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衰老机理的学说
衰老机理的学说近几十年来，随着现代遗传学、分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等边缘学科的 飞速发展， 人们对衰老的机理有了深层次的认识， 在大量实验证据的基础上提出了许多新的 学说。下面，就几个有代表性的并被广泛接受的学说作一简要介绍。一、遗传程序学说遗传程序学说（genetic program theory）认为每一种物种本身固有其遗传基因上的衰 老程序。该程序何时启动、如何被基因组控制？对此曾提出如下几个假说。（一）修饰基因假说修饰基因假说（modifier genes theory）认为存在一种修饰基因，它在动物性成熟以前 可以抑制对染色体的任何有害作用，而随着年龄的增长该基因的抑制作用就逐渐丧失。（二）密码子限制假说密码子限制假说（codon restriction theory）认为在机体一定时期合成某一种成分的基 因密码被抑制导致某一成分的减少以至缺失。（三）重复利用基因枯竭假说真核生物基因组有许多重复序列，这种高度重复并保守的序列预示其基因产物执行某 种重要的生理功能。 重复基因利用枯竭假说认为某一基因序列破坏或抑制时， 则由重复序列 中另一个相同基因序列来接替，当这种重复序列被耗竭时则该基因产物就缺失了。（四）DNA 分子修复能力下降假说DNA 分子具有很强的自我修复能力，这是保证个体稳定遗传并健康发育成长的必要条 件。DNA 分子修复能力下降假说认为这个修复能力的下降是衰老的一个途径。二、差错灾难学说蛋白质合成过程中的 DNA 复制、转录都可能产生差错，它不同于变异。多掺入或少掺 入一个核苷酸、 或者以另一种核苷酸替代了该位点原有核苷酸。 正常情况下这些差错可由修 复机制（外切酶）来修复，但这种差错也可能发生在参与这种修复机制的酶类而使该修复机 制修复能力降低或丧失，这种差错在体内的累积可导致衰老。三、交联学说交联学说（cross linkage theorr）认为体内甲醛、自由基（free radicals）等物质可以 引起体内 DNA 分子双链间、 蛋白胶原纤维间等大分子间的交联。 DNA 双链的交联可在 DNA 解链时形成“Y”形结构，使转录不能顺利进行。胶原纤维间的交联可使纤维结缔组织在正常 交联的基础上过度交联，从而使对小分子物质的通透性降低，可能与结缔组织变性有关，从 而影响了结缔组织的张力及韧性。 故这种交联可能引起各种不良后果而导致衰老， 其与衰老 的确切关系尚等进一步证实。有关自由基与衰老的关系目前仍在活跃研究中。 四、体细胞突变学说突变与变异是两个截然不同的概念。变异一般是指物种在漫长的自然选择压力下，由 于“适者生存”的原则而使自身遗传基因发生的某些有益于自身完善于生存环境而生存、发展 的变化。突变则是指物种遗传基因在某些物理、化学、生物因素作用下，短期内发生的某些 基因序列的变化。就人体而言，突变一般是对人体十分有害的。突变可以分为 3 大类型： 点突变 （point mutation） 、 染色体突变(chromosomal mutation) 和基因组突变(genomic mutation)。 其中以点突变最为常见和重要，包括转换(transition)、 颠换（transversion）、插入(insertion)和缺失(deletion)几种类型，前两种属于碱基置换 (basesubstitution)，后两种属于移码突变(frame shift mutation) 。体细胞突变学说（somatic mutation theory）认为突变引起的细胞形态变化及功能失调 或丧失是人体衰老的重要原因。二倍体细胞中两条染色体上等位基因都被 某些突变因素击 中时，子代细胞会很快发生形成、功能的改变，甚至死亡。由此可见，二倍体细胞的衰老性 改变取决于这种等位基因被击中的比率以及所造成缺陷的水平。但是，随后有些学者以纯系品种和非纯系品种果蝇、二倍体和单倍体黄峰所做的诱发 突变对比研究以及以哺乳动物进行的染色体研究却在许多情况下不一定出现衰老性结果。 所 以，体细胞突变与衰老的确切关系尚有待进一步研究。五 脂褐素累积学说脂褐素（lipofuscin）可能由溶酶体、线粒体等细胞器中的铜发生的脂质过氧化产生。 所以，脂褐素与体内氧自由基生成有关。过度加剧的脂质过氧化反应产生过量的脂褐素，从 而出现脂褐素沉着。脂褐素可在神经、肌肉等组织器官系统广泛沉着，关于这种沉着对细胞 是否具有危害作用尚存在争议，但是，大多数学者认为这种沉着对机体是相当有害的，是机 体衰老的原因之一。六、内分泌功能减退学说内分泌系统对机体的重要性显而易见。但随着年龄的增加，机体靶组织对某些激素或 活性物质的反应性发生改变或明显降低（如受体表达的的降低）。耐用内分泌系统合成功能 以及分泌、 调节功能等都发生某些衰老性改变， 这些因素促使机体整个内分泌系统功能的紊 乱和减退，从而加速了机体衰老过程。其中，神经-内分泌系统的影响尤为突出。衰老机理研究进展一、自由基与衰老人们在 40 多年前（1956）年就开始注意到自由基与机体衰老的关系了。但对其进行 比较深入的研究则是近些年的事情。机体内绝大多数分子是由氢原子（H）和其它基因（以 R 表示）组成的，常常可以发 生 R 与 H 的解离，形成各带一个电子的“R?”与“H?”，称为自由基（free radicals）。生物体 内常见的自由基有：氧离子自由基（?O-2）、羟自由基（?OH）、过氧化羟基自由基（?OH2）、 氢自由基（H?）