微生物实验指导_甜梦文库
微生物实验指导
微 生 物 学 实 验沈阳农业大学土地与环境学院 微生物学教研室编 2008 年 9 月前 言微生物学具有前沿性和开拓性，是生命科学最重要组成部分，对生命科学的基础研 究和重大发现都起到了决定性的作用。可以说，没有微生物学知识，生命科学的理论和 研究技术的建立及发展是不可能的。 微生物学实验是微生物学重要组成部分，是微生物学教学的重要内容。近年来，随 着微生物学的迅速发展及其在多个领域的不断渗透，无论在理论研究还是在实际应用， 尤其是微生物学教学改革的实施，新的培养目标和教学大纲的要求等方面，都要求有更 新颖和实用的微生物学实验教材做基垫。编者根据新版教学大纲，以及多年的教学和研 究实践，在 2002 年版教材基础上，针对我校教学实际，对实验内容重新整合、精选，编 写了这本《微生物学实验》教学指导教材。 本书由沈阳农业大学微生物学教研室全体教师参加编写，由钮旭光、肖亦农、刘灵 芝主编统稿，韩梅最后审稿。由于时间仓促，书中谬误和遗漏在所难免，恳请读者批评 指正。 编者 于沈阳农业大学 2008 年 9 月目 录实验一 普通光学显微镜的构造\性能和使用方法 ................................................................. 2 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能,学习并掌握油镜的原理和使用方法。......... 2 实验二 细菌的简单染色及观察 ............................................................................................... 8 实验三 细菌的革兰氏染色及观察 ..........................................................................................11 实验四 放线菌形态观察 ......................................................................................................... 13 实验五 真菌形态观察（Ⅰ） ................................................................................................. 15 实验六 真菌形态观察（Ⅱ） ................................................................................................. 17 实验七 土壤中各类微生物群体分离及形态观察 ................................................................. 19 实验八 微生物大小的测定 ..................................................................................................... 28 实验九 微生物数量的测定 ..................................................................................................... 30 实验十 水中总大肠菌群的测定――多管发酵法 ................................................................. 36 实验十一 昆虫病毒核型多角体的观察 ................................................................................. 40 实验十二 大肠杆菌生长曲线的测定 ..................................................................................... 42 实验十三 微生物菌种保藏方法 ............................................................................................. 44 实验十四 空气中微生物的计数 ............................................................................................. 48 实验十五 环境条件对微生物的影响 ..................................................................................... 51 实验十六 土壤中纤维素分解菌的分离 ................................................................................. 53 实验十七 土壤氨化细菌的分离 ............................................................................................. 55 实验十八 豆科植物根瘤中根瘤菌的分离与类菌体的观察.................................................. 57 实验十九 固定化酵母凝胶粒子的制备及其酒精发酵 ......................................................... 59 实验二十 乳酸发酵及酸泡菜中乳酸菌的分离 ..................................................................... 62 实验二十一 酸奶的酿造及乳酸的快速测定（酶法） ......................................................... 64 实验二十二 糖化曲的制备及测定 ......................................................................................... 66 实验二十三 硝化作用强度的测定 ......................................................................................... 70 实验二十四 反硝化作用强度的测定 ..................................................................................... 