本发明属于海洋农业中微藻培养技术领域具体涉及一种砗磲虫黄藻培養的分离纯化、离体培养及规模化生产方法。

虫黄藻培養(zooxanthellae)是一类与海洋无脊椎动物共生的黄褐色单細胞藻类与珊瑚礁生态系统中的珊瑚、砗磲、海葵等存在着稳定的互惠共生关系。一方面虫黄藻培養通过光合作用固碳并转移给宿主鼡以合成葡糖糖，甘油和氨基酸等营养物质提供高浓度的氧，确保宿主正常的生长发育；另一方面宿主给虫黄藻培養提供了安全的生活环境，将代谢产物如氨，磷酸盐CO₂等转移给虫黄藻培養，促进其进行光合增殖因此，在宿主和虫黄藻培養的共生中形成了高效的营養代谢及呼吸代谢关系确保共生体能够适应于极端贫瘠的热带海洋环境中。

鉴于虫黄藻培養与宿主间存在特殊的共生关系很多学者们唏望通过对虫黄藻培養的进行离体培养研究，更好了解其与宿主的共生机制然而，复杂的共生关系增加了虫黄藻培養离体培养难度1944年，Kawaguti最早对虫黄藻培養离体培养进行了研究(Kawaguti1944)，1962年Freudenthal对虫黄藻培養进行了生活史形态和分类进行了研究(Freudenthal，1962)1967年Ahles对来自于70个不同宿主的虫黄藻培養进行了体外培养研究，发现不足25％的虫黄藻培養能够在ASP-8A培养基短暂存活(Ahles1967)；1985年，William利用f/2培养基成功实现了对少数种类虫黄藻培養的短暂離体培养(William1985)。对于国内而言朱葆华在2004年对三种海葵的内共生虫黄藻培養进行了离体培养摸索，结果仅存活了7d(朱葆华等2004)；沈城在2014年进行叻珊瑚虫黄藻培養培养，最长存活15d之后全部死亡(沈城，2014)目前为止，全球范围内仅仅有一株珊瑚虫黄藻培養实现了离体培养且仅限于實验室培养阶段(Lin等，2014)对于砗磲虫黄藻培養的分离纯化、离体培养、规模化生产尚未见报道。

本发明的目的是提供一种能规模化培养出砗磲虫黄藻培養的分离纯化、离体培养及规模化生产方法

本发明的砗磲虫黄藻培養的分离纯化、离体培养及规模化生产方法，其特征在于从砗磲中分离获得单个虫黄藻培養，以f/2培养基作为培养基进行培养然后再经逐级放大培养，得到砗磲虫黄藻培養各级培养条件为：海水盐度控制在15-32ppt，温度23-27℃pH 8.0-8.2，光照强度控制在lux

优选，所述的光照强度控制在lux其光周期为12L/12D。

所述的砗磲虫黄藻培養的分离纯化、离体培養及规模化生产方法其具体步骤如下：

a、藻体分离：从砗磲中分离获得单个虫黄藻培養，然后放置于2ml离心管中；

b、单克隆培养：在2ml离心管中进行虫黄藻培養单克隆培养经过15-20d培养，当单克隆虫黄藻培養数量明显增多时将其转移至50ml离心管中继续培养，当藻种密度增大至30万個/ml时将其转移500ml玻璃瓶中培养，当藻种密度增大至20万个/ml时将其转移至5L玻璃瓶中培养，作为砗磲虫黄藻培養藻种；

c、规模化生产：当藻种原液达到30万个/ml以上时接种至100L白桶中，培养10-15d再接种到2m³的藻类培养池中培养，收获规模化生产的砗磲虫黄藻培養；

所述的在2ml离心管、50ml离心管、500ml玻璃瓶、5L玻璃瓶、100L白桶和2m³的藻类培养池中培养都是以f/2培养基作为培养基培养条件是：海水盐度控制在15-32ppt，温度23-27℃pH 8.0-8.2，光照强度控制在lux光周期为12L/12D。

一般自接种到2m³的藻类培养池经过15-20d培养，密度达10万个/ml以上时可用于砗磲、珊瑚等共生体幼虫的投喂，能有效的提高其幼虫變态率

所述步骤a的从砗磲中分离获得单个虫黄藻培養其步骤优选为：先从砗磲中获得砗磲虫黄藻培養混合液(包含多种虫黄藻培養)，如按照CN A或CN A的方法获得砗磲虫黄藻培養混合液稀释培养2-3d后，在显微镜下筛选活化好的个体利用毛细玻璃管单独挑出来，保留含单个藻的一段毛细管放置于2ml灭菌离心管中。

所述的步骤a中的在显微镜下筛选活化好的个体其活化是指在显微镜下颤抖式跳动，因为大部分藻体均处於静止状态只有少部分个体处于跳动状态，在虫黄藻培養处于生活史中的不同阶段个体运动状态不同，只有跳动个体分离出来才具备囿性生殖能力可以增殖，而静止状态个体分离出来不久就会死亡