、有机自由基（R?）、烷氧基自由基（RO?）、有机过氧自由基（ROO?）、 脂质自由基（L?）、氧化脂质自由基（L-O?）以及过氧化脂质自由基（L-O-O?）等。自由基 性质活泼，极不稳定，容易与其它物质反应生成新的自由基，因而往往都有连锁反应。自由基的连锁反应一旦开始， 所产生的新的自由基就进一步与基质发生反应， 从而导致基质的大 量消耗及多种自由基产物的生成。其中基中以?O-2 和?OH 等活性氧簇（reactiveoxygen species,ROS）最受人触目。?O-2 和?OH 是最活泼也最具危害性的自由基，它们可与其邻近的任何生物分子反应。 研究表明，许多物种?O-2 的产生速率与其衰老密切相关，那些?OH 和?O-2 产生速率低而?OH 和?O-2 清除机制完备的有机体存活时间明显较长（Poeggeler 等，1993）。H2O2 是极易产 生?OH 的物质，体外以紫外线（254nm）照射 H2O2 立即可产生?OH，只是半衰期极短难以 测定。利用二甲基吡啶氮氧化物（DMPO）可与?OH 反应生成稳定 DMPO-?OH 加合物这一 特性，可用顺磁共振和高效液相色谱分析共同测定?OH 水平。单线态氧（1O2）也是很活泼的自由基，它由三线态氧（3O2）被激发产生。1O2 极易氧 化还原生成?O12 自由基发挥损害作用。1O2 本身也具有很大损害作用，光敏染料产生的 1O2 可引起小脑颗粒细胞的线粒体损伤和 DNA 链断裂、肌酸激酶的活性抑制，导致神经细胞的 能量代谢障碍和死亡。某些老年性的动物失调可能与此有关。适量自由基对于抗局部感染等具有一定作用，但过量自由基则对于不饱和脂肪酸、蛋 白质分子、核酸分子、细胞外可溶性成分以及细胞膜等具有十分有害的破坏性作用。机体内 从一开始就时刻在产生着自由基。 但同时又具有有效的自由基清除系统， 维持体内自由基的 正常水平，但是，随着年龄的增长，这种平衡会发生改变。最近的研究表明，体内自由基的产生与脑神经递质有关。兴奋性神经递质如谷氨酸的 释放可以打开 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体伴随的钙离子通道，引起 Ca2-内流，若体内谷氨酸浓度过高，Ca2-过度内流，则会触发?OH 和?O-2 的过量产生，引起神经损伤甚至死 亡（Peruche 等，1993）。大量试验资料已经证明，各种感染，炎症以及其它细胞因子如干扰素（IFN）等都可使 体内肿瘤坏死因子（TNF）水平增高，而过量的 TNF 又使大量的吞噬细胞活化而加强吞噬 作用，这可使吞噬细胞过量发生呼吸爆发（burst）而释放过量自由基，使组织局部及血浆 自由基水平过量提高而对机体产生大量自由基而使关节腔内润滑液中具有润滑作用的粘多 糖发生氧化降解而失去润滑作用， 这是风湿性关节炎发生的重要机制之一。 又如过量自由基 在血液中的堆积可使细胞严重受损，严重影响细胞变形能力（erythrocyte diformability）使 其变硬，加之其表面变粗糙使粘性增加，所以在通过毛细血管时易于被堵形成微栓塞 （micro-plugs）( 侯颖春等，)。这可能是某些老年性心、脑血管疾病的重要发 病机制之一。体内产生的自由基极易侵害细胞脂中的不饱和脂肪酸，形成脂质自由基，引起脂质过 氧化反应。 细胞膜中由磷脂酰基链和胆固醇组成的区域在细胞中极性最小， 溶解有高浓度的 氧，这更有利于脂质过氧化反应的进行。脂质过氧化反应对生物膜内类脂结构破坏性极大， 反应中产生的自由基可以不加区别地与细胞中其它物质如蛋白质和核酸作用， 造成酶、 染色 体 DNA 分子功能或结构的破坏。过氧化脂质反应的产物丙二醛（MDA）又可通过蛋白质一 级氨基基团反应与蛋白质交联， 造成细胞功能的破坏以至死亡。 衰老相关疾病的发生及药物、 毒物引起的机体损伤与此机制密切相关。基于这个原理，利用外源性毒物如百草枯、H2O2、 Kainate、细菌脂多糖 等造成自由基损伤的动物模型，利用这些模型可进行一系列自由基与 衰老、疾病以及抗自由基药物方面的研究。自由基对蛋白质的不利影响是其对人体危害的最重要方面，这可从两个方面去理解： 首先是自由基直接对蛋白质的氧化破坏和引起的交联变性，这是衰老形成的重要原因之一。 对蛋白质直接破坏的后果主要有： （1 ） 可使酶蛋白失活成为另一种催化错误反应的酶； （2） 出现某些具有异质性的蛋白质，从而引起自身免疫反应的靶子；（3）自由基可使结缔组织 结构蛋白发生广泛交联，使其理、化性质发生改变，导致血液和组织间的交换减少，使其中 的器官组织加速衰老退化。 同时这些变性结缔组织原有的功能也部分甚至全部丧失了。 自由 基对蛋白质不利影响的第二个方面是对核酸的氧化和交联，使 DNA 发生断裂、突变以及对 热的稳定性发生改变等，从而严重影响了蛋白质遗传信息的正常转录、翻译过程，使蛋白质 表达量降低甚至消失，或者产生突变蛋白质。这种影响反映在酶蛋白和激素、免疫活性物质 等重要蛋白质时其影响范围就更大， 后果就更严重。 而蛋白质合成减少是老年性记忆力减退、 智力障碍以及肌肉萎缩等表现的重要原因之一。 总之自由基对蛋白质的影响涉及面很广， 后 果严重而复杂，乃是自由基与衰老联系的重要纽带。随年龄的增长，人体内自由基水平呈增长趋势，同时自由基清除机制却呈退化趋势， 结果造成体内自由基大量积聚。 所以自由基对机体健康的危害作用渐趋严重， 引发了机体多 种生理功能的障碍，促进了多种老年疾病（如动脉粥样硬化、心脑血管疾病、脑神经细胞变 性、糖尿病以及肿瘤等）的发生、发展，导致机体的衰老，直至死亡。