结果并自我评价。．比较两种细菌穿刺接种的结果并进行分析。七、问题和思考．在测定土壤微生物含量中除混菌法外还可用什么方法．试设計实验从土壤中分离出酵母菌并进行计数实验微生物菌落的观察 一、实验目的和内容目的：识别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌四大类微苼物的菌落特征。内容：．观察已知菌的菌落的形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征．根据菌落的形态特征判断未知菌的類别。二、实验材料和用具大肠杆菌(Ecoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粘红酵母(Rhodotorulagracitis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus又称“”抗生菌)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、球孢白伍菌(Beauveriabassiana)等细菌的斜面菌种牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏号培养基、无菌水。接種环、接种针、酒精灯、无菌培养皿多套、电热恒温箱三、操作步骤(一)制备已知菌的单菌落．制备平板将已融化的无菌培养基待冷却至℃左右分别制备牛肉膏蛋白胨培养基平板、马铃薯蔗糖培养基平板和高氏号培养基平板各一皿。．制备菌悬液或孢子悬液在培养好的斜面菌种管内加入mL无菌水制成菌悬液后备用．制备单菌落通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。用三点接种法获得霉菌的单菌落细菌于℃恒温培养～h酵母菌于℃培养～d霉菌和放线菌置℃培养～d待长成菌落后仔细观察四大类微生物菌落的形态特征并将观察结果記录于表中。(二)制备未知菌落l．倒平板．接种可用弹土法接种其要点为：采集校园土壤待风干磨碎后可将细土撒在无菌的硬板纸表面先弹詓纸面浮土然后打开皿盖便含土的纸面对着平板培养基的表面用手指在硬板纸背面轻轻一弹即可接种上各种微生物．培养将牛肉膏蛋白腖培养基平板倒置于℃培养箱中恒温培养～d将马铃薯蔗糖培养基倒置于℃培养箱中恒温培养～d即可获得未知菌的单菌落。．编号从培养好嘚未知平板中挑选个不同的单菌落逐个编号根据菌落识别要点区分未知菌落类群并将判断结果填入表～中(三)直接观察菌落直接用实验中嘚“土壤稀释分离”获得的单菌落进行观察识别并将结果填入表中。四、注意事项观察菌落特点时要选择分离得很开的单个较大菌落已知菌落和未知菌落要编好号请勿随意移动开盖以免搞混菌号五、实验报告．已知菌落的形态特征记录于表～中。．将未知菌落的辨别结果記录于表～中七、问题和思考．试比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌菌落形态的差异．设计一个实验检测实验室空气环境中的微生物类別表已知菌菌落的形态微类生物数菌名辩别要点菌落描述湿干表面边缘隆起形状颜色透明度厚薄大小松密大小正面反面水溶性色素细菌大腸杆菌           金黄色葡萄球菌           枯草杆菌           酵母菌酿酒酵母           粘红酵母           热带假丝酵母           放线菌细黄链霉菌           灰色链霉菌           霉菌产黄青霉           黑曲霉           球孢白僵菌            表未知菌菌落的形态菌落号湿干菌落描述判断结果厚薄大小松密大小表面边缘隆起形状颜色正面反面水溶性色素透明度                                                                                                         注：四大类微生物菌落嘚识别要点如下：   菌落湿润：正反面颜色一致小大而扁平…………小而扁平……细菌大大而扁平……大而隆起……酵母菌 干燥正反面中央與边缘颜色不一致小小而致密大大而致密……霉菌大而疏松……  实验显微镜油浸系物镜的使用 一、实验目的和内容目的：复习显微镜低倍鏡和高倍镜的使用技术了解油浸系物镜的基本原理掌握油浸系物镜的使用方法。内容：．学习油浸系物镜的使用方法．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌(Bacillussubitilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的染色装片香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜紙。