在抽提RNA时，有脸上色素沉着怎么去除污染，怎样去除色

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-04-29 01:30 标签： 黑色素沉淀怎么去除
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没有啊，而且怀化到吉首就两个小时车程
高速中途没有旅馆的
有啊！凌晨到吉首都有。
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【求助】在抽提RNA时，有色素污染，怎样去除色素？
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这个帖子发布于10年零246天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位高手，我最近在提取RNA时，遇到了色素污染，怎么也去不了，请各位前辈指点，谢谢！
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沉淀的时候有颜色？那可能是DNA没除干净，褐化掉了
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上清液一直有颜色，最后全沉下来了，从电泳图上看有蛋白质以及其他有机物的污染，我们已近试过好多种方法，可是效果一直不理想。请问该怎么办呢？
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关于丁香园长 沙 医 学 院 教 案
理论课□&&& 实验课√&&& 见习课□&&&& 习题课□&&& □其它□
教材名称、作者、出版社及出版时间
教学目的要求：
1．掌握用浓盐法提纯RNA的基本原理和方法。
2．了解核酸的组成。
3. 掌握核酸各组分鉴定的原理和方法。
重点与难点
重点：掌握核酸各组分鉴定的原理。
难点：掌握核酸各组分鉴定的的方法。
教学方法（请打√选择）：
讲授法 √& 讨论法 □& 启发式 □& 自学辅导法 □ &练习法(习题或操作)□& &&&&&&&&&&读书指导法 □ &&&&&ＰＢＬ教学法 □ &&&&C B L教学法 □&&& 其他 □
教学手段（请打√选择）：
板书 √ &&实物 □ &&标本 □ &&挂图 □ &&模型 □ &&投影 √ &&&幻灯 □ &&&录像□&&& &CAI（计算机辅助教学）□
教学过程设计和教学内容：
引入：回顾理论课学习的内容，什么是核酸
一、实验原理：
1．浓盐法提取酵母RNA
酵母中RNA含量特别多，约占干重的3-10％，而DNA含量仅为干重的0.03%-0.5％，且菌体容易收集（即可利用发酵工业的下脚料），因此多采用酵母为原料来提取RNA。
提取酵母的方法很多，目的不同所采用的方法也不同，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。工业上常用的则是稀碱法和浓盐法，这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA及部分降解的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。本实验采用浓盐法，即使用10%NaCl溶液在加热的条件下使酵母细胞壁通透性增加或发生破损，且加热又可将酵母中蛋白质变性沉淀，使RNA以可溶性钠盐的形式游离析出。离心去除菌体，将上清液pH调至RNA等电点（pH 2-2.5），使RNA沉淀析出，收集沉淀并用乙醚洗涤，去除杂质提纯RNA。
2．RNA成分鉴定&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&RNA含有碱基、核糖、磷酸等组分。加硫酸沸水浴可使RNA水解，在水解液中可用加银沉淀碱基、定磷、定糖等方法测出上述组分的存在。
RNA在强酸性条件下沸水浴水解：
碱基（嘌呤）：
（蓝绿色复合物）
二、器材及试剂：
学生实验仪器一套，精密pH试纸（pH 0.5-5.0），广泛pH试纸（pH 1-14），电炉，锥形瓶（100ml×1），离心机、离心管，水浴锅，药物台秤，冰块，滴定板,量筒。
（1）5％氨水：取浓氨水17.9ml，加蒸馏水至100ml，混匀备用。
（2）0％NaCI：取NaCl 10g，溶于约80ml蒸馏水中，再加蒸馏水定容至100ml，混匀。
（3）6M HCl：取浓盐酸50ml，加蒸馏水至100ml，混匀备用。