72 实验二十五 土壤中磷细菌的分离 ......................................................................................... 74 实验二十六 微生物对硫、铁的转化 ..................................................................................... 76 实验二十七 噬菌体的分离，纯化及效价测定 ..................................................................... 78 实验二十八 食用菌菌种的提纯复壮 ..................................................................................... 80 实验二十九 香菇菌种的分离纯化 ......................................................................................... 82 实验三十 平菇生产菌种的制作 ............................................................................................. 84 附录一 教学常用菌种 ............................................................................................................. 86 附录二 常用试剂及指示剂的配制 ......................................................................................... 87 附录三 常用染色液的配制 ..................................................................................................... 88 附录四 常用培养基配方 ......................................................................................................... 90 附录五 稀释法测数统计表 ..................................................................................................... 93 附录六 大肠杆菌检索表 ......................................................................................................... 941普通光学显微镜的构造\ 实验一 普通光学显微镜的构造\性能和使用方法一、实验目的 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能,学习并掌握油镜的原理和使用方法。 二、实验原理 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式 显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。 （一）显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微 动螺旋等部件。图 1-1 光学显微镜的构造及其成像原理1.镜座 镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载 物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 2.镜筒 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的 暗室。2从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。 因为物镜的放大率是对一定的镜筒 长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因 此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为 160mm， 此数字标在物镜的外壳上。 3.物镜转换器 物镜转换器上可安装 3~4 个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、 油镜）。通常显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜 和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 4.载物台 载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作 用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 5.推动器 是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的， 好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观 察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动 推动器，就可以找到原来标本的位置。 6.粗动螺旋 粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺 旋向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜（如 Nikon 显微镜）镜检时，右手向 前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。 7.微动螺旋 用粗动螺旋只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动 螺旋做进一步调节。微动螺旋每转一圈镜筒移动 0.1mm（100?m）。新近出产的较高档 次的显微镜的粗动螺旋和微动螺旋是共轴的。 （二）显微镜的光学系统 显微镜的光学系统由反光镜，聚光器，接物镜，接目镜等组成，光学系统使物体放 大，形成物体放大像。见图 1-1。 1.反光镜 较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光 镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的 中央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时， 一般都用平面镜。