：>>生化试剂>蛋白质化学用试剂>GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）20508ES10
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）20508ES10
产品报价：1238元
更新时间： 15:45:31
产地：上海
品牌：Yeasen
厂商性质：
生产型,贸易型,服务型,
公司名称：
上海翊圣生物科技有限公司
产品关键词：
: () (400-)
（联系我时，请说明是在来宝网上看到的，谢谢！）
该厂商其他产品
GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF 谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）产品信息产品名称&&&&&&&&&&产品编号规格储存价格（元）GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）20508ES1010ml4℃1238.0020508ES5050ml4℃4568.0020508ES60100ml4℃7928.00产品描述GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一种GST标签蛋白纯化树脂，结构上是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过12个原子的间隔臂，用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成，具有更高的物理化学特性，可以耐受更高的压力，在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适于工业大规模蛋白的纯化。此外，本品特异性好，性价比高，可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。产品性质基质（Matrix）高度交联的4%琼脂糖微球配体（Ligand）通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽孔径（Bead size）45-165μm载量（Capacity）＞10mg GST protein/ml&基质（40kDa）最大压力（PressureMax）0.3 MPa, 3barpH稳定范围（pH range）3-12储存缓冲液（Buffer）20%乙醇运输和保存方法冰袋运输。4℃保存，有效期2年。需准备试剂所用水和Buffer在使用前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤除菌。结合/洗杂缓冲液：PBS，pH7.4(140mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4,&1.8mM KH2PO4, pH7.4)洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl, 10mM&还原型谷胱甘肽，pH 8.0【注】：结合/洗杂缓冲液或者洗脱缓冲液中可加入1-10mM DTT。&使用方法【注】样品在上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。1 GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的装填（适用于各种中压色谱层析柱的填装）1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm的去离子水。2）将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。4）打开层析柱底部出口，开起泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速，&这样可避免液压对所形成柱床的冲击，避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。【注】：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%，当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。5）关闭泵，关闭层析柱出口。6）如果使用储液器，去除储液器，将分配器至于层析柱中。7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。2&样品纯化1）平衡：用5倍柱体积的结合Buffer平衡柱子，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。2）上样：Resin平衡后，加入蛋白样品，使其与Resin充分接触，提高目的蛋白回收率，收集流出液。3）洗杂：用10-15倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。4）洗脱：使用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即目的蛋白溶液。5）清洗与保存：依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。3 SDS-PAGE检测将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。4&填料清洗GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，此时需对填料进行清洗。1）去除一些沉淀或变形物质用2倍柱体积的6M&盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。2）去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton&X-100清洗，然后立即用5倍柱体积的PBS，pH7.4清洗。注意事项1）请勿冷冻保存本产品。2）GSTSep Glutathione Agarose Resin使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。3）所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。