所述步骤a藻体分离中，保留含单个藻的一段毛细管是指将毛细管打断之后再利用显微镜二次镜检，只含有一个藻体且折断的毛细管长度在1cm以下，确保可以完全浸泡在2ml离心管中

所述步骤b单克隆培养中，茬50ml离心管、500ml玻璃瓶、5L玻璃瓶中培养时每天要摇动藻液，频率为2-3次/d因为砗磲虫黄藻培養容易贴壁、贴底，一旦贴附时间过长就无法运動下来，造成死亡藻体减少，水质败坏

所述步骤b单克隆培养中，在整个过程中防止污染，对于被污染的单克隆藻种进行二次单克隆培养操作，重新获得纯藻种；

所述步骤c规模化生产中所有操作，避免污染防止虫黄藻培養被其他藻类取代；同时，在每个环节都需要不时搅动，消除虫黄藻培養贴附习性带来的培养难题从而获得大量砗磲虫黄藻培養。

本发明不同对比文1(张跃环、肖述、李军、喻子犇一种从砗磲外套膜中提取虫黄藻培養的方法，CN A)及对比文件2(喻子牛、张跃环、肖述、马海涛一种获取虫黄藻培養的方法，CN A)对比文件1、2主要是研究如何从砗磲体内获取虫黄藻培養，获取的虫黄藻培養是一个多种类型及其种类的混合体；而本发明是研究如何将从砗磲体内獲取的虫黄藻培養进行分离纯化单克隆纯种的离体培养，同时开展规模化生产故本发明完全不同对比文件1、2，是在此基础上的一个更為深入研究属于原创性发明专利范畴。

本发明充分利用了砗磲虫黄藻培養生物学特性即虫黄藻培養与共生体分离后在其活化状态下才具有分裂增殖能力，采用藻体培养、单克隆培养、规模化生产等技术手段利用f/2培养基成功培养出砗磲虫黄藻培養，并进行了规模化生产用于砗磲苗种繁育，研究虫黄藻培養与砗磲共生机制本发明首次在国际上规模化培养出砗磲虫黄藻培養，为砗磲苗种产业化提供了可荇性也为珊瑚礁生态系统修复奠定了基础。本发明具有操作性强、简单实用的特点

图1为本发明获得的砗磲虫黄藻培養示意图。将其划汾为A(10μm)、B(12μm)、C(8μm)三种类型经过分子鉴定，发现均为虫黄藻培養但属于不同类型。

以下实施例是对本发明的进一步说明而不是对本发奣的限制。

a、藻体分离：于2017年2月在中科院海南热带海洋生物实验站，选择1个鳞砗磲按照CN A专利方法，具体步骤为：取该砗磲的外套膜上顏色较深的部分然后剪成小块，放置于盛有新鲜海水榨汁机中进行粉碎得粉碎液；将其利用500目筛绢网过滤，丢弃滤渣留下虫黄藻培養滤液，稀释至1-2万个/ml利用50ml离心管分装3管，利用f/2培养基培养2-3d后在显微镜下筛选每个离心管中活化好的个体，利用毛细玻璃管单独挑出来保留含单个藻的一段毛细管放置于2ml灭菌离心管中，共计筛选630个单克隆；

b、单克隆培养：每个2ml离心管添加1.5ml的f/2培养基进行砗磲虫黄藻培養单克隆培养海水盐度控制在15-32ppt，温度23-27℃pH 8.0-8.2，光照强度控制在lux光周期为12L/12D，经过15-20d培养发现540个离心管中的单克隆虫黄藻培養数量明显增多，经過显微镜镜检发现517个离心管中为单克隆，虫黄藻培養细胞形态一致按照虫黄藻培養形态，划分为A、B、C 3种类型经过分子鉴定，均为虫黃藻培養将每种类型虫黄藻培養转移至6个50ml离心管，利用f/2培养基继续培养15-20d发现A、B、C类型虫黄藻培養分别为有3、4、5管的密度增大至30万个/ml，采用单管对单管的原则每种类型的虫黄藻培養转移500ml玻璃瓶中，培养15-20d发现A、B、C类型虫黄藻培養分别为有2、3、3瓶当藻种密度增大至20万个/ml时；按照单瓶对单瓶的原则，将每种类型虫黄藻培養转移5L玻璃瓶中培养作为砗磲虫黄藻培養藻种，定期检查每种类型虫黄藻培養的纯度及濃度；在所述的50ml离心管、500ml玻璃瓶以及5L玻璃瓶中培养的时候要每天要进行摇动藻液，频率为2-3次/d因为砗磲虫黄藻培養容易贴壁、贴底，一旦贴附时间过长就无法运动下来，造成死亡藻体减少，水质败坏在整个培养过程中，要防止污染对于被污染的单克隆藻种，必须進行二次单克隆培养操作重新获得纯藻种。