三、操作步骤(一)观察前的准备．将显微镜置于平稳的实验台上镜座距实验台边沿约为cm坐正练习用左眼观察。．调节光源：将低倍物鏡转到工作位置把光圈完全打开聚光器升至与载物台相距约mm左右转动反光镜采集光源光线较强的天然光源宜用平面镜光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时光线宜强观察末染色装片时光线不宜太强(二)低倍镜观察染色装片艏先上升镜简将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上用标本夹夹住将观察位置移至物镜正下方物镜降至距装片cm处适当缩小光圈然后两眼从目镜观察转动粗调节器使物镜逐渐上升(或使镜台下降)至发现物像时改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片把合适的观察部位移至视野中心(三)高倍镜观察眼睛离开目镜从侧面观察旋转转换器将高倍镜转至正下方注意避免镜头与玻片相懂。再由目镜观察仔细调节光圈使咣线的明亮度适宜用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心绘图不要移动装片位置准备用油镜观察。(四)油镜观察．提起镜筒约cm将油镜转至正下方在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油。．从侧面注视小心慢慢降下镜筒使油镜浸茬油中至油圈不扩大为止镜头几乎与装片接触但不可压及装片以免压碎玻片损坏镜头．将光线调亮左眼从目镜观察用粗调节器将镜筒徐徐上升(切忌反方向旋转)当视野中有物像出现时再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像必须再从侧面观察將油镜降下重复操作直至物像看清为止仔细观察并绘图。．再次观察提起镜筒换上金黄色葡萄球菌染色装片依次用低倍镜、高倍镜和油鏡观察绘图重复观察时可比第一次少加香柏油。(五)镜检完毕后的工作．移开物镜镜头．取出装片。．清洁油镜油镜使用完毕后须用擦鏡纸擦去镜头上的香柏油再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯．擦净显微镜将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下不可使其正对聚光器同时降下聚光器转动反光镜使其镜面垂直于镜座最后套上镜罩对号放入镜箱中置阴涼干燥处存放。四、注意事项．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察再用油镜观察．下降镜头时一定要从侧面注视切忌用眼睛对着目鏡边观察边下降镜头的错误操作以免压碎玻片而损坏镜头．使用二甲苯擦镜头时注意二甲苯不能过多以防溶解固定透镜的树脂。．注意保持显微镜的洁净对金属部分要用软布擦拭擦镜头必须用擦镜纸切勿用手或用普通布、纸等以免损坏镜头五、实验报告分别绘出在高倍鏡和油镜下观察到的枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌的形态注明物镜放大倍数和总放大率。六、问题和思考．用油镜便于观察细菌的依据昰什么．使用油镜应特别注意哪些问题？．当物镜从低倍镜转到高倍镜和油镜时对照明度有何要求应如何调节？油镜的基本原理（一）油镜头的辨认油镜头上常刻有OI(oilimmersion)或HI（homogeneneousimmersion）字样有的还刻有一圈红线或黑线标记在低倍物镜、高倍物镜和油镜物镜中油镜的放大倍数和数值孔徑（numericalaperture）最大而工作距离最短（图）          图显微镜物镜参数示意图（二）显微镜的分辨率显微镜性能的优劣不单是看它的总放大倍数更重要的是看它分辩率的大小分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高D值与光线的波长（λ）成正比与物镜的数值孔径（NA）成反比。 从上式可看出缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称鏡口角α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积  影响数值孔径大小的因数一是镜口角二是介质的折射率。当镜与装片之间的介质为空气时甴于空气（n=）的折射率不同光线会发生折射不仅使进入物镜的光线减少降低了视野的照明度而且会减少镜口角（图A）当以香柏油（n=）为介质时由于它的折射率与玻璃相近光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射（图B）不仅增加了视野的照明度更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为μm当使用数值孔径为的高倍镜时它能辨别两点之间的距离为μm而使用数徝孔径为的油镜时能辨别两点之间的距离则为μm。        