在整个衰老过程中，自由基引起大量的细胞衰老、死亡，近年来已有大量资料表明这 些细胞的衰老、死亡许多属于自由基引发的细胞凋亡（apoptosis）。二、细胞凋亡与衰老死亡是生命过程中的一个组成部分，机体死亡归根结底是细胞的死亡，而细胞的死亡 有两种不同的方式，即坏死（necrosis）和凋亡。细胞凋亡即程序化细胞死亡（programed cell edath,PCD），它有别于细胞坏死，因为细胞凋亡是一种重要的生理学现象，它是一个 主动的、有控的、在调节机体细胞群数量上起和有丝分裂互补作用的过程。细胞的衰老性死 亡就是细胞凋亡。不容置疑，细胞凋亡与衰老密切 相关，它就是机体衰老过程中具体到细 胞水平的体现。问题是衰老过程中细胞凋亡是如何被启动和调控的？这才是亟待探讨的课 题。许多研究资料已经表明， 体内过量自由基特别是 ROS 的堆积与细胞凋亡率的上升具有 密切关系， 这可能是自由基之所以与衰老的老年退行性疾病关系十分密切的主要机理。 自由 基特别是 ROS 主要多产于那些具有重要功能、高度活动并有高耗氧量的组织细胞，如脑细 胞、神经细胞、心肌细胞以及具有内分泌功能的腺体细胞等，结果可使这些细胞局部的自由 基水平远高于其它组织细胞局部，使前文已述及的那些自由基对机体的有 害作用机理特别 是对核酸的蛋白质的损伤机理高度启动，结果使这些组织细胞调亡率增高。ROS 之所以在 这些组织细胞局部堆积与 ROS 的下列产生机理有关：（1）这些组织高度活跃的需氧代谢 使其线粒体呼吸链消耗氧的产物量很高；（2）过氧化物酶体产生大量过氧化氢产物；（3） 激活的吞噬细胞“呼吸爆 发”（burst）产生大量 ROS；（4）细胞色素 P450 酶的诱导。抗氧化剂的缺乏使 ROS 等自由基的水平更高，导致细胞内 DNA、蛋白质、脂膜等的 损伤，诱导细胞凋亡。许多实验发现多种细胞系暴露于低剂量 H2O2（10-100μmol/L）时可 发生细胞凋亡， 有人以低于 10μmol/L 的 H2O2 处理胸腺细胞 10 分钟即发生胸腺细胞的普遍 凋亡，并随 H2O2 剂量的增加其调亡率也明显增加。自由基也是许多生物活性物质如细胞因子 TNF、IFN、GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞克 隆刺激因子）以及 IL（白细胞介素）等作用过程中引起细胞凋亡的介导物。但是，过量自由基引起细胞凋亡的分子机理的诸多环节仍需研究。除自由基外， 各种其它病理性刺激都可激发细胞凋亡的启动， 如辐射、 有害物质、 DNA 突变以及内环境的许多变化等等。 但这些因素启动细胞凋亡的具体分子机制尚有待进一步研 究。细胞凋亡时最突出的特征是细胞 DNA 的有控裂解， 这种裂解是一种钙镁依赖性核酸内 切酶被激活后对细胞 DNA 在核小体与核小体之间的不断地切断，结果产生若干大小不等的 寡核苷酸片段，电泳时形成所谓的“梯形电泳谱带群”。有许多研究资料显示这种有控裂解程 序的启动与“细胞凋亡相关基因”有关。毫无疑问，凋亡信号是通过一系列细胞信号传导系统而被细胞接受的，它与细胞增殖 信号交错形成复杂的网络，最终结局还需 调节系统的调节。许多研究结果已经表明，原癌 基因 c-myc 和 c-fos 的表达对于细胞凋亡的启动可能是必需的。有研究结果显示，c-myc 的 高表达可同时刺激细胞分裂和调亡， 但向何种趋势发展尚取决于是否存在其它关键性生长刺 激物，如果存在，c-myc 即发挥原癌基因的作用而使细胞加速繁殖，反之，则启动细胞凋亡 程序。作为调控系统的一员，细胞中也存在抑制凋亡的原癌基因如 bcl-2,它只抑制细胞凋亡 但 不象 c-myc 和 c-fos 那样可以刺激细胞增殖。 研究发现 bcl-2 多位于细胞内氧自由基产生 较多的位置如线粒体、内质网和核膜等，这与细胞的抗氧化自我保护不无关系。已经发现 bcl-2 抑制细胞凋亡可以是由于它编码的 26Kda 蛋白， 该蛋白可以强有力的抑制副射、 激素、 细胞因子以及抗体等对细胞凋亡的启动作用， 这表明其可能阻止多种凋亡途径中的某个共同环节。P53 是研究相关多的一个肿瘤抑制基因，对 P53 的诱导表达可以提高细胞凋亡率（如 肿瘤细胞凋亡率）。总之，以上基因在凋亡控制作用中起不同作用，其对机体利弊因场所和 作用对象不同而异，但就正常体细胞的凋亡来讲，它们和衰老与抗衰老紧密地联系在一起， 这些联系的许多机制还需进一步研究。三、线粒体 NDA 突变与衰老及退行性疾病人类线粒体 DNA（mtDNA）全长 16569bp，为一闭合环状双链（轻链和重链，都有编 码功能）超螺旋 DNA，存在于线粒体基质中。人体不同类型细胞含线粒体数不同，有的含 数百个甚至上千个，有的则不含线粒体如成熟红细胞。每个线粒体中有 2-10 个 mtDNA 分 子，mtDNA 基因组含有编码两种 rRNA(12S 和 16S)、22 种 tRNA 及细胞氧化磷酸化有关 的 13 条多肽链（细胞色素 B 和 C、氧化酶 I、Ⅱ、Ⅲ亚单位、ATP3 亚单位 6 和 8 两部分以 及呼吸链 NADH 脱氢酶的 7 个亚单位即 ND1-ND6 以及 ND4L）的原因。MtDNA 的内共生来源、胞体定位以及多拷贝等特点使其具有独特的遗传学特性；半自 主自制、母系遗传、数量遗传性状（即异质体和阈值效应）。异质体是指在一个细胞内同时 存在正常的与突变的两种 mtDNA；阈值效应则指只有突变型 mtDNA 数目达到一定限度地， 才足以引起器官或组织的功能异常，这一限度即为阈值。