附表&问题及解决方案问题可能原因推荐解决方案柱子反压过高填料被堵塞清洗树脂。裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用0.22μm或0.45μm滤膜过滤，或离心去除。样品太黏稠样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI&（终浓度为5μg/ml），Mg2+(终浓度1mM)，冰上孵育10-15min缓冲液太黏稠有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。洗脱组分中无目的蛋白GST标签蛋白变性了使用温和的裂解条件，实验条件以经验为准。过度的裂解使目的蛋白变性目的蛋白聚集产生沉淀在细胞裂解前溶液中加入DTT，终浓度为1-10mM融合蛋白改变了GST的构象，影响了目的蛋白的结合力测定pGEX中GST的结合力，对载体进行超声处理，检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力，有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力。降低结合温度至4℃，充分清洗。柱子平衡时间太短，目的蛋白不是在pH6.5-pH8.0范围内结合用pH6.5-pH8.0的buffer进行充分的平衡，如PBS.目的蛋白没有完全洗脱下来洗脱体积太少增加洗脱液体积，减小洗脱流速。洗脱液中谷胱甘肽浓度太低增加洗脱液中谷胱甘肽浓度，可尝试用50mM Tris-HCl, 20-40mM还原型谷胱甘肽pH8.0洗脱低pH影响洗脱在不增加洗脱液中谷胱甘肽量时，提高洗脱液中pH至pH8-9会有改善增加洗脱液中离子强度，如0.1-0.2M NaCl洗脱液中谷胱甘肽被氧化使用新鲜配制的洗脱液加入DTT非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱洗脱液中加入非离子型洗涤剂，如0.1%的Triton&X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20电泳或western blot检测中发现多条带Mr 70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来Mr 70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物，可以在目的蛋白中加入50mM Tris-HCl, 2mM ATP, 10mM MgSO4, pH 7.4在37℃加热10min去除。可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白GST融合蛋白已经发生降解在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，如加入1 mM PMSF可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的，可使用蛋白酶缺陷型宿主菌（如lon-或ompT）细胞破碎过度减少细胞破碎时间，超声前加入溶菌酶（菌液体积的0.1倍10mg/ml溶菌酶，25mM Tris-HCl，pH8.0），避免发泡导致蛋白酶变性，过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。共价共纯化包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化，如：DnaK(Mr～70000), DnaJ(Mr～37000), GrpE(Mr&～40000), GroEL(Mr～57000), GroES(Mr～10000)抗体与E. coli的各种蛋白反应抗体吸附E. coli蛋白：GST-抗体；超声处理去除GST抗体，可以用Western Blot检测&相关产品产品编号产品名称规格价格20507ES10GSTSep Glutathione Agarose Resin&谷胱甘肽琼脂糖树脂（用于GST标签蛋白纯化）10ml928.0020507ES50GSTSep Glutathione Agarose Resin&谷胱甘肽琼脂糖树脂（用于GST标签蛋白纯化）50ml3848.0020507ES60GSTSep Glutathione Agarose Resin&谷胱甘肽琼脂糖树脂（用于GST标签蛋白纯化）100ml6898.0020508ES10GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF&谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）10ml1238.0020508ES50GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF&谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）50ml4568.0020508ES60GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF&谷胱甘肽高速纯化树脂（用于GST标签蛋白纯化）100ml7928.0020509ES03GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 1ML（GST标签蛋白纯化预装柱，1ML）1ml328.0020509ES08GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 1ML（GST标签蛋白纯化预装柱，1ML）5×1ml1348.0020510ES08GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML（GST标签蛋白纯化预装柱，5ML）5ml938.0020510ES25GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML（GST标签蛋白纯化预装柱，5ML）5×5ml3928.00&
* 我要求购：
* 我的姓名：
* 我的单位：
* 我的电话：
* 我的邮箱：
我的地址：
* 信息有效期：
信息展示过期后将自动下线，如还需采购可重新发布信息
具体要求：
* 验证码：
联系人：翊圣生物
电话：400-
传真：021-
（联系我时，请说明是在上看到的，谢谢！）
该厂商的产品分类His·Tag_融合蛋白纯化操作手册pdf下载_爱问共享资料