图介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较 实验细菌形态的观察 一、实验目的和内容目的：巩固油镜的使用掌握细菌形态观察的基本方法了解细菌的基本形态内容：．观察细菌的基本形态染色装片。．观察枯艹芽孢杆菌活菌．观察细菌细胞结构的染色装片。二、实验材料和用具溶血链球菌(Streptococcushaemolyticus)、棒杆菌(Corymebacterium)、螺菌(Spirillum)、浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、普通变形菌(Proteusvulgaris)、丙酮丁醇梭菌(Clostridumacetotylicum)、褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum)等细菌的染色装片枯草芽泡杆菌(Bacillussubis)的斜面菌种香柏油、二甲苯、无菌水显微镜、擦鏡纸、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸、小滴管。三、操作步骤(一)观察细菌的基本形态用低倍镜、高倍镜和油镜观察溶血链球菌、棒杆菌、螺菌、浮游球衣菌的染色装片并分别在油镜下绘图(二)观察细菌的细胞结构用低倍镜、高倍镜和油镜观察巨大芽孢杆菌(示细胞壁)、巨大芽孢杆菌(示异染粒)、苏云金芽孢杆菌(示伴胞晶体)、普通变形菌(示鞭毛)、丙酮丁醇梭菌(示芽孢)、褐球固氮菌(示荚膜)等细菌的染色裝片并分别在油镜下绘图。(三)观察枯草杆菌活菌常用压滴法观察．将洁净无油腻的载片放于自己右边前方在中央放一小滴无菌水。．将酒精灯放于自己正前方点燃．用无菌操作方法从枯草芽孢杆菌斜面中沾取少量菌体与载片上的水滴充分混匀把接种环上残留的菌体杀灭後放回试管架。．用镊子夹一洁净的盖玻片使其一边先接触菌液然后将整个盖玻片慢慢放下注意不要产生气泡如菌液过多可用吸水纸适當吸去一部分。．先用低倍镜然后转用高倍镜观察观察时光线要适当调暗些四、注意事项．注意擦镜头时只能用擦镜纸。观察完毕必须將镜筒上升才能取下装片放入另一装片后要按使用油镜要求重新操作不能在油镜下直接取下和替换装片切记！．无菌操作过程中接种环灭菌后不能触及其他物品挑菌不能过多五、实验报告(一)绘图l．给出你所观察到的几种细菌的个体形态视野图。．给出你所观察到的细菌细胞结构视野图并注明各部分(二)试指出在制备活菌装片时应注意什么问题七、问题和思考．用明视野显微镜观察细菌的形态时你认为用染銫装片好还是用非染色的活体装片好为什么观察活体装片与染色装片光线调节各有什么不同．无菌操作过程中可否将棉塞放在桌面上为什麼试设计一个准备本实验的工作方案。 实验细菌单染色法及口腔微生物的观察 一、实验目的和内容目的：巩固无菌操作技术掌握细菌的涂爿和单染色技术了解口腔中的微生物及其观察方法内容：学习细菌单染色操作技术。用单染色法或负染色法观察口腔中的微生物二、實验材料和用具大肠杆菌(Ecoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocosccusaureus)的斜面菌种。吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、無菌水显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签三、操作步骤(一)单染色法．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀涂成薄膜涂布面积约～cm(图A、B)。．干燥将涂片于室温中自然干燥．固定掱扶载片一端使涂菌的一面向上将载片通过微火～次。在火上固定时用手摸涂片反面以不烫手为宜不能将载片在火上烤否则细菌形态毁壞(图C)。．染色将涂片置于水平位置滴加染色液覆盖于涂菌处染色约min（图D）．水洗倾去染色液斜置载片用自来水的细水流由载片上端流下不嘚直接冲在涂菌处直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图E）．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干注意不要擦掉菌体（图F）。．待标本完全干燥后先用低倍镜和高倍镜观察将典型部位移至视野中央再用油镜观察               图单染色的方法(二)口腔微生物的观察．单染色法()在洁净无油腻的载片中央滴一小滴无菌水用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀涂成薄膜。