与核 DNA（nDAN）相比，mtDNA 的特殊性有：（1）mtDNA 裸露无组蛋白保护且缺 乏有效的修复系统，因此其突变率远高于 nDNA（约为其 10～100 倍）并且在细胞内不断 积累；（2）mtDNA 具有极其经济的基因排列，既无内含子又有部分区域基因重复使用，因此任何突变都可能成为造成重要功能缺陷的病理性突变， 但由于其异质性， 突变型和正常型 mtDNA 拷贝数比值需达到一定阈值时才导致出现异常临床症状、体征。近年来，mtDNA 突变相关疾病不断地发现，但突变类型大致可分为碱基替换突变和重 组突变两种。如果从突变的细胞系来看又可分为生殖细胞系突变和体细胞系突变。1．生殖细胞系突变mtDNA 主要为母系遗传，所以，这里的生殖细胞系突变主要指女性生殖细胞系突变， 任何可能发生的 mtDNA 突变均可涉及人类女性生殖细胞系， 其中以碱基替换突变最为常见。生殖细胞内 mtDNA 发生突变后出现下述过程：当生殖细胞内 mtDNA 发生突变时，可 造成细胞内突变型与野生型 mtDNA 同时存在（即异质体），随后，突变型与野生型 mtDNA 通过减数分裂和有丝分裂随机分布到子代细胞中，结果细胞中突变型与野生型 mtDNA 的比 例发生随机增减（称为遗传漂变），最后，再分裂的子代细胞有朝着全部为突变型或全部为 野生型 mtDNA（即同质体）的方向发展的趋势，这一过程称为“复制分离”。随着复制分离和遗传漂变的发生，一些 mtDNA 中“中性突变”（对机体无害也无益、选 择作用不明显的突变）可以建立起同质体而以一定频率保留于人群中，形成 mtDNA 某些区 段的多态性。与之相反，重度有害突变因复制分离造成的同质体个体发病早，极易随自然选 择而消除，很少成活下去，所以多数重度有害突变无法建立起同质体，其发病者多为新出现 的异质体表型，介于上述二者之间的为轻度有害突变，它对繁殖后代影响不很严重，可在人 群中建立起低频度多态性，但这些个体因具有氧化磷酸化（OSPHOS）能力的缺陷而过早 发生退行性疾病。近年来研究已经发现某些疾病与 mtDNA 碱基替换突变有关。如 Lerbe 氏遗传性视神 经病（Lerbe’s hereditary optic neuropathy）是 mtDNA 第 11778 位 G 转为 A 面使 NADH 脱氢酶第四亚单位 ND4 的第 340 位精氨酸残基被组氨酸残基取代，还有多个位点的突变对 本病的发生起作用。又如线粒体脑肌病（mitochondrial mypathy,encephalopathy）伴高乳 酸血症（lctic acidosis）和卒中样发作（stroke-like episodes）患者和成年型糖尿病伴耳聋 患者，其 mtDNA 发生 tRNALeu 基因第 3242 位 A→G 替换突变。2．体细胞系突变体细胞系 mtDNA 突变与氧自由基损伤关系密切。呼吸链反应（呼吸爆发）是产生氧自 由基的重要来源，线粒体正是这一过程的重要场所，而且 mtDNA 缺乏修复能力，所以， mtDNA 很易被自由基损伤并不断积累。年龄相关的体细胞 mtDNA 突变的积累与随增龄而 出现的 OXPHOS 能力下降密切相关。体细胞系 mtDNA 突变即可能是碱基替换突变也可能是重组突变， 重组突变又以片段缺 失最为多见，缺失片段的长度及占总 mtDNA 的量决定了其产生影响的大小。近年来发现的 mtDNA 缺失类型已有十几种 ，不同的缺失类型有不同的组织特异性，其中骨骼肌、脑、心 肌等是发生缺失较多的组织。有资料表明，mtDNA 缺失突变引起的疾病常常是散发的，无 家族史的，发病率随年龄而增加，这从反面说明了 mtDNA 缺 失突变多为体细胞突变。体细胞系 mtDNA 突变与生殖细胞系 mtDNA 突变所产生的生理效应相加，如被遗传的 有缺陷的 mtDNA 越少，则引起发病所需体细胞 mtDNA 的损伤就越多，由此引起有关的器 官衰竭所要求的 mtDNA 损伤积累需要的时间也越长；反之亦然。也就是说，年龄相关的mtDNA 突变的积累所致的分裂后组织的 OXPHOS 功能的渐进性丧失会增加遗传缺陷所造 成的 OXPHOS 缺陷，这可能是造成某些线粒体疾病晚发病及渐进性加重的原因之一。（二）mtDNA 突变与衰老及与年龄相关的退行性疾病的关系体细胞系 mtDNA 突变的积累与人类组织器官（脑、心肌、骨骼肌、皮肤、肝、卵母细 胞及精子等）衰老、机体衰老及许多老年性退行性疾病密切相关，Wallace 等发现，40 多 岁的正常人的心脏及脑有 5kb、7.4kb 片段缺失，缺失频率随增龄而增加。许多资料证明， mtDNA 突变随增龄而积累，机体寿命与基础代谢率呈反比而与氧自由基清除率呈正比。这 均说明随增龄而 OXPHOS 功能的下降可能是 mtDNA 氧化损伤积累的结果。1．MtDNA 突变与老年心血管疾病在心血管疾病方面， 已经发现扩张性心肌病和肥厚性心肌病均存在 mtDNA 片段缺失和 点突变，有的甚至可见多个片段缺失，缺失常位于 ATPase6 和 D 环区的 7.4kb 片段缺失。 研究提示 mtDNA 突变与衰老、心肌缺血、老年心衰及“老年心脏”等老年性心脏疾病的发生 有关，主要是 mtDNA 片段的缺失。衰老心肌中 mtDNA 片段缺失和 OXPHOS 中酶活性下 降可能导致自由基介导的脂类过氧化反应加速，这可能是形成动脉粥样硬化斑块的原因之 一。2．MtDNA 突变与老年中枢神经系统的退行性改变及疾病中枢神经系统的退行性改变及疾病是老年人的常见疾病。研究资料提示 Parkinson 病 （PD）、Alzheimer 病(AD)和 Huntington 病（HD）是中枢神经系统与 OXPHOS 缺陷关系 最为密切的几种退行性疾病，均有不同程度的 mtDNA 突变。