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糖化血红蛋白几种常见检测方法
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血红蛋白属于哪类蛋白质它的吸收光谱反映它的什么结构成分
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血红蛋白属于运输蛋白质，负责运载氧的一种蛋白质。血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。也是红细胞中唯一一种非膜蛋白。人体内的血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。血红蛋白的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子抱在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。血红素分子是一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合，当血红蛋白不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当血红蛋白载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。血红蛋白是脊椎动物红血细胞的一种含铁的复合变构蛋白，由血红素和珠蛋白结合而成。其功能是运输氧和二氧化碳，维持血液酸碱平衡。也存在于某些低等动物和豆科植物根瘤中。分子量约67 000，含有四条多肽链，每个多肽链含有一个血红素基团，血红素中铁为二价，与氧结合时，其化学价不变，形成氧合血红蛋白。呈鲜红色，与氧解离后带有淡蓝色。有多种类型：血红蛋白A(HbA)，α2β2，占成人血红蛋白的98%；血红蛋白A2(HbA2)，α2δ2，占成人血红蛋白的2%；血红蛋白F(HbF)，α2γ2，仅存在于胎儿血中；血红蛋白H(HbH)，β4，四个相同β链组成的四聚体血红蛋白；血红蛋白C(HbC)，β链中Lys被Glu取代的血红蛋白；血红蛋白S(HbS)，镰刀状细胞红蛋白；血红蛋白O2(HbO2，HHbO2)，氧合血红蛋白；血红蛋白CO(HbCO)，一氧化碳结合血红蛋白。在没有氧存在的情况下，四个亚基之间相互作用的力很强。氧分子越多与血红蛋白结合力越强。中心离子铁(II)进一步和蛋白质链中的组氨酸结合，成为五配位。既是配位中心，又是活性中心。血红蛋白中铁(II)能可逆地结合氧分子，取决于氧分压。它能从氧分压较高的肺泡中摄取氧，并随着血液循环把氧气释放到氧分压较低的组织中去，从而起到输氧作用。一氧化碳与血红蛋白的结合较氧强，即使浓度很低也能优先和血红蛋白结合，致使通往组织的氧气流中断，造成一氧化碳中毒（使氧气与血红蛋白的结合能力下降，使人窒息而死亡）。
实验二 血红蛋白 及其衍生物的吸收光谱测定
目的要求 掌握722型分光光度计的使用 型分光光度计的使用 掌握 了解血红蛋白及其衍生物的吸收光谱的测定 掌握血红蛋白标准曲线的绘制
实验原理 分光光度计的使用 溶液中的物质在光的照射激发下，产 溶液中的物质在光的照射激发下， 生了对光吸收的效应， 生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是 具有选择性的， 具有选择性的，各种不同的物质都具有其 各自的吸收光谱， 各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶 液时，其能量就会被吸收而减弱， 液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量 减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关 也即符合于比色原理---朗伯 朗伯-比耳定律 系，也即符合于比色原理 朗伯 比耳定律
朗伯比尔定律： 朗伯比尔定律： A=εlc A：物质的吸光度 ε：摩尔吸光系数 l：液层的厚度 c：溶液的浓度
