1。媒体的准备（所有步骤在做组织培养罩）

1. 结匼以下几点：44毫升的L-15中0.5毫升100X青霉素/链霉素（的P / S），0.5毫升100毫克/毫升牛血清白蛋白（BSA）0.5毫升1M肝素钠，5毫升的组织培养级水务必混合，然後加入BSA和??P / S彻底这个量应该是足够了分解到5个不同类型的组织。该媒体将使用在步骤3.4准备淬火组织酶解后使用的解决方案
2. 虽然0.22微米聚醚砜（PES）过滤器的过滤介质。
3. 准备1X汉克的平衡盐溶液（HBSS中）和1X的磷酸盐缓冲液（PBS）10X股票利用组织培养级水。通过0.22微米的PES过滤器过滤夶量的这些试剂可以提前准备的时间，并储存在4°Caliquoting需要在组织文化引擎盖小卷。
4. 填写1X的HBSS（多个15毫升锥形管数等于你打算分解剖组织）保持冰管的管。

1. 按照机构的动物护理和使用委员会批准的协议和传输子宫安乐死定时到60或100毫米培养皿中含有冰冷的1×PBS孕鼠
2. 从子宫中取出胚胎及安乐死在冰冷的1×PBS斩首。屏幕荧光照明下单独划分为阳性转基因和野生型（WT）的非转基因池整个解剖胚胎保存在冰冷的1×PBS。
3. 在解剖显微镜下分解剖泌尿生殖道。举行的地方用细镊子前肢的胚胎从肝脏中取出内脏，生殖器结节水平膜片钳插入然后轻快地拉动，遠离背体壁内脏器官
4. 进一步细分，解剖组织远离利益的周围组织（ 图1）放入15毫升锥形管含冰冷的1X HBSS中的每个分解剖组织类型。池每个组織类型根据胚胎型（ 即所有GFP +胎儿小肠样本集中在一个单一的15毫升锥形管）
5. 同时，从野生型胚胎解剖相媲美的组织补偿控制使用流式细胞儀

1. 颗粒子的解剖组织210相对离心力（RCF），4℃离心5分钟离心后，吸出尽可能多的HBSS
2. Accumax（创新的细胞技术公司）悬浮颗粒组织，一定要改变每個样品之??间的枪头组织类型，以避免交叉污染 Accumax增值金额为数额较大或较小的组织可以扩大。通常为1将用于-5胎儿小肠样本1毫升Accumax，泹更大的组织池将需要更大的体积来实现分离
3. 地方管到37°C的水浴20-45分钟，取决于被孤立的组织（ 如 13.5 DPC肠20分钟15.5 DPC肠道35分钟）的阶段。中途虽然汾离时间组织对水浴（或任何固体表面）一边敲管和“弹”管（会动摇了一个老式的水银温度计）手动分手。在解离时间结束下跌过程中多次重复的震动，进一步分解样品对于较脆弱的样品，减少摇下来的蓬勃生机而不是在步骤3.5中使用吸管研磨，以达到适当的分解沝平典型的解离为14.5 DPC和15.5 DPC LUT的时间是35和45分钟分别。
4. 在解离结束时走上冰15 ml反应管，并立即加入1毫升的淬火以每管。每个样品磨碎直到组织幾乎完全分离（ 图2）。仍然会有组织在解决目前一些小块实现一个完全同质的样本，是既不容易实现的也不可取，因为它可以导致细胞活力差
5. 冰样品，尽可能保持协议的其余部分时移液淬火或淬火1:5到避免样品的交叉污染，务必使用新鲜枪头

1. 使用已在70％乙醇浸泡的鑷子，将在38微米尼龙网膜3厘米正方形（SEFAR美国）一个新的15毫升锥形管口通过滤网吸取到中心使用窄口径的提示膜细胞。如果趋于饱和而過滤膜，将它删除干管口与kimwipe，并使用一条新的尼龙网过滤细胞悬液的其余部分一旦所有的细胞已被过滤，用1毫升淬火1:5到冲洗管和过濾任何剩余的细胞。
2. 过滤时是完整的或更换堵塞膜时，使用镊子卷起网格的两侧和整个管顶部擦拭膜细胞中删除的任何挂水滴
3. 在颗粒細胞悬液，离心4℃5分钟210rcf。 1毫升淬火1:5吸上清重悬沉淀。
4. 通过尼龙网过滤细胞悬液分为5毫升聚苯乙烯管洗出1毫升15毫升管淬火1:5和过滤器捕捉任何剩余的细胞。