PD 是一组以运动失调为主的临床综合症， 其黑质纹状体内多巴胺神经元变性是主要病 理特征。研究发现 PD 患者脑细胞呼吸链复合物 I 活性下降，黑质尤为明显，其复合物 I 的 mtDNA 编码亚单位减少。患者 mtDNA 有 5.0kb 片段缺失，发生率约为对照组的 10 倍，而 且，不论患者的脑组织还是肌组织其约粒体均存在异质体，这提示当缺失型 mtDNA 数量超 过一定阈值时才会发症。AD 是一类以渐进性痴呆和脑皮质萎缩为主要特征的老年性疾病。 许多研究曾集中于 β淀粉样前体蛋白的基因突变与 β-淀粉样前体蛋白成份的异常，但这类病例只占患者的很少 一部分。目前的研究表明 mtDNAT 突变和 OXPHOS 缺陷可能是该病的一个重要原因。 Parker 等（1992）发现 6 例 AD 患者中 5 例存在复合物 IV 的 OXPHOS 缺陷。也有研究发 现 AD 患者脑新皮质匀浆中存在 OXPHOS 偶联缺陷并有 mtDNA 点突变及缺失突变， 因此， AD 的发展在某种程度上与 mtDNA 突变及 OXPHOS 缺陷有关，其中包括触小体的退行性 变。HD 是以成年期发病的运动失调和渐进性痴呆为主要特征的常染色体显性遗传病， 病理 特点是基底神经节的退行性变。在 HD 患者脑中发现豆状而非皮质中复合物 IV 的缺陷，血 小板线粒体有复合物 I 的缺陷。HD 表现一定的母系遗传化倾向。这些资料表明，HD 的发 生、发展可能与 mtDNA 突变有关。3．MtDNA 突变与非胰岛素依赖型糖尿病非胰岛素依赖型糖尿病是一种年龄相关性疾病， 是老年人最常见的一种内分泌系疾病。 本病也出现退行性疾病特征，其发病与线料体 OXPHOS 功能缺陷有密切关系。线粒体的 OXPHOS 在葡萄糖诱导胰岛 β 细胞分泌胰岛素过程中起重要作用。 研究表明， 成年期糖 尿病患者存在 mtDNA 的异质均有异质体 10.4kbmtDNA 片段缺失，缺失位于
位 点之间，缺失部分包括 L 链起点（O2）和除 rRNA 、ND1 部分 cytb 和相邻的 RNA 外的所 有 mtDNA 编码基因。缺失后的 mtDNA 分子小因而具有自制优势，易于在细胞内聚积而使 异质体达到阈值效应。由于编码呼吸链的一些基因缺失，故 OXPHOS 功能逐渐下降，能量来源表现不足， 胰岛分泌能力下降，从而诱发糖 尿病。一些非胰岛素依赖型糖尿病患者表现为 mtDNA 的 点突变。如 mtDNA3243 位 A→G 突变，不仅影响了 tRNALeu 的合成，还累及转录终止因子 的结合，造成线粒体蛋白的合成不足，影响了 ATP 的生产，这一突变的母亲遗传倾向较大。MtDNA 突变的后果是十分严重的，不仅导致衰老并可引发多种疾病，尽管造成这些恶 果的原因可能是多方面的。但是，由于 mtDNA 突变所致的呼吸链有关的酶类出现异常以及 OXPHOS 功能异常是不可忽视的因素，因为 mtDNA 编码的蛋白质亚基都是 ATP 生产有关 的，而线粒体在细胞能量供应及维持细胞正常代谢和功能方面是举足轻重的，所以，不难理 解其与机体衰老和退行性疾病的密切关系。目前，对于 mtDNA 突变已经可以用 PCR、Southern 杂交、电镜等手段来有效地予以 检测，已经提出一些可能的治疗线粒体疾病的方法，如补充呼吸链中的辅助因子、增加可氧 化基质以及抗自由基损伤等，辅酶 Q 已经用于某些老年性退行性疾病的治疗，mtDNA 基因 的导入、含正常 mtDNA 基因型细胞的再增殖、导入以及融合等均有可能成为 mtDNA 突变 性疾病的基因治疗手段。四、染色体端粒长度与衰老正常人细胞随着复制能力下降，其染色体终端即端粒（telomere）的长度变短，端粒 长度受染色体端粒酶（telomerase）活力的调节，端粒酶以端粒 RNA 为模板合成端粒序列 而使端粒延长。有人曾经对人淋巴细胞的衰老性变化与其端粒长度以及端粒酶活性的关系在各种体内 体外环境及处理因素下做了观测， 发现端粒酶活力和端粒长度的调节有可能是淋巴细胞增殖 的控制因素，这已在人淋巴细胞的发育、分化、激活和衰老过程中被验证。曾发现外周血 CD+4T 细胞的端粒长度在体内随着衰老以及从静息细胞到记忆细胞的分化过程而缩短，在 体外则随着细胞的分裂而缩短， 这些结果提示端粒长度与淋巴细胞增殖过程以及记忆性增殖 潜力相关。与之相反，体内实验中扁桃体 B 细胞分化及生发中心形成过程中凋粒长度却是 增加的。同时，也发现在体内 T 细胞发育和 B 细胞中端粒酶活性是被严格控制着的；在胸 腺细胞和生发中心 B 细胞内凋粒酶活力外于高水平，在静止、成熟的外周血淋巴细胞的该 酶活力处于较低水平。最后，静息淋巴细胞保持着在活化时上调端粒酶活性的能力，并且这 种能力并不随着细胞的逐渐衰老而降低。 虽然端粒酶对淋巴细胞的确切作用有待于进一步阐 明，但这种酶可能有助于避免 T、B 淋巴细胞终端的缩短，并因此在淋巴细胞的生长、分化 和激活过程中起重要作用。已经发现永生细胞以及恶性肿瘤等细胞隐匿有端粒酶活性，即在这些细胞其端粒长度 被维持，以维持这些细胞的超乎寻常的持续性增殖能力。大量试验资料表明，端粒酶活性的高低直接影响端粒长度的增减，而端粒的长短直接 影响细胞内基因的表达，进而影响到细胞的增殖和寿命。所以，未来进一步探索衰老因素、 长寿因素对端粒长度的影响， 或者克隆人端粒基因等研究课题将对人体衰老与抗衰老具有十 分重要的理论及实际意义。五、免疫功能退化和衰老在对衰老与抗衰老的研究中发现，免疫系统的功能状态与衰老的发生和发展有着十分 密切的关系，而且，免疫系统本身也有衰老退化的问题，而这种衰老退化在极大程度上表现 为机体的衰老性改变。