His·Tag_融合蛋白纯化操作手册.pdf
His·Tag_融合蛋白纯化操作手册.pdf
简介：本文档为《His·Tag_融合蛋白纯化操作手册pdf》，可适用于人文社科领域，主题内容包含默克生命科学服务默克生命科学服务默克生命科学服务默克生命科学服务热线热线热线热线：：：：bioteammerckchinacom产品使用说明书产品使符等。
侵权或盗版
*若权利人发现爱问平台上用户上传内容侵犯了其作品的信息网络传播权等合法权益时，请按照平台要求书面通知爱问！
赌博犯罪类
添加成功至
资料评价：
所需积分：0DTT特性与保存及其在蛋白纯化和保存中的作用_Protocol
[DTT特性与保存及其在蛋白纯化和保存中的作用] DTT( （二）是实验室常用的试剂。，它通常用于蛋白质和蛋白质二硫还原保护。DTT的特点是易氧化，稳定性较差，一般的DTT通常保存在零下20摄氏度，可以持续几年。DTT是强还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环(含二 [蛋白纯化 二硫键 DDT特性 DDT保存 二硫苏糖醇 二硫键 蛋白质 还原剂]DTT( （二）是实验室常用的试剂。，它通常用于蛋白质和蛋白质二硫还原保护。DTT的特点是易氧化，稳定性较差，一般的DTT通常保存在零下20摄氏度，可以持续几年。
DTT是强还原剂，减少主要是由于六膜的构象稳定性。其氧化还原电位为7。。保存DTT的特点和滴滴涕
DTT是一种常用的还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT巯基乙醇相比，动作的相似性，但DTT有太刺鼻的气味，毒性比硫醇低得多。。此外，DTT比硫醇浓度低7倍，两者效果相似。。但DTT价格高一点。大唐的粉末一般储存条件：20度保存。1M DTT溶液可以在20度保存2年以上。
因为它很容易被空气氧化。，因此DTT的稳定性较差;但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化硫的亲核亲和力较低，随着ph值的降低，DTT的有效还原性也随之降低;而Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl（TCEP）可以被用来作为一种替代的低pH值下DTT VA，而且它比DTT更稳定。应用：
一个DTT的用途是作为还原剂巯基DNA和保护。脱氧核糖核酸末端硫原子在溶液中形成两种聚合物。，特别是在氧气存在的情况下。这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验(如DNA在生物感应器中的固定)的效率;而在DNA溶液中加入DTT，经过一段时间的反应后除去，能减少DNA的二聚化。
DTT也经常用于减少蛋白质的二硫键，可以用来阻断蛋白质中半胱氨酸之间的蛋白质的形成，。但DTT往往无法还原二硫键嵌于内，这些二硫键还原往往涉及变性蛋白，如6M 盐酸胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，在DTT存在，二是硫键还原率不同。，您可以确定其嵌入深度的范围。。DTT在蛋白质纯化和保存中的作用
我们知道Cys存在于许多蛋白质中。，和SH经常被用作活动中心。，或者，这两个SH连接到两个硫键上。，它是维持蛋白质高构象的重要桥梁。。SH具有强的可还原性。，溶液溶解氧或其他氧化物在溶液中氧化。，使蛋白质失去活性。所以，蛋白质被纯化和保存后，添加一定量的DTT的解决方案，从而使蛋白质被氧化和灭活。。但这里有一个矛盾。，DTT我应该怎样添加？，使SH处于还原状态。，除了上述作用，二硫键的保护，减少，DTT有什么呢？
我曾经听一位专家说起，关于摩尔数，5-10倍的量来保护- SH。如果蛋白质存在，缓冲液含有约15%的甘油。，它对蛋白质有很好的稳定作用。。加一点：如果重庆格力空调维修和蛋白摩尔比例比例增大到1：100，DTT可以破坏2硫键，此时，相应的浓度一般在10mm左右。，这通常用于减少肽。。
然而，一些分子内二硫键由于空间位阻hindr，还原剂在较大程度上增加量并不能破坏。在这个时候，可能需要用尿素和其他denaturan合作
DTT对离子状态的影响，目前效果最好。，ph低于3，不电离。，因此可以通过降低pH至3以下来终止DTT作现在才知道DTT作用还受到pH的影响。提到尿素变性，如果蛋白质存在，分子或分子有两个硫键。，即使是高浓度的脲或盐酸胍，代替DTT等还原剂，这不会使蛋白质完全变性（打破两个硫键吗？）
我记得在《虎标万金油》一文中提到的纯净之星。
50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
5% glycerol
在DTT骨折二硫键的要求是什么？两，形态、功能发生了什么变化？
我不是专门从事生物化学的。。只知道皮毛，就我了解的而言，western 污点正在发生，抗体尤其与靶蛋白结合。，一方面，应该打开SS键打开蛋白质。，因为如果SS键不打开，抗体不可能识别特定的位点是可能的。，就不能结合上去;另一方面还要用SDS-PAGE消除蛋白质分子内的各种非共价键，蛋白质的电荷与其分子量成正比。，只有这样，蛋白质才能分离。。
DTT在电泳中也扮演着重要的角色。过量DTT可以在多聚体打开二硫键，使出现在单一状态，去除DTT在加载后，聚合物保持原来的状态。。因此，比较可以判断出该蛋白含有一个多聚体。
结合我的实验，我所做的是纤维素酶基因的克隆和表达。。家蚕杆状病毒表达系统的应用。
构建了携带纤维素酶片段的重组病毒。，重组病毒，从而达到一定的滴度，注射免疫。
无论是蚕血液可以表示在巴中可以表达的细胞。困难和疑惑：Bombyx mori的血淋巴在空气中很容易氧化。，尽管低温可以在很短的时间内保持。，但是这种酶需要用50度反应测量，30分钟。，所以当我第一次做的，我没有加巯基或DTT，所以溶液变暗了。小结：本文总结了保存DTT的特点和滴滴涕、应用、DTT在蛋白质纯化和保存中的作用，最后，生物展览提供了DTT的产品建议：
(责任编辑：admin)
------分隔线----------------------------
下一篇：没有了GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins | Protocol (Translated to Chinese)
Fill out the form below to receive a free trial or :
Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!