新近出产的较高档次的显微镜镜座上装有光源，并有电流调节螺旋， 可通过调节电流大小调节光照强度。 2.聚光器 聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。聚 光器可分为明视场聚光器和暗视场聚光器。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器， 明视场聚光器有阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器。阿贝聚光器在物镜数值孔径高 于 0.6 时会显示出色差和球差。齐明聚光器对色差、球差和慧差的校正程度很高，是明视 场镜检中质量最好的聚光器，但它不适于 4 倍以下的物镜。摇出聚光器能将聚光器上透 镜从光路中摇出满足低倍物镜（4×）大视场照明的需要。 聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以 得到最强的照明，使物象获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被 检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方 1.25mm 处，而其上升限度为载 物台平面下方 0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在 0.8~1.2mm 之间，否则被检样 品不在焦点上，影响镜检效果。聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩 小，影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便3产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩 光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在 视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。 3.物镜 安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜 成像的质量， 对分辨力有着决定性的影响。 物镜的性能取决于物镜的数值孔径 （numerical apeature 简写为 NA），每个物镜的数值孔径都标在物镜的外壳上，数值孔径越大，物镜 的性能越好。 物镜的种类很多，可从不同角度来分类。根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不 同，可分为： （1）干燥系物镜 以空气为介质，如常用的 40×以下的物镜，数值孔径均小于 1。 （2）油浸系物镜 常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为 90×~100×， 数值孔值大于 1。 根据物镜放大率的高低，可分为： （1）低倍物镜 指 1×~6×，NA 值为 0.04~0.15； （2）中倍物镜 指 6×~25×，NA 值为 0.15~0.40； （3）高倍物镜 指 25×~63×，NA 值为 0.35~0.95； （4）油浸物镜 指 90×~100×，NA 值为 1.25~1.40。 根据物镜像差校正的程度来分类可分为： （1）消色差物镜 是最常用的物镜，外壳上标有“Ach”字样，该物镜可以除红光和青 光形成的色差。镜检时通常与惠更斯目镜配合使用。 （2）复消色差物镜 物镜外壳上标有“Apo”字样，除能校正红、蓝、绿三色光的色差 外，还能校正黄色光造成的相差，通常与补偿目镜配合使用。 （3）特种物镜 在上述物镜基础上，为达到某些特定观察效果而制造的物镜。如： 带校正环物镜，带视场光阑物镜，相差物镜，荧光物镜，无应变物镜，无罩物镜，长工 作距离物镜等。目前在研究中常用的物镜还有：半复消色差物镜（FL），平场物镜(Plan)， 平场复消色差物镜（Plan Apo），超平场物镜（Splan，超平场复消色差物镜（Splan Apo） 等。 4.目镜 目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次， 并把物像映入观察者的眼中。 目镜的结构较物镜简单，普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜 称“接目镜”，下端的透镜称“场镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的 环状光阑或叫“视场光阑”，物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面处，所以其上可安 置目镜测微尺。 普通光学显微镜常用的目镜为惠更斯目镜（Huygens eyepiece），如要进行研究用时， 一般选用性能更好的目镜，如补偿目镜（K）、平场目镜（P）、广视场目镜（WF）。照 相时选用照相目镜（NFK）。 （三）显微镜的性能 显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高， 而且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目 镜和聚光镜的性能。41.数值孔径 也叫做镜口率或开口率，简写为 NA，在物镜和聚光器上都标有它们的 数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。数 值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比， 与镜像亮度的平方根成正比。数值孔径可用下式表示： NA = n?sinθ 式中 n―物镜与标本之间的介质析射率；α―物镜的镜口角。所谓镜口角是指从物镜光轴 上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度，见图 1-2。 镜口角 α 总是小于 180°，θ为 α/2。因为空气的折射率为 1，所以干燥物镜的数值 孔径总是小于 1，一般为 0.05~0.95；油浸物镜如用香柏油（折射率为 1.515）浸没，则数 值孔径最大可接近 1.5。虽然理论上数值孔径的极限等于所用浸没介质的折射率，但实际 上从透镜的制造技术看，是不可能达到这一极限的。通常在实用范围内，高级油浸物镜 的最大数值孔径是 1.4。 几种物质的介质的折射率为：空气为 1.0，水为 1.33，玻璃为 1.5，甘油为 1.47，香 柏油为 1.52。介质折射率对物镜光线通路的影响见图 1-3。图 1-2 物镜的光线入射角图 1-3 干燥物镜和油浸系物镜光线通路2.分辨力 D 可用下式表示： D = λ/2NA 可见光的波长为 0.4~0.7?m，平均波长为 0.55?m。若用数值孔为 0.65 的物镜，则 D=0.55?m/2×0.65=0.42?m。 