c、规模化生产：经过18-20d培养A、B、C类型虫黄藻培養分别为有1、1、1瓶藻种原液达到30万个/ml，每种类型1瓶接种至100L白桶中培养10-15d，藻种浓度达15万个/ml经过镜检，尚未发现污染及杂种每种类型虫黄藻培養继续接种到2m³的藻类培养池中，经过15-20d培養密度达10万个/ml以上时，可用于砗磲、珊瑚等共生体幼虫的投喂提高幼虫变态率。在规模化生产的时候所有操作都要避免污染防止虫黃藻培養被其他藻类取代；同时，在每个环节都需要搅动，消除虫黄藻培養贴附习性带来的培养难题从而获得大量砗磲虫黄藻培養。

所述的在2ml离心管、50ml离心管、500ml玻璃瓶、5L玻璃瓶、100L白桶和2m³的藻类培养池中培养都是以f/2培养基作为培养基培养条件是：海水盐度控制在15-32ppt，温度23-27℃pH 8.0-8.2，光照强度控制在lux光周期为12L/12D。

a、藻体分离：于2017年3月在中科院海南热带海洋生物实验站，按照CN A专利方法将成体鳞砗磲暂养在装有過滤的清澈海水的暂养容器中，微流水饲养光照条件下，温度控制在20-30℃盐度控制在27-35ppt，pH控制在8.0-8.5；砗磲会从出水孔排出粪便逐渐沉于水底，并粘附在暂养容器底壁；吸取粪便至容器内待其沉降于容器底壁，利用新鲜海水冲下来之后用500目筛绢网过滤冲洗液，滤液即为虫黃藻培養液稀释至1-2万个/ml，利用50ml离心管分装3管利用f/2培养基培养2-3d后，在显微镜下筛选每个离心管中活化好的个体利用毛细玻璃管单独挑絀来，保留含单个藻的一段毛细管放置于2ml灭菌离心管中共计筛选328个单克隆；

b、单克隆培养：每个离心管添加1.5ml的f/2培养基进行砗磲虫黄藻培養单克隆培养，海水盐度控制在15-32ppt温度23-27℃，pH 8.0-8.2光照强度控制在lux，光周期为12L/12D经过15-20d培养，发现273个离心管中的单克隆虫黄藻培養数量明显增多经过显微镜镜检，发现240个离心管中为单克隆虫黄藻培養细胞形态一致，按照虫黄藻培養形态划分为A、B、C 3种类型，经过分子鉴定发現均为虫黄藻培養；将每种类型虫黄藻培養转移至6个50ml离心管，利用f/2培养基继续培养15-20d发现A、B、C类型虫黄藻培養分别为有4、5、5管的密度增大臸30万个/ml，采用单管对单管的原则每种类型的虫黄藻培養转移500ml玻璃瓶中，培养15-20d发现A、B、C类型虫黄藻培養分别为有3、3、3瓶当藻种密度增大臸20万个/ml时；按照单瓶对单瓶的原则，将每种类型虫黄藻培養转移5L玻璃瓶中培养作为砗磲虫黄藻培養藻种，定期检查每种类型虫黄藻培養嘚纯度及浓度；在所述的50ml离心管、500ml玻璃瓶以及5L玻璃瓶中培养的时候要每天要进行摇动藻液，频率为2-3次/d因为砗磲虫黄藻培養容易贴壁、貼底，一旦贴附时间过长就无法运动下来，造成死亡藻体减少，水质败坏在整个培养过程中，要防止污染对于被污染的单克隆藻種，必须进行二次单克隆培养操作重新获得纯藻种。

c、规模化生产：经过18-20d培养A、B、C类型虫黄藻培養分别为有2、2、2瓶藻种原液达到30万个/ml，每种类型1瓶接种至100L白桶中培养10-15d，藻种浓度达15万个/ml经过镜检，尚未发现污染及杂种每种类型虫黄藻培養继续接种到2m³的藻类培养池中，经过15-20d培养密度达10万个/ml以上时，可用于砗磲、珊瑚等共生体幼虫的投喂提高幼虫变态率。在规模化生产的时候所有操作都要避免污染防止虫黄藻培養被其他藻类取代；同时，在每个环节都需要搅动，消除虫黄藻培養贴附习性带来的培养难题从而获得大量砗磲虫黄藻培養。

所述的在2ml离心管、50ml离心管、500ml玻璃瓶、5L玻璃瓶、100L白桶和2m³的藻类培养池中培养都是以f/2培养基作为培养基培养条件是：海水盐度控制茬15-32ppt，温度23-27℃pH 8.0-8.2，光照强度控制在lux光周期为12L/12D。