老年人的免疫器官表现为明显的退化，其中以胸腺的改变量为明显。老年人胸腺的组 织学特征主要表现在衰老的胸腺皮质只剩下一些稀疏的淋巴细胞， 其间杂以大量的充满类脂 质颗粒的巨噬细胞。在髓质和皮质中，均可见到大量的浆细胞和肥大细胞，大部分胸腺组织 被结缔组织和脂肪所代替。电镜下观察到胸腺皮质变薄，胸腺细胞显著减少，髓质上皮细胞 碎裂成多个小巢，其间堆积着大量的巨噬细胞、浆细胞、淋巴细胞和纤维母细胞。动物实验发现，将老龄鼠的胸腺植入幼鼠体内，移植物可重新获得生命力：但将幼龄 鼠的胸腺植入到老龄鼠体内却不能改变老龄鼠的低免疫反应状态。 又发现， 老龄鼠的骨髓干 细胞植入幼龄鼠体内后，宿主鼠的 B 细胞生成减少，其功能也较低下，但此时 T 细胞的功 能却十分活跃。以上资料充分表明，胸腺-骨髓-激素系统是决定机体免疫功能状态的 3 个关 键环节，而在衰老过程中起决定作用的是胸腺。以免疫活性细胞来看，老年人体内重要免疫活性细胞如 T 细胞等的数量明显少于年轻 人，而且在免疫应答中的反应性明显降低，但是，有些细胞如 K 细胞的数量却随年龄的增 加而增加， 其体外抗靶细胞的自发性细胞毒性也比年轻人为高， 但其体内作用和意义如何却 需进一步探索。 T 细胞是免疫活性细胞中最为重要的细胞群之一， 老年人 T 细胞总数减少但 其亚群的改变主要是 TH/T5 的增高， 而另一重要细胞群――B 细胞在人一生中数量变化不大， 但其功能显然受 TH/T5 变化的影响，巨噬细胞（Mф）的数量和功能随年龄的变化不明显，对于 T、B 细胞的辅助协同作用也无明显变化，但是其识别和提呈抗原的能力却随年龄的增 长而有所下降。表-1 给出老年人和年轻人外周血白细胞的变化。抗衰老研究进展对衰老机理的研究就是为了有效地指导抗衰老的研究和实践工作。人类对抗衰老的研究可以追溯到数千年以上的历史，中医药学在这方面亦有其重要贡 献。从目前资料来看，抗衰老研究成果除生活习惯或者锻炼方法等特殊方面外，主要可分为 两个方面，即长寿基因和衰老基因研究以及抗衰老制剂研究。一、长寿基因和衰老基因研究进展大量研究资料证明物种的平均寿命和最高寿命（maximun life-span）是相当恒定的， 所以，物种的寿命显然是在一定程度上受遗传基因控制的，因而这里自然涉及到所谓的“衰 老基因”和“长寿基因”的概念。根据现有资料，衰老基因和长寿基因都应是一个广义概念，绝 不是指某个基因而言，是泛指那些具有引起或延缓衰老作用的基因。（一）衰老基因衰老基因和长寿基因是一个矛盾的两个方面。以线虫 Caenorhabditis elegans(平均寿 命仅 20 天，适于寿限研究)所做研究表明，其 age-1 单基因突变可提高平均寿命 65%，提 高寿限 110%。Age-1 突变型 C.elegans 的抗氧化酶活力、应变能力都强，耐受 H2O2、农 药、紫外线及高温的能力都强于野生型 C.elegans。研究还发现 C.elegans 的寿限与 clk 基 因以及 daf 基因家族的 daf-2 基因相关。Daf 基因为 C.elegans 形成休眠状态幼虫所必需， 是编码与蠕虫发育相关传递途径中某些蛋白质分子的基因。Clk 基因为 1996 年发现的基因家族。此类基因可能影响染色体结构以至功能而起作用，它们似与生物钟有关，故又称生物 钟基因。Clk 突变株 C.elegans 发育晚于野生株，细胞周期及代谢率减慢，紫外线耐受能力 增加。Clk 基因可影响神经、肌肉等非增殖细胞的寿命。已经发现该基因家族至少 3-4 个成 员。据报道，daf-2 与 clk-1 双突变的 C.elegans 的寿命为野生型的 5 倍多，在 25℃环境中 寿命由 8.5 天增至 49 天。以上资料至少说明 daf 与 clk 基因家族是与衰老相关即有促使衰 老作用的基因。在人类细胞衰老基因研究方面，近年来也取得了较大进展。例如以细胞融合技术将永 生化细胞与正常细胞融合，发现永生化细胞之所以“永生”是由于其衰老相关基因的隐性缺陷 所致。用这一技术研究表明，至少有四套基因通路属于衰老相关基因（senescence associated gene,SAG），如一种分子量为 21000 的 DNA 合成抑制蛋白（senescent cell-derived inhibitor of DNAsynthesis）的基因在人衰老成纤维细胞中的表达比在青龄细胞 中的表达高。Werner 早老综合症是一种隐性遗传性疾病，其细胞可传代数远低于正常人， 据报道该病与一种称为 WRN 的基因突变有关（也说明 WRN 与长寿有关）。老年人可有一系列老年常见病，既可看作老年性特点又可加重衰老过程，从这一角度 来看，某些与老年性疾病有关的基因也可看作衰老基因，如截脂蛋白 Eε4 基因表达活跃时 易发冠脉硬化与阿滋海默病（Alzheimer Disease,AD），又如人 β 淀粉样蛋白基因可使转 基因鼠的 1/2 子代出现老年性痴呆症状。（二）长寿基因机体内存在一些与长寿或抗衰老有关的基因，可以统称为长寿基因。以蛋白质生物合 成的延长因子-1α（EF-1α）基因转基因于果蝇生殖细胞，可使子代果绳比其它果蝇寿命延长 40%，说明 EF-1α 可能具有长寿作用。研究表明，长寿常常与机体代谢能力以及应激能 力的增强有关， 自由基特别是氧自由基的促衰老作用已经被许多实验结果所支持， 抗氧化酶 类的缺乏可以是短寿的重要的分子基础之一，所以，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢 酶等的基因的表达水平可能与长寿有密切关系。