Select a Country
United States
Afghanistan
American Samoa
Antarctica
Antigua and Barbuda
Azerbaijan
Bangladesh
Bosnia and Herzegowina
Bouvet Island
British Indian Ocean Territory
Brunei Darussalam
Burkina Faso
Cape Verde
Cayman Islands
Central African Republic
Christmas Island
Cocos (Keeling) Islands
Congo, the Democratic Republic of the
Cook Islands
Costa Rica
Cote d'Ivoire
Croatia (Hrvatska)
Czech Republic
Dominican Republic
East Timor
El Salvador
Equatorial Guinea
Falkland Islands (Malvinas)
Faroe Islands
France Metropolitan
French Guiana
French Polynesia
French Southern Territories
Guadeloupe
Guinea-Bissau
Heard and Mc Donald Islands
Holy See (Vatican City State)
Iran (Islamic Republic of)
Kazakhstan
Korea, Democratic People's Republic of
Korea, Republic of
Kyrgyzstan
Lao, People's Democratic Republic
Libyan Arab Jamahiriya
Liechtenstein
Luxembourg
Macedonia, The Former Yugoslav Republic of
Madagascar
Marshall Islands
Martinique
Mauritania
Micronesia, Federated States of
Moldova, Republic of
Montserrat
Mozambique
Netherlands
Netherlands Antilles
New Caledonia
New Zealand
Norfolk Island
Northern Mariana Islands
Papua New Guinea
Philippines
Puerto Rico
Russian Federation
Saint Kitts and Nevis
Saint Lucia
Saint Vincent and the Grenadines
San Marino
Sao Tome and Principe
Saudi Arabia
Seychelles
Sierra Leone
Slovakia (Slovak Republic)
Solomon Islands
South Africa
South Georgia and the South Sandwich Islands
St. Helena
St. Pierre and Miquelon
Svalbard and Jan Mayen Islands
Switzerland
Syrian Arab Republic
Tajikistan
Tanzania, United Republic of
Trinidad and Tobago
Turkmenistan
Turks and Caicos Islands
United Arab Emirates
United Kingdom
United States Minor Outlying Islands
Uzbekistan
Virgin Islands (British)
Virgin Islands (U.S.)
Wallis and Futuna Islands
Western Sahara
Yugoslavia
Select a Role
Administrator
Technician
Select a State
California
Connecticut
Massachusetts
Mississippi
New Hampshire
New Jersey
New Mexico
North Carolina
North Dakota
Pennsylvania
Rhode Island
South Carolina
South Dakota
Washington
West Virginia
Select a Province
British Columbia
New Brunswick
Newfoundland and Labrador
Northwest Territories
Nova Scotia
Prince Edward Island
Saskatchewan
Select a Province
Beijing Municipality
Chongqing Municipality
Heilongjiang
Inner Mongolia
Shanghai Municipality
Tianjin Municipality