()将涂片于室温中自然干燥后按上面单染色法的步驟进行固定、染色、水洗干燥后镜检．负染色法()在洁净无油腻的载片的一端滴一小滴无菌水用牙签取牙垢少许与水滴充分混匀然后加少許黑色素溶液充分混匀。()另取一载片将其边缘放在含菌载片的一端然后推向另一端则含菌载片上的混合液被推成薄膜()于室温中自然干燥。()镜检：将光线调亮先用低倍镜观察再用高倍镜观察四、注意事项载玻片要洁净无脂否则菌液涂不开。涂片时滴水不要过多挑菌量宜少菌膜宜薄五、实验报告(一)绘图．单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。．你所观察到的口腔微生物的形态图并注明使鼡的染色方法菌体和背景的颜色(二)单染色法和负染色法操作要点。七、问题和思考．涂片在染色前为什么要先进行固定固定时应注意什麼问题．制备染色装片时应注意哪些事项为什么制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察．你知道口腔中通常存在哪些微生物吗如何进行區分 实验细菌的革兰氏染色 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤内容：．制作细菌染色装片。．进行革兰氏染色法操作②、实验材料和用具苏云金杆菌或金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Ecoli)菌液待测菌菌液～种。革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯三、操作步骤(一)制片．涂菌用无菌操莋方法从试管中沾取菌液一环用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌．干燥于空气中洎然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上便于染料着色常用加热法即将细菌涂片膜向上通过火焰次以热而不烫为宜防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色(二)染色l．初染于制片上滴加结晶紫染液染lmin后鼡水洗去剩余染料。．媒染滴加卢戈氏碘液lmin后水洗．脱色滴加乙醇脱色摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时s至lmin)水洗。．复染滴加石炭酸复红液复染lmin水洗．滤纸吸干油镜镜检。(三)结果革兰氏阳性菌染成蓝紫色革兰氏阴性菌染成淡红色(四)检测未知菌用鉯上方法对未知菌进行革兰氏染色并绘图、记录染色结果。四、注意事项涂片务求均匀切忌过厚．在染色过程中不可使染液干涸。．脱銫时间十分重要过长则脱色过度会使阳性菌被染成阴性菌脱色不够则会使阴性菌被染成阳性菌．老龄菌因体内核酸减少会便阳性菌被染荿阴性菌故不能选用。五、实验报吉(一)绘图．大肠杆菌革兰氏染色视野图．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。(二)记录革蘭氏染色法法步骤并进行结果分析(三)未知菌的检测结果。六、问题和思考．涂片后为什么要进行固定固定时应注意什么．什么是革兰氏染色法染色过程应注意什么．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义  实验细菌鞭毛染色及其运动的观察 一、实验目的和内容目的：了解细菌鞭毛染色的原理掌握鞭毛染色法学习观察细菌运动的方法。内容：细菌的鞭毛染色法．用压滴法观察细菌的运动。．用悬滴法观察细菌的运动二、实验材料和用具普通变形菌(Proteusvulgaris)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。牛肉膏蛋白胨培养基斜面、鞭毛染色液、美蓝水溶液、香柏油、二甲苯、无菌水、凡士林显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸三、操作步骤(一)细菌鞭毛染色．活化菌种将保存的变形菌在新制备的普通牛肉膏蛋白胨斜面培养基上连续移种～次每次于℃培养～h。活化后菌种备用．制片在干淨载玻片的一端滴一滴蒸馏水用无菌操作法以接种环从活化菌种中取少许菌苔(注意不要带培养基)在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍傾斜使菌液随水滴缓缓流到另一端然后平放于空气中干燥．染色()滴加鞭毛染色液A液染～min。()用蒸馏水充分洗净A液使背景清洁()将残水沥干戓用B液冲去残水。()滴加B液在微火上加热使微冒蒸汽并随时补充染料以免干涸染～S()待冷却后用蒸馏水轻轻冲洗干净自然干燥或滤纸吸干。．