（4）（NH4）2MoO4：称取5g钼酸铵，溶于60ml蒸馏水中；另将15ml浓硫酸缓缓加入25ml蒸馏水中，混匀，冷却，再将以上两溶液合并，混匀即得100ml（NH4） 2MoO4试剂。
（5）浓氨水,干酵母,乙醚
（6）1.5M H2SO4 ：取浓H2SO4 8.33ml加入90ml蒸馏水中，混匀后再定容至100ml。
（7）Fe3+•HCl：取0.99g硫酸高铁溶于1000ml浓HCl。
（8）0.1M AgNO3：取16.987g AgNO3 加蒸馏水定容至1000ml。
（9）5％ 5-甲基间苯二酚溶液：取15g 5-甲基间苯二酚加入95％酒精300ml溶解。
三、实验操作
1．酵母RNA的提取
用量筒量取10％NaCl溶液40 ml置于100ml锥形瓶内，沸水浴约2分钟。加入干酵母5g（约一平勺），玻璃棒搅匀后置于沸水浴中加热40分钟（注意：温度在20℃～70℃间，细胞中所含的磷酸二酯酶及磷酸酶的活性最高，易导致RNA降解。故先将NaCl溶液预热后再加入干酵母，可避免在此温度范围内停留过久导致RNA降解）。
1.2离心分离 RNA：
将上述锥形瓶取出，冷却后将瓶内溶液全部转入离心管。平衡后3000rpm离心10分钟。离心完毕后，离心管内上层为含RNA的NaCl溶液，下层为菌体残渣及变性蛋白质沉淀。
1.3沉淀提纯 RNA：
将管中上清液小心倒入 50ml烧杯内（不可带入沉淀），冰浴冷却。用 6M HCl调 pH值至 RNA的等电点2.0-2.5（一滴一滴的加入，边滴加边充分混匀，随着pH值下降，白色RNA沉淀逐渐增加，至等电点时沉淀最多）。如pH值调过，可用浓氨水（当pH严重偏离等电点）或稀氨水（pH偏离不太严重）调回。冰浴中静置10分钟使沉淀完全，颗粒变大。再经3000rpm离心10分钟，收集沉淀。用少量乙醚洗涤沉淀2～3次，使RNA沉淀疏松，同时可去除可溶性脂类及色素等物质以提高RNA的纯度。
2．RNA成分鉴定
2.1溶解RNA
在离心所得的含RNA的离心管中加入1滴蒸馏水，用玻棒搅成糊状，再加入10ml蒸馏水搅拌均匀。用5％氨水调pH=6后，一边搅拌一边加入5%氨水至白色RNA颗粒完全溶解。
2.2水解RNA
取5ml RNA溶液于一大试管中，加入lml（约20滴）1.5M的H2SO4溶液。因溶液pH下降接近了RNA的等电点，故溶液中析出白色的RNA颗粒。沸水浴10-15分钟至溶液澄清，得RNA水解液。
2.3检验RNA的各个成分
①检验嘌呤
&取大试管一支，加入水解液1ml（约20滴），加入0.1M AgNO3 12滴，滴加浓氨水至试管中白色沉淀消失（边滴加边混匀），再加入浓氨水0.5ml（约10滴）。沸水浴15min以上，观察有无沉淀产生。
②检验核糖
&取大试管 1支，加入1ml（约20滴）水解液和 1ml（约20滴）的 Fe3+•HCl试剂，再加2滴 5％的 5-甲基间苯二酚溶液，混匀，沸水浴2～3分钟，观察其颜色的变化。
③检验磷酸
&取大试管1支，加水解液1ml（约20滴），（NH4)2MoO4试剂1ml（约20滴），摇匀，再加一小匙FeSO4结晶粉（相当于一粒绿豆大小）。沸水浴，2min后不断观察颜色的变化。
四、注意事项
1、刺激性强的Fe3+?HCl等试剂放在通风橱里面取；
2、水浴的时候要避免水烧干；
3、第一次离心取上清，避免取下层沉淀。
五、临床意义
复习思考及作业题布置
1、记录结果，完成实验报告
2、思考题：
（1）在酵母破壁时为什么要先将水煮沸了以后再放入10%NaCl及干酵母？
（2）实验中两次调pH值的目的是什么？
授课的创新点：
本实验采用浓盐法提取RNA，让学生在动手过程中掌握核苷酸的基本组成及提取核酸基本方法与原理。
参考资料（包括辅助教材、参考书、文献等）：
1、刘群良主编.生物化学.化学工业出版社，2013
2、王继峰主编.生物化学.中国中医药出版社，2011
3、高国全主编.生物化学.人民卫生出版社，2013
4、王镜岩主编.生物化学第三版.高等教育出版社，2003
5、张惠中主编.临床生物化学.人民卫生出版社,2009.
教研室意见：
教学重点突出，符合教学大纲要求。
教研室主任签章：&&&&&&&&&&&& 年　　月　　日
课后记（即通过收集教学督导专家、同行和学生的反馈信息，认真整理分析成功的经验和不足之处，在课程结束后填写）
&实验过程较长，应边实验边讲解，利于学生的操作有条不紊的进行。特别在电炉加热过程让学生注意安全，调pH值一定要准确。
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