By clicking "Submit", you agree to our .
在本协议中，我们展示了一个高效和具有成本效益的小型蛋白质纯化方法，它允许重组蛋白的纯化结合独特的可裂解GST标签和一个小His标签。
Cite this Article
Maity, R., Pauty, J., Krietsch, J., Buisson, R., Genois, M. M., Masson, J. Y. GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins. J. Vis. Exp. (80), e50320, doi:10. (2013).
Please note that all translations are automatically generated.
For other languages .
在酶学测定法的关键蛋白质的体外生化特性的必要的高浓度的感兴趣的纯化蛋白。蛋白质纯化方案应结合效率，简单性和成本效益1。在这里，我们描述了GST-他的方法作为一种新的小型的亲和纯化系统的重组蛋白，根据N-末端谷胱甘肽琼脂糖标签（GST）的2,3和C-末端10xHis标签4，它们都稠合到感兴趣的蛋白质。后者构建体被用于产生杆状病毒的Sf9对感染细胞中的蛋白质表达5的感染。消费税是用来确保净化效率相当长的标记（29 kDa的）。然而，它可能影响到蛋白质的生理特性。因此，它使用的是断前酶6随后裂解的蛋白。为了确保最大的纯度和去除切割的商品及服务税，我们新增的基础上，比较小His标签的第二亲和纯化步骤。重要的是，我们的技术是基于两个不同的标记侧翼的蛋白质，这是一个有效的工具来除去降解的蛋白质，因此两端，丰富了全长蛋白。这里提出的方法不需要昂贵的仪器设置，诸如FPLC。此外，我们成立氯化镁和ATP清洗以去除热休克蛋白杂质和核酸酶处理，取消污染核酸。总之，两个不同的标记侧翼的组合的N-和C-末端和切割过的标签1的功能，担保感兴趣的高度纯化的和全长蛋白质的回收率。
Introduction
重组蛋白质的纯化是至关重要的，以解决在生物化学的基本问题。蛋白纯化的常规方法类似的离子交换层析和大小排阻层析依赖于目标蛋白的物理性质，例如它的等电点和电荷或大小，分别。后者蛋白质特性是由多种蛋白质，这增加了相当大的常规蛋白质纯化策略污染蛋白的机会共享。这个问题可能会被规避与使用多个纯化柱，这是耗时的。在同一时间，后者的色谱方法需要昂贵的实验装置。亲和标记纯化大力增加目标特异性，因为在大多数的情况下，标签将是唯一的目标蛋白。在最近的研究中，标志或HA-亲和纯化，得到了广泛的使用。 而相比之下，现有的拍摄其中单个标签用于ombinant蛋白质纯化的协议，我们建立两个标签的独特组合。我们的方法是融合GST标签的在N-末端和His-标签在感兴趣的蛋白质的C-末端，用于量和所需蛋白质的纯度之间的最佳比例。的GST是一个长标记（29 kDa）的，这是对纯化的谷胱甘肽琼脂糖珠高效。此外，使用GST保证我们的方法1的成本效益。裂解掉的GST与断前酶（具有识别序列LeuGluValLeuPheGln / GlyPro，导致增加了只有两个氨基酸）的可能性，具有许多优点，例如，这样的策略可避免的生理功能的蛋白质，由于变构阻改变。小的His-tag融合至其它蛋白质末端提供在第二纯化步骤中通过洗涤掉裂解的GST，以及降解的蛋白质和其他增加蛋白质纯度污染物。此外，从GST切换到他的净化步骤柱（TALON树脂）时，协议不需要一个透析步骤。在这样的净化过程常见的污染物是热休克蛋白（HSP）。加入一种培养步骤含MgCl 2和ATP的允许移除这些污染物（ 图1）。 快速蛋白液相色谱（FPLC）和高效液相色谱法（HPLC）是依赖于昂贵的仪器来产生高收益感兴趣的纯化蛋白质的常用技术。我们在座的批次纯化方案，相反，是手动的，不需要昂贵的仪器设置。高产量的蛋白质可以通过扩大的协议达成。在同一时间，用批量纯化方案中，洗脱体积可以提高蛋白质浓度，这是不符合FPLC或HPLC给予调整。 ntent“&此外，在批次GST-他的纯化方案，一个大小范围的?10-300 kDa的蛋白可被纯化。其中最大的优点是通过以下事实给出，人们可以同时净化几种蛋白质举例来说，两个野生型及其突变体蛋白。所提出的协议的成功完全依赖于目的蛋白质的表达水平和溶解度。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
1。生产重组杆状病毒的使用Invitrogen的BAC-到-BAC杆状病毒表达系统主要是根据制造商的协议，只有轻微的修改所产生的杆状病毒： 修改后pFastBac1矢量（Gibco公司，生活）是创建一个包含GST和他-标签（ 图2）。一个的pET-52b中（+）载体（Novagen）中的多克隆位点（MCS），含有10xHis-标签，插入一个pFastBac1载体的MCS，生成pFastBac1
- 链霉素-10xHis。在PET-52B（+）的MCS序列进行PCR的XbaI和BLPI限制性位点之间的扩增，增加一个BglⅡ限制性位点的5'末端和一个HindIII限制性位点，在3'末端。将PCR产物然后BamHI和pFastBac1的HindIII限制性位点之间克隆，用BamHⅠ和BglⅡ限制性序列的相容性。因为目的是产生一个pFastBac1允许的表达重组蛋白与链霉亲和10xHis-标签中，PET-52B（+）的BamHI限制性位点中没有使用的MCS序列。此外，XbaI限制性位点没有被使用，以避免已经在pFastBac1的MCS和这些同的pET-52b的MCS插入（+）的位点之间发生的限制性位点的冗余。与断前蛋白酶识别位点（LeuGluValLeuPheGln / GlyPro）的GST编码序列插入到pFastBac1-链球菌，10xHis。从质粒pGEX-6P-2（GE Healthcare公司）的GST cDNA序列的PCR扩增用含有NcoI和KpnI限制性位点的引物，5'和3'末端，分别为。 NcoI位点允许添加一个起始密码子，但也是一个丙氨酸的消费税。然后将PCR产物克隆入pFastBac1