Rose 等曾培养出了寿命 2 倍于野生型的果 蝇品种，其体内含有很高的 SOD 活性。二、抗衰老制剂研究进展研究衰老与衰老机理是为了延缓衰老，这正是老年学和老年医学的主要目的。千百年 来，前人总结摸索出了许许多多的养生之道以及具有一定延年益寿作用的药物。近年来，随 着生物医学事业的飞速发展， 人类在这方面也取得了一定进展。 下面仅对其中几种研究较多、 理论依据比较充足的抗衰老制剂作一介绍 （神经医学在这方面内容极为丰富， 有其独到优势， 由于篇幅所限，这里不做论述，可参见有关书籍）。（一）褪黑素及其受体根据已有的大量实验结果，似乎可以肯定地说所有具有抗氧化作用的药物或制剂都具 有抗衰老作用。具有抗氧化作用的药物或制剂很多，这里我们仅对研究较多的褪黑素 （melatonit,MT）及其受体作一介绍。MT 是一种由松果腺分泌的重要的激素， 近年来发现它有多种新的生物学活性作用， 特 别是 MT 强大的自由基清除作用和衰老的关系已引起学术界的重视。 MT 在临床上作为抗 氧化剂应用已有较长时间， 但通过自由基把它和抗衰老联系起来则是近年提出的。 已如前述， 自由基， 特别是血中或局部自由基水平过量升高时可以引发机体多种衰老性改变， 这一点已 经被公认。在老年人，体内自由基产量增加但清除自由的各种机制却相对退化，自由基的负效应更加突出，所以，给老年人以某种途径加强其自由基清除能力，在抗衰老、提高其身体 素质方面有重要意义。近年的研究发现，MT 的自由基清除能力在众多自由基清除剂中表现 特别突出，因而对保护细胞膜及核酸等有明显作用，具有明显的抗细胞凋亡作用。其作用机 理在 MT 对自由基的直接清除作用和 MT 对脂质过氧化反应的抑制作用。 但老年人在这一点 上存在两个突出问题，一个是 MT 分泌量降低的问题，这可以通过适当给予 MT 制剂来获得 部分解决；另一个是细胞 MT 受体的退化而 MT 利用率的降低，这严重影响了 MT 的利用和 作用的发挥。近年来国外研究 MT 受体的报告很多，如中枢神经系统 MT 受体的研究、MT 受体的体内分布等，其基因序列及其 mRNA 序列已经报道。研究发现 MT 受体在细胞的表 面及核膜均具有，特别是核膜 MT 受体可使 MT 的自由基清除作用对核内 DNA 起到明显保 护作用而不使之在过量自由基作用下损伤或断裂。MT 受体的退化所造成的 MT 利用率降低 问题不是药物能解决的，所以，解决 MT 受体退化问题乃是 MT 课题研究的关键。（二）微量元素人体内共有 60 多种元素，分布于人体所有组织、细胞和体液中。所谓“微量元素”是指 那些体内含量不足体重万分之一者， 它们都必需依赖于从外界摄入来纤维体内正常含量， 体 内不能合成微量元素。 公认的人体必需微量元素有下列 14 种： 铁 （Fe） 、 碘 （I） 、 锌 （Zn） 、 铜(Cu)、锰(Mn)、硒(Se)、铬(Cr)、钼( Mo)、钴(Co)、氟(F)、锶(Sr)、锡(Sn)、镍(Ni)、钒 (v)。正常情况下，这些微量元素通过机体的吸收、代谢、储存、排泄等功能都能维持在一 个正常的水平。微量元素虽量微但对人体具有极其重要的生理功能，广泛涉及到人体生长发育、新陈 代谢、神经活动、免疫功能、酶及内分泌活性等几乎所有生命活动过程 ，一旦这些微量元 素摄入不足、在体内过量聚集或者微量元素间比例失调，都将引起严重后果。例如，人体内有约 1000 种酶， 其中 70%以上的酶为金属酶， 一些微量元素就是某些酶的组成成份或活性 基团，一旦相应微量元素摄入不足，这些酶的活性就会下降而出现严重病理变化。以往，人 们多注意微量元素的摄入不足，而忽视了微量元素间的比例失调，实际上，微量元素对机体 功能的影响正是各种适当量微量元素综合作用的结果。人体步入老年期以后，由于摄入、代谢以及排泄等功能的紊乱，微量元素的正常含量、 比例都易于发生对机体有害性改变，从而引起一系列衰老性表现。例如 Zn、Mn、Se 和 Cr 等可以从基因表达水平来影响谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-pk）、高密度脂蛋白胆固醇 （HDL-C）以及 SOD 和 IgA 等的含量水平，当这些物质含量低于正常水平时，可从多种途 径引起衰老。研究证明，Zn、Mn、Se、Cr、Co、Ge（锗）、V 等对脂代谢， Cr、Mn、 Ni 等对糖代谢， Zn、Se 等对蛋白质代谢都具有重要作用，一旦这些元素缺乏时，三大代 谢将出现障碍， 许多生理功能将随之出现紊乱， 几乎所有的衰老性症状、 体征都可随之发生。在所有微量元素中，以 Zn、Mn、Se、Cu 等较为重要，它们与保护生物膜、提高人体 免疫功能、清除自由基、维护正常的代谢功能、调节血脂代谢防止动脉硬化以及维护脑细胞 能量代谢和改善脑细胞功能等具有密切关系。 研究发现与长寿有关的元素还有很多， 这里不 再一一列举。衰老与抗衰老研究策略与展望一、衰老与抗衰老研究的有关策略（一）基因克隆策略衰老与抗衰老研究中一个十分重要的核心便是衰老或长寿基因的研究，作为前提和基 础， 必需先对欲研究的衰老或长寿基因进行克隆， 这样才能从本质上研究衰老或长寿基因的 调控机制以及各种内外环境因素对调控的影响， 为人类利用这些调控路径造福于健康长寿事 业做出贡献。人类染色体 DNA 双螺旋结构中包含了大约 10 万个基因，迄今为止，只有不到 30 种 基因被克隆。近年来，基因克隆的新技术、新方法不断涌现，大大加快了基因克隆的步伐。 衰老与抗衰老领域完全可以利用这些方法。1．