比色皿的使用 ? 手持毛玻璃面，不可触碰光滑面 手持毛玻璃面， ? 使用前要再用少量（大约1-2ml）待测溶液 使用前要再用少量（大约 ） 润洗1次 润洗1次 ? 使用时比色皿光滑面对准光路 ? 使用后及时清洗（用海绵刷沾取肥皂液清 使用后及时清洗（ 洗比色皿，并用自来水冲洗干净， 洗比色皿，并用自来水冲洗干净，随后用 蒸馏水润洗1-2次 蒸馏水润洗 次）
血红蛋白及其衍生物的吸收光谱测定 血红蛋白(Hb)与O2结合生成氧合血红蛋白 与 结合生成氧合血红蛋白 血红蛋白 (HbO2)，与CO结合生成碳氧血红蛋白 结合生成碳氧血红蛋白 ， 结合生成碳氧血红蛋白(HbCO)。 。 因其血红蛋白分子结构不同，当光线分别透 因其血红蛋白分子结构不同， 过各种Hb溶液时，所吸收的光波也各异， 过各种 溶液时，所吸收的光波也各异，可显 溶液时 出特有的吸收光谱。 出特有的吸收光谱。这些吸收光谱可作为它们定 性和定量分析的基础。 性和定量分析的基础。
在可见光波长400~600nm范围 如HbO2在可见光波长 范围 内有3个特征的吸收峰，其峰值分别在 内有 个特征的吸收峰，其峰值分别在415、 个特征的吸收峰 、 541和576nm处，当氧合血红蛋白转为碳氧 和 处 血红蛋白（HbCO），此时光谱发生改变， ），此时光谱发生改变 血红蛋白（ ），此时光谱发生改变， 在波长419、540和569nm处出现三个特征 、 在波长 和 处出现三个特征 的吸收峰，其中在 范围内2个 的吸收峰，其中在500~600nm范围内 个 范围内 特征的吸收峰如下图。 特征的吸收峰如下图。
项目 HbO2 HbCO 吸收峰数 2 2 吸收光谱（ ） 吸收光谱（nm） 541 577 540 569
本实验先制备Hb及其衍生物， 本实验先制备 及其衍生物，然 及其衍生物 后在不同波长下测其光吸收度， 后在不同波长下测其光吸收度，以吸 光度（ ） 又称光密度）为纵坐标， 光度（A）（又称光密度）为纵坐标， 波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线， 波长为横坐标绘制成吸收光谱曲线， 由此可以确定它们最大的吸收波长。 由此可以确定它们最大的吸收波长
仪器和试剂 1．仪器：试管；吸量管； 量筒；722型分 ．仪器：试管；吸量管； 量筒； 型分 光光度计； 发生器 发生器。 光光度计；CO发生器。 2．试剂： ．试剂： （1）浓H2SO4； ） （2）甲酸； ）甲酸； （3）蒸馏水； ）蒸馏水； （4）血红蛋白溶液。 ）血红蛋白溶液。 （5）NaOH； ） ；
实验操作 预热仪器 选定波长 调节“ 点 调节“0”点 调节T=100％ 调节T=100％ T=100 测定 关机 分光光度计的使用
1．样品的制备： ．样品的制备： 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动， 用草酸钾抗凝，取静脉血，边取边轻轻摇动， 即制得全血。 即制得全血。 （1）氧合血红蛋白（HbO2）液： ）氧合血红蛋白（ 加蒸馏水20ml， 取全血 ， 取全血0.1ml（3滴）盛于 加蒸馏水 （ 滴 小烧杯中，混匀，此即HbO2液，呈鲜红色。 呈鲜红色。 小烧杯中，混匀，此即 （2）碳氧血红蛋白（HbCO) 液： ）碳氧血红蛋白（ 取上述HbO2液约 液约5ml于试管中，通CO气体 于试管中， 取上述 于试管中 气体 浓硫酸与甲酸在CO发生器中反应发生）约10 发生器中反应发生） （浓硫酸与甲酸在 发生器中反应发生 即变成樱桃红色的 溶液。 秒钟，HbO2即变成樱桃红色的HbCO溶液。 秒钟， 溶液
2．吸光度测定： ．吸光度测定： （1）将如上制备的 种血红蛋白液分别 ）将如上制备的2种血红蛋白液分别 盛于比色杯内， 盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸 型分光光度计上以蒸 馏水为空白调节吸光度零点和100%（每一 馏水为空白调节吸光度零点和 （ 次读数均应用空白管调节零点和100%）。 次读数均应用空白管调节零点和 ）。 （2） 先从波长 ） 先从波长500~600nm分别测定 分别测定 HbO2，碳氧血红蛋白的吸光度（在相应峰 碳氧血红蛋白的吸光度（ 值的10nm范围内每隔 值的 范围内每隔2nm记录一次吸光度 记录一次吸光度 范围内每隔 读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读 读数，其余均每隔 记录一次吸光度读 数）。