- 链霉素-10xHis的NcoⅠ和KpnⅠ限制位点之间，从而导致删除该链霉亲和标签。由此得到的新的融合载体被命名为pFastBac1-GST-10xHis。 克隆的cDNA编码公关关注到GST（N端）和His标签（C端）之间的pFastBac-GST-10xHis矢量otein。小心地取出该cDNA的终止密码子，以允许融合的C-末端His-标签。
转化大肠大肠杆菌 DH10Bac感受态用重组的pFastBac（在步骤1.2中获得），以产生杆状病毒质粒。允许菌落过夜，在37℃和几个小时在含有Bluo-gal和IPTG（10微克/毫升四环素，50微克/毫升卡那霉素，7微克/毫升庆大霉素，100微克/毫升Bluo-选择平板上生长在30℃下加仑，40微克/毫升IPTG）。 挑选和重新划2白色菌落（步骤1.3）在选择平板上，以确认白色表型。 接种2毫升的LB含10微克/毫升四环素，50微克/毫升卡那霉素，10微克/毫升的庆大霉素与步骤1.4两个白色菌落，并让他们在搅拌下于37℃生长过夜（250转） 为了净化杆粒DNA，沉淀从步骤1.5的细菌，悬浮细胞在300微升的溶液I并加入300微升的溶液II（自Qiagen大量制备试剂盒）。孵育5分钟，在室温下，加入300微升的3M KOAc pH为5.5，并培育在冰上10分钟。离心样品在4℃，最高速度为10分钟。加入800μl异丙醇的上清，孵育冰上10分钟。离心样品15分钟，在4℃，用500μl的70％乙醇洗涤沉淀。让沉淀干燥并在40微升的Tris-EDTA（pH8.0）中在无菌条件下重悬的。该杆粒DNA应保存在4°C。 如制造商的方案所述生成杆状病毒。杆状病毒可存放于4℃避光。
2。重组蛋白的表达为了选择最有效的杆状病毒的净化和监测什么时候到达蛋白表达的高峰期，执行迷你感染测定一个s如下：感染2×10 7的Sf9的感染细胞培养在27℃的Grace的媒体（补充了10％FBS和1％P / S）与133微升杆状病毒（1/150）。收集1.5毫升分装，在0，24，48，和72小时后的感染。沉淀细胞并分析感兴趣使用抗标签抗体的蛋白免疫印迹的表达水平。 使用最有效的杆状病毒从步骤2.1感染每毫升含1.0×10 6个Sf9细胞在500毫升的介质与1/150病毒和媒体之间的比例的微调。让感染的细胞生长在悬浮液中在27℃和收获细胞时的最大蛋白表达（如上面步骤2.1中确定的）就达到了。沉淀的细胞可以被储存在-80℃直到进一步的使用。
3。可溶性细胞裂解液的制备以下所有孵育步骤都在4℃下轻微转动。 裂解S表达的目的蛋白质在约20毫升的GST结合缓冲液（150 mM氯化钠，1mM EDTA中，0.05％的Triton-X-100，1mM的DTT中PBS1X为250mM的NaCl的最终浓度，以及蛋白酶抑制剂F9细胞混合物（Roche），在冰水浴，DOUNCE的20倍溶液用Dounce匀浆，超声处理3次每次30秒（70％产量），并再次DOUNCE 20倍。
（可选）。孵育的总细胞裂解物用1mM的MgCl 2和BENZONASE 7核酸酶（2.5单位/毫升）处理30分钟，在4℃以除去DNA或RNA污染。 离心机在18,000 rpm离心30分钟，在4°C。保留上清液。
（可选）。离心取上清液再30分钟18000转，4℃得到一个明确的可溶性裂解物。通过0.2或0.45微米的过滤器传递上清液，以避免堵塞。
4。蛋白对GST结合珠孵育可溶性细胞裂解物用1ml GST珠（预洗涤2次10毫升GST的结合缓冲液）1小时，在4℃下轻轻转动。
评论：培养时间需要根据蛋白质的稳定性和结合效率进行优化。 以700rpm的转速快速旋转并除去含有未结合蛋白的上清液（这可以保持用于进一步分析）。与GST洗涤缓冲液洗涤的GST-结合蛋白（ 图3B，泳道1）（GST结合缓冲液用350mM的NaCl的终浓度）。 重复步骤4.2倍。在最后一次洗涤，去除尽可能多的上清液越好。
1小时孵育用5mM ATP和15mM的MgCl 2的有孔玻璃珠（10毫升GST结合缓冲液）于4℃，以避免热休克蛋白8的非特异性结合。与GST洗涤缓冲液清洗珠三次。
5。商品及服务税的断前卵裂离心GST珠，除去上清液，用P5 BUF洗GST珠FER（50mM的NaHPO 4 pH值为7.0，500 mM氯化钠，10％甘油，0.05％的Triton-X-100，5mM的咪唑）。 从3小时到过夜，4℃孵育在小五缓冲区中的GST-珠断前酶（除以消费税珠在100微升的组分，并添加4-8单位的酶（2-4微升）稀释于100微升的P5缓冲区）。
评论：需要断前步骤的孵育时间以根据分子量以及该蛋白质的稳定性得到优化。如果降级观察，这个孵化时间可以在一夜之间被减少到最低限度2小时代替。 快速离心并收集上清液。加入100微升P5后重复此步骤两次 缓冲区的珠子，集中所有分数（ 图3B，泳道2）。
注释：剩余珠可用于裂解效率分析（ 图3B </stroNG&，泳道3）。通常，蛋白质的70-80％被裂解。