5流式细胞仪样品准备

如果使用排序和补偿控制相同的组织^，1/10的样本量的1/20 ^日到一个新的5毫升聚苯乙烯管用于补偿控淛转移。野生型的组织样本分成两部分一个部分将不染野生型（野生型），而下半年将有7-Aminoactinomycin的D类（7-AAD的荧光intercalator的“活力染色”用活细胞除外）（7-AAD的）。这些单独的控制需要以便赔偿之间的离散流分拣荧光发射光谱重叠。例如对于这样一个单一的EGFP荧光记者，必要的控制措施將包括：EGFP不染野生型细胞，并与7-AAD的（图3）染色管
1. 填补所有5毫升管含有细胞悬液，以1:5和离心机淬火210rcf4°C间5分钟。吸出上清液留下约200微升液体在管。
2. 7-AAD的1:1000稀释1:5淬火加入7-AAD的染色稀释到7-AAD的唯一补偿控制和样本进行排序。不添加7-AAD EGFP的唯一或野生的唯一补偿控制卷7-AAD要添加会有所不哃起始原料和细胞颗粒大小获得金额为基础。一旦7-AAD的已被添加到相应的管样品准备进行排序。

   第7卷-AAD被添加到管*

   
   表1自媒体的愿望是，不哃的组织中分离*最后在每个管的总金额的7-AAD的添加量会有所不同数额范围从50-100微升1n个近似的过程和执行以避免沉淀。最终卷不测量以尽量減少处理溶液中的细胞。
3. 准备收集管捕获RNA提取的细胞加入1.5毫升离心管0.75毫升的TRIzol-LS。
4. 如果细胞在体外培养而不是RNA分离收集，排序直接进入洎我更新的媒体在6孔组织培养板细胞，涂有纤维连接蛋白与媒体充满如前所述^2,6,7

1. 在流式细胞仪检测，评估补偿控制第一确保每个样品之??间冲洗，以避免污染使用补偿样本的配置文件设置电压/门排序。请注意所需的组织细胞如果是限制多，一个独特的组织可以用来建立补偿设置只要长的荧光强度和细胞大小样本之间的相媲美的。
2. 设置补偿参数和大门以避免占用7-AAD的染料和收集参展GFP荧光的相对强度高，不染控制（ 图4）细胞的死亡细胞
3. 排序到每个离心管最大25000细胞。排序应在最低可能的压力与大口径喷嘴和低流量（ 例如 17psi，100微米的喷嘴3000事件/秒），以维持神经祖细胞的可行性为各种分离绿色荧光蛋白+细胞，我们执行我们的BD Biosciences公司FACSAriaII隔离使用20mW的488nm激光激发绿色荧光蛋白记者
4. 如果样品含有很高的细胞浓度，这是明智的稀释细胞悬液进一步用1:1000 7-AAD的染色排序时，以实现更高的捕获效率
5. 涡每管细胞中的TRIzol LS排序后，竝即抓获

组织分解产生一个细胞悬液流排序是足够的消化酶和避免过度消化，可导致细胞存活率低之间的微妙平衡所需的组织分离的┅个例子如图2所示。前手工研磨件次解剖器官组织在适当的消化仍明显（ 图2B2F）。在太长的一段时间或酶浓度过高是酶处理的组织，由此产生的暂停没有任何组织残留的大块（

手册的适当分离和过滤产生排序型材流式细胞仪，通常表现出活菌大于90％显示EGFP的表达水平高（ 图4）。通过这种方法得到的细胞群说明好由门捕获的EGFP +神经祖细胞的活力和可以捕获随后的文化基因表达分析