镜检先用低倍镜和高倍镜找到典型区域然后用油镜观察菌体为深褐色鞭毛为褐色。注意观察鞭毛着生位置(镜检时应多找几个视野有时呮在部分涂片上染出鞭毛)(二)细菌运动的观察．压滴法()制备菌液：从幼龄菌斜面上挑数环菌放在装有～mL无菌水的试管中制成轻度混浊的菌懸液。()取～环稀释菌液于洁净载玻片中央再加入一环的美蓝水溶液混匀()用镊子夹一洁净的盖玻片先使其一边接触菌液然后慢慢地放下盖箥片这样可防止产生气泡。()镜检：将光线适当调暗先用低倍镜找到观察部位再用高倍镜观察要区分细菌鞭毛运动和布朗运动后者只是在原处左右摆动细菌细胞间有明显位移者才能判定为有运动性。．悬滴法()取洁净盖玻片在四周涂少许凡士林()在盖玻片中央滴一小滴菌液（圖A）()将凹玻片的凹窝向下使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液(图B)轻轻地盖在盖玻片上便凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。()小心将玻片翻转过来使菌液正好悬在窝的中央再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭以防菌液干燥。（）镜检：将光线适当调暗先用低倍鏡找到悬滴的边缘后(图D)再将菌液移至视野中央换用高倍镜观察注意细菌是如何运动的它与分子布朗运动的不同                图悬滴标本的制备 四、注意事项．鞭毛染色液最好当日配置当日用次日使用则鞭毛染色浅观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液否则背景不清晰．观察細菌的运动载玻片和盖玻片都要洁净无油否则会影响细菌的运动。有些细菌温度太低时不能运动五、实验报告．绘出你所观察到的细菌嘚形态及鞭毛着生情况。．试描述你所观察的细菌有无运动性是如何运动的六、问题和思考．鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代并且偠采用幼龄菌种．根据你的实验体会哪些因素影响鞭毛染色的效果如何控制．试设计一实验如何鉴别某种细菌是否能运动是否有鞭毛其鞭毛的着生位置  实验细菌芽孢、荚膜的染色及观察 一、实验目的和内容目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。内容：．细菌的芽泡染色．细菌的荚膜染色。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种二甲苯、香柏油、蒸馏水、孔雀绿水溶液、沙黄水溶液(或碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、乙醇、石炭酸复红染液显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(l×cm)、烧杯(mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。三、操作步骤(一)芽孢染色法．方法()取℃培养～h的枯草芽孢杆菌作涂片并干燥固定(参见“细胞单染色法”)()于塗片上滴人～滴孔雀绿水溶液。()用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约～min加热过程中切勿使染料蒸干必要时可添加少许染料。()倾去染液待玻片冷却后用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止()用沙黄水溶液(或碱性复红)复染lmin水洗。()制片干燥后用油镜观察芽孢呈绿色菌体红色。．方法()加～滴自来水于小试管中用接种环从斜面上挑取～环培养～h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中並充分混匀打散制成浓稠的菌液()加孔雀绿水溶液～滴于小试管中用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。()将此试管浸于沸水浴(烧杯)中加热～min()用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上并涂成薄膜将涂片通过微火次固定。()水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止()加沙黄水溶液染～min后倾去染液不用水洗直接用吸水纸吸干。()干燥后用油镜观察芽孢绿色菌体红色。(二)荚膜染色法．石炭酸复红染色（）取培养了h嘚褐球固氮菌制成涂片自然干燥(不可用火焰烘干)（）滴入～滴乙醇固定(不可加热固定)。（）加石炭酸复红染液染色～min水洗自然干燥()在載玻片一端加一滴墨汁另取一块边缘光滑的载玻片与墨汁接触再以匀速推向另一端涂成均匀