依赖 mRNA 或蛋白表达的方法如果已知某个基因的表达产物，则可以根据其氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从 cDNA 文库中调出 cDNA 克隆；利用克隆的 DNA 片段也可直接筛选 cDNA 文库；通过 Northern 杂交法也可得到某一克隆片段内的表达顺序。 但实际情况往往是我们不知道待研究基因的表 达产物，或者不能获得足够重的纯化的表达产物去测氨基酸序列或作为配体利用。而且，一 个基因的表达往往要求特异的组织。（1）Northern 杂交分析筛选法利用 Northern 杂交法分析可以迅速得到某一克隆片段，如 YAC、 cosmid 和 phage 内 转当序列。YAC DNA 较为复杂，直接进行 Northern 杂交分析难以得到可靠的转录子，故 必须先把 YAC 亚克隆为 cosmid 或 phage 的重叠群， 以检测到转当顺序的克隆或亚克隆再 去筛选 cDNA 文库，以得到 cDNA 克隆。（2）cDNA 文库筛选法每种细胞中约 15000 个基因可以表达，但其含量从几个拷贝到 20 万拷贝不等，所以， 就面临一个文库完整性的问题。可以下述 3 种方法使文库趋于完整：①用基因组 DNA 进行 杂交选择；②用二次复性法；将 cDNA 变性后拷贝少的片段复性得慢，去掉双链后各种转 录子的拷贝数将会匀衡，然后以 PCR 扩增，得到一个完整的 cDNA 文库；③构建各种特异 性组织的混合文库池。对于上述完整 cDNA 文库可以单拷贝或复杂探针来筛选 。（3）杂交筛选法将 cDNA 文库和大片段的基因组 DNA 杂交，通过 PCR（引物与 cDNA 文库载体克隆 位点两端序列对应）可以筛选到基因组 DNA 中的表达序列。该法还可用来筛选某一给定大 片段内的微卫星 DNA。2．不依赖表达的方法这些方法不用构建某一特定组织某一适当发育时期的 cDNA 文库，它主要是用于对某 一小段被认为含有潜在的外显子的 DNA 片段进行研究。这类方法有 CpG 岛筛选法、NotI 连锁片段筛选法、外显子捕获法、 Zoo blot 筛选法、 剪接位点筛选法等等。3．其它基因克隆法由于计算机技术的飞速发展，利用所获得的基因序列在计算机基因组数据库中鉴定那 些潜在的外显子成为可能。不同种之间的 DNA 序列可在计算机中进行比较，那些保守的序 列意味着可能是某种外显子或者具有某种重要的生理功能。对 cDNA 文库中随机挑选的 cDNA 克隆进行序列分析和染色体定位也是克隆基因的一种方法。随着 DNA 测序技术的自 动化和机器人的使用， DNA 序列分析的速度越来越快， 利用 DNA 序列分析软件可在基因组 DNA 中鉴定侯选的开始阅读框架（open reading frames）。被誉为抗体第三次革命中的抗体工程新技术――噬菌体抗体库技术 （technology of the repertoire of antibodies displayed on phages）是克隆人源性抗体基因的新技术，它使人类 绕过杂交瘤和预免疫（by-passing immunization and hybridoma）这些杂交瘤单克隆抗体制 备技术而研制任意一种基因工程抗体的梦想终于变成了现实。 由于篇幅所限， 其复杂的工作 原理这里不再赘述。 以该技术所制备的人源性基因工程抗体克服了杂交瘤单抗的不足 （如人 体应用的异质性问题）。因内王琰、侯景春等已经成功地应用该技术克隆、筛选了人源性抗 HBsAG、HTV（汉坦病毒）的单链抗体基因（ScFv）。应用该技术可以克隆、筛选所有其 表达物具有配体的基因， 如受体基因等。 它在对促衰老基因以及抗衰老基因或者某种抗衰老作用物（如受体）等研究方面具有很大潜力。目前，该技术正向全分子抗体基因以及高效率 表达方向发展。（二）基因治疗策略对衰老的基因治疗方面目前还研究极少，但可以肯定地说衰老的基因治疗具有诱人的 前景。可以从两个方面来考虑这个问题。首先，对于已经阐明的具有促衰老作用而无其它重 要生理功能的基因可以考虑用基因治疗的方法给予抑制或破坏； 其次， 对于已经肯定的具有 长寿作用而对人体又无不利影响的基因可以考虑以基因工程的方法促其表达。具体方法很 多，例如反义核酸、基因打靶、转基因技术等。这里提出 2 种新的方法作一简要介绍。第一种是对于衰老基因可以考虑应用核酶（ribozyme）技术予以破坏其 mRNA 而干扰 或中断其表达。目前，该技术已广泛地用于 HBV、HCV、HIV 等病毒基因的处理研究。核 酶是对特异性 RNA 序列具有剪切催化作用的一类特殊的 RNA， 可以人为地设计其结构和特 异性。第二种是对于某种较短的，具有一定独立作用能力的长寿基因片段可以考虑以基因的 细胞内定位表达技术来将该基因予以细胞内定位表达， 以缓解或克服衰老机体内该基因的退 化性减少。二、对未来衰老与抗衰老研究的展望衰老与抗衰老研究无疑将在未来生命科学研究领域占有十分重要的地位，但是，就目 前人类在这方面的研究来看还很薄弱。今后一个时期内，有关衰老与抗衰老的研究重点还应放在以最新生物学技术研究有关 长寿与衰老基因的克隆、结构分析以及对这些基因的调控机制；机体衰老过程中自由基、突 变以及其它有害刺激因素启动细胞衰老凋亡的分子机制和这些过程被调控的分子机理； 利用 衰老基因与长寿基因的研究成果进行的基因治疗方面研究等。在上述研究的基础上，研究开发新一代强有力延缓衰老的制剂或者技术性手段也必然 成为很有价值的研究热门。同时，充分发掘祖国医学在这方面的潜力和优势，将是抗衰老研 究方面的极为重要的组成部分。
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