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【求助】我用的是PVDF膜，已做过了一抗二抗，想把上面一抗二抗洗掉换另外抗体做，谁有洗脱液配方及操作方法
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我用的是PVDF膜，已做过了一抗二抗，想把上面一抗二抗洗掉换另外抗体做，谁有洗脱液配方及操作方法
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我们是用氢氧化钠洗
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lz 是想striping, 是吧我有个站里大牛介绍过的他的方子, 对他的磷酸化蛋白 很管用, 我试过一次对我的不太管用.你不妨试试, 原帖我找不到, 我把我存的贴在这里将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去（strip）,strip solution如下:100mM 2-mercaptoethanol (stock 14.335M, 取697.6ul)2% SDS (stock 10%, 取20ml)62.5mM Tris (pH6.7)(stock 1M, 取6.25ml)加水至100ml然后50度水浴30min.许多人会建议55度水浴30min。Stripsolution是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为55度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50度30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55度更能保护蛋白.12. Strip时一定要注意：membrane一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，
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【精品专业论文】小鼠精子获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白质的研究,生物工程,生物学,基因,生物,DNA,生态,生态保护,硕士论文,精品专业论文
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【精品】小鼠精子获能过程中酪氨酸磷酸化蛋白质的研究
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（生物化学与分子生物学专业优秀论文）大鼠背根神经节细胞质膜蛋白质组学研究.pdf 167页
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··········
··········
membrane，PM)是所有细胞的结构基础。质
细胞质膜(plasma
膜蛋白质执行细胞与外界环境以及细胞与细胞之间的物质交换、能
量转换和信号传递等功能。在已经发现的药物靶标中，大约有2／3
是质膜蛋白质。因此，细胞质膜蛋白质组学研究具有重要的理论意
义和应用前景。然而，尽管近年来蛋白质化学与蛋白质组学研究技
术取得了很大的发展，但膜蛋白尤其是整合膜蛋白的分析仍然是一
个巨大的挑战，这是因为大多数膜蛋白质不仅丰度低，而且由于疏
水性强而溶解性差和易于聚集沉淀，给蛋白质的提取、酶解和鉴定
带来了很多困难，因此质膜蛋白质组学研究成为蛋白质组学研究中
背根神经节(dorsal
ganglion，DRG)细胞是一种初级感觉神
经元，能传导触觉、痛觉、温觉等神经冲动。它们沟通脊髓与机体
内外环境的联系，不仅传输和调节机体的各种感觉，而且还具有接
受和传递机体各种伤害性感受的功能，因而在神经病理性疼痛的发
生与维持中起着重要的作用。开展DRG细胞膜蛋白的研究具有重要
意义，将为探讨神经系统疾病的发生机制、疾病的诊断和新药开发
将提供重要的理论基础。由于大鼠DRG神经组织体积较小而质膜蛋
白质又大多具有低丰度和强疏水性的特点，所以在样品的采集、溶
解和蛋白质鉴定等方面给DRG细胞质膜蛋白质组学研究带来了更
大的挑战。
为了从少量DRG细胞样品中综合性分析鉴定质膜蛋白质，本研
知识水坝@damdoc
究采用了差速离心结合双水相法富集大鼠DRG质膜的策略。Wegem
blotting结果显示经过这种富集策略处理的样品中质膜相对浓度是差
速离心后的2．3倍，是粗匀浆样品的15倍。鉴于传统的二维凝胶电
泳不适合膜蛋白质的分离，所以采用了SDS．PAGE来分离DRG质
定和生物信息学分析。通过IPI数据库的搜索，共得到了729个非冗
为了更好地鉴定DRG细胞质膜上的蛋白质尤其是低丰度蛋质，
随后的研究中，在DRG质膜的双水相富集后增加了高盐高pH洗涤
的步骤和Shotgun消化策略。本次研究共鉴定了954个蛋白质，通
和334个蛋白质。在954个鉴定的蛋白质中，有205个蛋白质明确
定位在质膜。这些质膜蛋白质包括细胞结构蛋白质(22．8％)，信号和
受体蛋白质(25．7％)，离子通道和转运蛋白质(24．3％)，酶(8．3％)，
细胞黏附因子(12．1％)以及一些具有其它功能的蛋白质(6．8％)。
更多的低丰度的质膜蛋白质(包括离子通道蛋白和受体蛋白)得到
了鉴定，如chloride
intracellpLarprotein4(IPl)，
channel(IPl)，Isoformof
sigma1一type
168)等。这些研究有助于我们加深对DRG细胞
receptor(IPl00202
质膜蛋白质在细胞与外界环境进行物质和能量交换、信号传导等方
面的理解。
大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白质来
知识水坝为您倾心整理(小店)如需格式转换服务请发豆丁站内信或联系QQ@
知识水坝@damdoc
完成的。因此，蛋白质复合物的研究己成为蛋白质组学中最重要研究
内容之一。本研究用含温和去垢剂的缓冲液提取大鼠DRG细胞细胞
的方法对复合物进行电泳分离并用CapLC．MS／MS进行分析。一共
鉴定了460个非冗余蛋白质，包括属于若干细胞浆和膜组分的蛋白
质复合物的亚基。
关键词：蛋白质组学，双水相分离，背根神经节，质膜，SDS—PAGE，
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【求助】200kD蛋白转膜，急。。。
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这个帖子发布于12年零252天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
7.5胶，bio－rad湿法。330mA 4h，胶考染30m依然可见明显蛋白残留。不知是胶浓度依然高，还是转膜液配方问题，或者别的。转膜液配方：3.03g tris＋14.4g gly＋200mlmethol/L求助于各位大侠！具体的建议最好了。谢了
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140ma转膜过夜,湿法,转膜液配方相同,我做过460和350的蛋白
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请问过夜具体是指多少个小时呢？
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以下是相关资料，对你或许有些帮助。Western Blot详解
19:24:39 来源：生命经纬
AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。CC. 采用tank system有什么讲究？解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 14－16hrs。DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。EE. 膜一般要如何处理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF. 如果是6×8转印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。解答：无要求。HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。 II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge， 湿转36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF转移膜：PVDF是一种***度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以 作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。5. Marker的相关疑问MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！ 解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。6. 染色的选择OO. Western Blot哪种染色好？解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去 ，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。7. 参照的疑问PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗？解答：分析一般的结果没问题。RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？解答：不是的， 半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？解答：选用beta-actin就可以。8. 缓冲液配方的常见问题UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为 0.1%，不会是封闭液的问题吧？解答：可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.来源于：http://zhidao.baidu.com/question/627655.html
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