6。蛋白质结合，以TALON金属亲和树脂除以从上面的洗脱分为3个部分1毫升，用100微升爪金属亲和树脂干珠（预洗两次，P5缓冲液）下旋转1小时孵化每个。
评论：分度洗脱几部分增加结合/洗涤效率。 用P30缓冲液（含30 mM咪唑的最终浓度P5缓冲液）洗涤树脂5分钟。 重复步骤6.2倍，集中在珠在单管。最后一次洗涤之前，除去尽可能多的上清液越好。
评论：这对应于TALON绑定样品（ 图3B，泳道4）。
7。纯化的蛋白质的洗脱下孵育与P5旋转蛋白结合TALON树脂5分钟00缓冲液（含500mM咪唑的最终浓度P5缓冲液）。使用缓冲液和1:1 V / V的珠之间的比（例如，如果你采取了200微升的干珠，你将不得不加入200μlP500的）。重复此步骤两次，并分别保持各洗脱组分（命名为洗脱1（E1），洗脱2（E2）和洗脱3（E3）， 图3B，泳道5-7）。
注释：剩余珠可用于洗脱效率（ 图3B，泳道8）的分析。通常情况下，蛋白质的60-80％被洗脱总共。 通过与在SDS-PAGE和染色用考马斯亮蓝（ 图3B）或SYPRO蛋白染色进行可视化的标准BSA浓度装载约20-40微升的每个级分的分析你纯化的蛋白的数量和质量。
评论：感兴趣的蛋白质也可以被救援人员到场检测ughout用抗-GST和抗His抗体（ 图3C）的纯化方法。
8。纯化的蛋白质的存储在4℃下透析针对适当的存储缓冲器中的纯化的蛋白质（ 例如，20毫摩尔Tris乙酸盐pH 8.0，200mM的醋酸钾，10％甘油，1mM EDTA，0.5mM的DTT）在透析过程中，检查纯化的蛋白质的沉淀是重要的。我们通常在搅拌下旋转透析2倍1小时，4℃。 使纯化的蛋白质（10-20微升）的小等分试样并冷冻在干冰上30分钟。储存分装于-80°C和避免许多解冻/冻结周期。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了说明GST-HIS纯化方案的效率，我们纯化Rec14，一个S。 32.9 kDa的酵母蛋白质。该Rec14 cDNA克隆在我们修改pFastBac1向量允许GST和他-标签的添加在N-和C-末端，分别为（ 图1A）。重组杆状病毒，然后准备并用于感染SF9感染的细胞用于蛋白质表达。可溶性细胞裂解物与GST珠和束缚蛋白裂解与断前蛋白酶的消费税洗脱。所得Rec14-His蛋白是亲和纯化TALON树脂和束缚的蛋白质用含有500mM咪唑的TALON缓冲液中。纯化Rec14-他透析中存储缓冲器并储存在-80℃（ 图1B）。 从昆虫细胞的可溶性和总细胞裂解物感染Rec14重组杆状病毒，或模拟感染的控制，由COOM分析assie蓝染色，使我们能够证实GST-Rec14-His蛋白的表达（ 图3A）。在纯化过程中，许多样品进行了分析，以遵循该方法的效率。这些样品通过考马斯亮蓝染色（ 图3B）的分析显示，在纯化的第一步，GST-Rec14被正确地绑定到GST珠，与?60kDa的表观分子量是由于该融合Rec14的（32.9 kDa）的与GST（29 kDa的）（泳道1）。的GST的断前切割后，GST-免费Rec14
- 他大约37 kDa的（泳道2）迁移，同时在切割的GST可以可视化的GST珠（泳道3，约25 kDa的）。尽管免GST Rec14一部分仍然保持结合到GST珠（泳道3），在显着富集Rec14
- 他达到了（泳道2，用考马斯蓝染色无污染物可见）。这个步骤可以通过增加蛋白质的孵育时间与断前得到提高。的Rec14，他绑定到魔爪分析珠（步骤7.1之后，泳道4）相比，GST纯化步骤（泳道2）后洗脱的蛋白质，表明Rec14
- 他的大部分被绑定到TALON珠。洗涤几次后，Rec14
- 他的洗脱和收集。三洗脱已执行。该分析揭示了高纯度Rec14-HIS（无污染物通过考马斯染色可见，泳道5?7），以及Rec14
- 他的第一次洗脱的最大浓度。洗脱组分（泳道5-7）中的TALON珠相比洗脱后（泳道8）示出的洗脱效率，因为只有少数Rec14
- 他可以被检测为结合在珠子。 在图3B中使用的样品进行Western印迹分析用抗-GST和抗His抗体以遵循Rec14整个手术过程中（ 图3C）。的抗-GST印迹表明，一些GST-Rec14与单独的GST，存在于从GST纯化步骤（泳道2）将洗脱的蛋白质，和日在污染物的His-标签的亲和纯化步骤中除去。此印迹允许我们还监测了GST已被有效地从Rec14由断前处理和His标签纯化步骤（泳道4-8）中除去。的抗His印迹旨在检测Rec14。因此，我们可以证实，GST-Rec14，他和Rec14，他并没有完全断裂，并从GST珠（泳道11）中删除。此外，在高浓度下，Rec14似乎聚集（泳道13）。总之，呈现的结果证明了GST-他净化为S的净化效率酵母 Rec14。
图1。商品及服务税，他两步亲和纯化方法的纲要。A. GST-Rec14，他构建克隆到的pFastBac（BaculovirGST-Rec14，他对我们表达载体）B.两步亲和纯化的可溶性的Sf9细胞裂解液：GST结合，其次是消费税的断前乳沟，TALON结合，并用咪唑 。
图2。 pFastBac1-GST-10xHis的示意图 。 GST（绿色），断前蛋白酶位点（浅蓝色），多克隆位点（红色），和10-His标签（深蓝）被示出。在较低的情况下，从PET-52B发起的核苷酸序列（+）。
。 <p class="jove_content" fo:keep- together.within页=“总是”&