3.吸收光谱曲线的绘制 吸收光谱曲线的绘制 以吸光度为纵坐标， 以吸光度为纵坐标，波长为横坐标描 并将各点连接成曲线， 点，并将各点连接成曲线，即为血红蛋白 及其衍生物的吸收光谱，但由于使用仪器 及其衍生物的吸收光谱， 不同， 不同，绘制出的血红蛋白及其衍生物的吸 收光谱必有一些差异，对722型分光光度计 收光谱必有一些差异， 型分光光度计 来说，峰值误差在± 来说，峰值误差在±3nm~5nm波长内是允 波长内是允 许的。 许的。
注意事项 分光光度计应放在干燥处，使用温度为5 35℃ 35℃。 分光光度计应放在干燥处，使用温度为5~35℃。远 离强电场、 离强电场、磁场 为了防止光电管疲劳。 为了防止光电管疲劳。不测定时必须将比色皿 暗箱盖打开，使光路切断， 暗箱盖打开，使光路切断，以延长光电管使用寿命 每次做完实验时， 每次做完实验时，应立即洗净比色皿 当仪器停止工作时，切断电源， 当仪器停止工作时，切断电源，电源开关同时 切断。并且用套子盖住仪器， 切断。并且用套子盖住仪器，做好使用登记
思考题 ? 1、什么叫吸收光谱？测定血红蛋白及其衍 、什么叫吸收光谱？ 生物的吸收光谱有何意义？ 生物的吸收光谱有何意义？ ? 2、Hb属于哪类蛋白质，它的吸收光谱的特 属于哪类蛋白质， 、 属于哪类蛋白质 征反映它的什么结构成分？ 征反映它的什么结构成分？
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由于经皮血氧饱和度测试仪使用两种光的波长来检测，它们只能够区别两种类型的血红蛋白：血红蛋白（Hb)和氧结合血红蛋白（02Hb)。鉴于其他类型的血红蛋白如碳氧血红蛋白（CoHb)或高铁血红蛋白（MetHb)在相同的波长下也吸收和红外光，它们的存在影响动脉血氧饱和度测量，而量化它们的影响尚不能确定。经皮血氧监测仪假设仅仅"有作用的"血红蛋白（02Hb或Hb)存在，且血氧饱和度仅依据它们的数量进行计算。在失去功能的血红蛋白存在时,一个多波段的CO-血氧饱和度检测仪可以使血氧饱和度的测量更精确，因为它具有能够检测到碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白存在的波长的光。例如，在碳氧血红蛋白存在时，用有限的分析氧结合血红蛋白的血氧监测仪的波长来检测（碳氧是猩红色），这将虚假地提高血氧饱和度的读数。脉氧监测仪测定高铁血红蛋白的血氧饱和度为85%,所以逐渐升高的高铁血红蛋白经脉氧监测仪测定一直为85%,所以无论真正的血氧饱和度是多少，逐渐升高的高铁血红蛋白使脉氧饱和度波形始终维持在85%。当怀疑存在大量异常血红蛋白时，应该应用一个多波段的C0-血氧饱和度检测仪监测血氧。胎儿血红蛋白的存在还没有表现出会明显影响...
由于经皮血氧饱和度测试仪使用两种光的波长来检测，它们只能够区别两种类型的血红蛋白：血红蛋白（Hb)和氧结合血红蛋白（02Hb)。鉴于其他类型的血红蛋白如碳氧血红蛋白（CoHb)或高铁血红蛋白（MetHb)在相同的波长下也吸收和红外光，它们的存在影响动脉血氧饱和度测量，而量化它们的影响尚不能确定。经皮血氧监测仪假设仅仅"有作用的"血红蛋白（02Hb或Hb)存在，且血氧饱和度仅依据它们的数量进行计算。在失去功能的血红蛋白存在时,一个多波段的CO-血氧饱和度检测仪可以使血氧饱和度的测量更精确，因为它具有能够检测到碳氧血红蛋白和高铁血红蛋白存在的波长的光。例如，在碳氧血红蛋白存在时，用有限的分析氧结合血红蛋白的血氧监测仪的波长来检测（碳氧是猩红色），这将虚假地提高血氧饱和度的读数。脉氧监测仪测定高铁血红蛋白的血氧饱和度为85%,所以逐渐升高的高铁血红蛋白经脉氧监测仪测定一直为85%,所以无论真正的血氧饱和度是多少，逐渐升高的高铁血红蛋白使脉氧饱和度波形始终维持在85%。当怀疑存在大量异常血红蛋白时，应该应用一个多波段的C0-血氧饱和度检测仪监测血氧。胎儿血红蛋白的存在还没有表现出会明显影响脉搏血氧饱和度测量的准确性，因为它的光吸收性和成人血红蛋白类似。
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