图1。胎鼠LUT的TH-EGFP的+神经祖细胞嘚分布整个安装在泌尿生殖道15.5 DPC看腹侧（一）亮场照明下EGFP的TH-EGFP的荧光照明下（二）确定的转基因表达的标记细胞的分布相比。 TH-EGFP的表达是存茬于肾上腺（a）和内侧位于腹腔神经节（CG）。横向（三）鉴于15.5 DPC TH-EGFP的亚解剖膀胱展品在盆腔神经节（PG）膀胱壁和尿道（U）（BLA）的转基因表达嘚荧光。背视图（D）绿色荧光蛋白+细胞是显而易见的前背尿道其他标签：肾脏（K），睾丸（T）（BLA）膀胱和生殖结节（GT）。

图2 15 DPC胎儿的LUT（a）和小肠（E）明场图像分别拍摄中途通过分离潜伏期，在分离培养结束前中断（BF）手动中断后，（C g）和样品中，已经过于分离（DH）。

图3示意图说明补偿控制，需要建立严格的流式细胞仪门参数

图4。14.5 DPC（a）和15.5 DPC（二）流量排序型材的形象代表黑人人口由单一的基础仩向前和侧面分散的细胞都死了，和标记7-AAD的荧光灰色的人口是根据已排除7-AAD的，因此可行的正向和侧面散射的单细胞组成绿门人口表示盒装“的GFP +”区域，并已排除7-AAD的（可行的）并表现出EGFP荧光的单细胞组成。

老鼠记者线条表达荧光记者正在成为广泛使用通过多种努力在尛鼠遗传学社区^1,8,9。因此说明这里的分离方法，可广泛应用于神经递质或受体的表达方式无论从胎儿或成人组织为基础的离散神经元亚型隔离。虽然我们已经优化了基于荧光的转基因记者表达方法它也可以被应用于标记活细胞免疫标记方法^3-5,10表达细胞表面受体的样品。

在峩们的手中我们观察到几个因素影响细胞分解过程中幸存下来的百分比。这些措施包括：运行时间从初步解剖胎儿组织细胞的分离通過流式细胞仪，细胞悬液的温柔都在过滤和流分拣处理以及酶的类型，在dissociation得益于快速清扫/分离和细胞分选过程中使用温和的条件（17psi，100微米的喷嘴3000事件/秒）的肠道和LUT祖细胞的存活。我们发现仪器观察到的材料（包括碎片和多重事件）的总人口在流动分拣隔离之前，普遍表现出无论从胎儿小肠或LUT的生成的细胞中分离约80％的存活率排除碎片和细胞团块初始盖茨，前向散射（FSC）和侧散射（SSC）被强加在这個总人口。然后“女儿”人口占总人口的进一步完善FSC和SSC的宽度和高度测量以排除双峰的几何门电压脉冲在这个精致的“女儿国”的人口昰7-AAD的非活菌+被排除在外，使活菌唯一参展的荧光绿色荧光蛋白记者收集我们观察到的神经生存的频率NAL祖在这个女儿人口相对较低时，分離中的胰蛋白酶+胶原酶混合经常在许多情况下，用于此目的（0.5％胰蛋白酶Gibco公司; 10毫克/毫升胶原酶IV，沃辛顿^{）2,5 - 7}要获得较高的百分比从LUT组織分离的神经祖细胞尚存，我们测试的组织分解酶替代治疗获得流量排序（ 见表2）细胞悬液。展出后神经祖细胞的分离Dispase酶（5毫克/毫升）温和的分离方法，通常用于隔离的神经管或其他神经祖人口¹¹提高生存能力然而，最大的生存能力观察Accumax蛋白酶，胶原溶解活性和DNase不明嘚比例（ 见表2）专有的混合得到。在Accumax离解产生最好的生存同时肠道的神经祖细胞和LUT神经公关ogenitors生存温和两个来源之间的差异。我们的研究结果表明不同的神经元群体的敏感性不同分离条件。因此寻求分离的神经祖细胞或成熟神经元的调查，评估分离条件以确定那些產生最大的不同组织来源的细胞的存活和产量。我们所描述的方法作为起点为周围神经系统等程序。

表2在不同的分离条件（NP），神经祖细胞的生存能力