图3。商品及服务税，他Rec14一个净化示范结果 。总蛋白级分（泳道2和3）和可溶性细胞裂解物（泳道4和5）从模拟处理Sf9细胞的考马斯染色（泳道2和4）或感染了GST-Rec14
- 他杆状病毒（泳道3和5）。 Rec14-His和GST具有约32.9 kDa的和29 kDa的分子量分别与GST-Rec14-His融合蛋白具有大约61.9 kDa的分子量。B.考马斯亮蓝染色证实的蛋白质纯化方法的每个步骤（用于馏分经与抗GST（泳道1?8）和抗His（泳道9?16）抗体的纯化过程的详细解释见程序）C. Western blot检测。upload/fig3large.jpg“目标=”_blank“&点击这里查看大图。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这里提出的GST-他的纯化方案，适用于范围广泛的重组蛋白大小的净化：成功纯化李 RAD51（41kDa），piBRCA2（120kDa），PALB2（130kDa），和一个不稳定的大分子量的蛋白质婴儿利什曼原虫 ： 李 BRCA2（125kDa）6,9。此外，与此协议纯化蛋白生化活性6。这种方法的成功完全取决于所需蛋白质的表达，溶解性和稳定性。 在其他宿主中的表达的分子生物学载体，如大肠杆菌大肠杆菌或酵母，可以用广泛使用的GST和他的标签很容易修改。这凸显了目前技术最为分子生物学实验室的适用性和成本效益。各种优势影响了我们的决定在细菌或哺乳动物细胞recombinan选择感染细胞吨蛋白表达和纯化。举例来说，翻译后修饰，例如甲基化，磷酸化和泛素化可影响蛋白质10的酶的功能。因此，要研究的蛋白质的生理特性，有利的是使用一个系统，它允许为翻译后修饰，例如Sf9感染的细胞。使用的Sf9过的哺乳动物细胞的另一个优点，举例来说，是经济的性质，如在感染细胞系统需要相当少的细胞和不昂贵的转染方法相比，哺乳动物系统。 该方法的简单性将帮助研究人员获得的蛋白质或蛋白质复合物中与标准的实验室设备，这有利于以最小的设备在实验室高度纯化的形式。 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgements
我们感谢安妮 - 玛丽·迪翁 - 科特的讨论导致了该方法的开发。 JK和RB是FQNRT博士学位的学者，米-MG是凡尼尔CIHR学者，和J.-YM是一个FRSQ高级研究员。这项工作是由自然科学和工程研究理事会JY资金支持。 M。
Catalog Number
E.Coli DH10Bac (competent)
Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System
Invitrogen
Maxi Prep Kit
Solution I and II
Ultra Pure Bluo-Gal
Gibco (Life)
Gibco (Life)
Sf9 infected cells
PreScission enzyme
GE Healthcare
Grace's infected medium supplemented
Gibco (Life)
Fetal Bovine Serum characterized
SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)
Gibco (Life)
Glutathione Sepharose resin
GE bioscience
Protease inhibitor cocktail
Talon resin
Gentamicin
Gibco (Life)
Polyclonal GST-antibody
Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody
Dounce homogenizer (tight)
Sonicator (Fisher dismembrator)
Dialysis bag (50 mm)
Fisher Scientific
References
Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S.
Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R.
Trends Genet. 12, 209-210 (1996).
Carr, S., et al.
Vaccine. 18, 153-159 (1999).
Armisen, P., et al.
J. Chromatogr. A. 848, 61-70 (1999).
Kuhn, S., Zipfel, P. F.
Gene. 162, 225-229 (1995).
Buisson, R., et al.
Nat. Struct. Mol. Biol. 17,
Filimonova, M. N., et al.
Biochemistry. 62, 983-988 (1997).
Thorslund, T., et al.
Nat. Struct. Mol. Biol. 17,
Genois, M. M., et al.
Nucleic Acids Res. 40,
Shrestha, B., Smee, C., Gileadi, O.
Methods Mol. Biol. 439, 269-289 (2008).
Video Stats
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.