这表示被检物体在 0.42?m 以上时可被观察到， 若小于 0.42?m 就不能视见。如果使用数值孔径为 1.25 的物镜，则 D=2.20?m。凡被检物体长度大于这 个数值，均能视见。由此可见，D 值愈小，分辨力愈高，物象愈清楚。根据上式，可通 过：（1）减低波长；（2）增大折射率；（3）加大镜口角来提高分辨力。紫外线作光源 的显微镜和电子显微镜就是利用短光波来提高分辨力以检视较小的物体的。物镜分辨力 的高低与造象是否清楚有密切的关系。目镜没有这种性能。目镜只放大物镜所造的象。 3.放大率5显微镜放大物体，首先经过物镜第一次放大造象，目镜在明视距离造成第二次放大 象。放大率就是最后的象和原物体两者体积大小之比例。因此，显微镜的放大率（V）等 于物镜放大率（V1）和目镜放大率（V2）的乘积，即： V = V1×V2 4.焦深 在显微镜下观察一个标本时， 焦点对在某一象面时， 物象最清晰， 这象面为目的面。 在视野内除目的面外，还能在目的面的上面和下面看见模糊的物象，这两个面之间的距 离称为焦深。物镜的焦深和数值孔径及放大率成反比：即数值孔径和放大率愈大，焦深 愈小。因此调节油镜比调节低倍镜要更加仔细，否则容易使物象滑过而找不到。 （四）光学显微镜的成像原理 显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组 合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。图 1-1 是显微镜的成像原理模式。在 显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通 光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。 与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如 下二方面的原因： 1.增加照明亮度 油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需 要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入 空气，再进入镜头） ，有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会 因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时 须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏油，其折射 率 n=1.52） 。 2.增加显微镜的分辨率 显微镜的分辨率或分辨力(resolution or resolving power)是指显微镜能辨别两点之间 的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜 性能的限制，可表示为： D=λ/2NA 式中 λ = 光波波长；NA =物镜的数值孔径值。 光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4~0.7?m） ，而数值孔径值则取 决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA = n×sinα式中，α 为光线最大入射角的半数，总是小于 180°。它取决于物镜的直径和焦距，一般 来说在实际应用中最大只能达到 120°，而 n 为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52） 比空气及水的折射率（分别为 1.0 和 1.33）要高，因此以香柏油作为镜头于玻片之间介质 的油镜所能达到的数值孔径值（NA 一般在 1.2~1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA6都低于 1.0） 若以可见光的平均波长 0.55?m 来计算， 。 数值孔径通常在 0.65 左右的高倍镜 只能分辨出距离不小于 0.4?m 的物体，而油镜的分辨率却可达到 0.2?m 左右。 操作步骤： (五)显微镜是精密贵重的仪器，严格遵守操作规程。 1.取镜：打开镜箱，右手握住镜臂，左手托住镜座，轻轻放在桌上。 2.检查各部位零件是否完好，用纱布把镜身擦干净（接物镜、接目镜用擦镜纸拭擦） 。 3.调节光线：将低倍镜转至镜筒下方，转动粗调节器，使镜头离载物台 1 厘米，开放 光圈，升高聚光器，调节反光镜（一般在自然光下用平面反光镜）使视野内有均等的光 线。水浸标本应用较弱的光线，染色标本宜用强光。 4.将标本置载物台上，使之正好在接物镜的下方。 5.低倍镜观察：转动粗调节器使物镜向下降至距标本 0.5 厘米处，用眼从目镜处观察， 同时转动粗调节器使镜筒慢慢升起，待看到物象时，再用细调节至清晰看见为止（初学 者要注意分辨聚光器上或载物片或镜头上面的灰尘，以免误认为待观察物） 。 6.高倍镜观察：在低倍镜下观察到的物体用推动器移至视野中心，然后移动转换器， 将高倍镜直接转到镜筒下方，然后由接目镜观察，调节光圈及聚光器获得适当的照明， 再转动细调节器可看见物象（不要转动粗调节器） 。并将要观察部分移至视野中央。 7.油镜使用 (1)用粗调节器将镜筒起约 2 厘米，将油镜转至镜筒下方，加液体蜡（香柏油）一滴 于载玻片所要观察的部位上。 (2)用粗调节器轻轻将镜筒转下，此时应从显微镜侧方注意观察，使油镜浸入油中， 并与标本片几乎相接触为止。 (3)调节聚光器、光圈、使得照明适宜，然后将粗调节器轻轻向后转动，使镜筒极其 缓慢地上升，至能见到模糊物象为止。 (4)转动细调节器，使物象完全清晰。如上升时油镜已离开油面，仍未见到物象，必 须再从侧面注视，将油镜降下，重复操作，直到看清物象为止。必须用粗调节器找到模 糊物象后再用细调节器调节至物象清楚，否则禁止用细调节器。 (5)油镜使用完毕后，将镜筒升起，取下载玻片，用一片擦镜纸擦镜头上的油，如用 香柏油则再用一片擦镜纸沾二甲笨（或笨）少许擦沾在镜头上的残存油渍。然后再用干 净的擦镜纸小心地将二甲笨擦干净，以免粘合透镜的树酯或麻仁油溶解而损坏镜头。 (6)显微镜使用完毕后，应将镜头转成“八”字式，或将最低倍数镜头转至镜筒下方， 再降下镜筒与聚光器，放平反光镜，拭去灰尘，归置箱中。 (7)显微镜应放在干燥阴凉的地方，不要放在强烈日光下照射。潮湿季节要经常擦镜 头，或在镜匣内放上干燥剂硅胶，以免长霉而损坏镜头。 四、思考题 1.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？ 2.试列表比较低倍镜、 高倍镜及油镜各方面的差异。 为什么在使用高倍镜及油镜时应 特别注意避免粗调节器的误操作？7实验二 细菌的简单染色及观察一、实验目的 1.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 2.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。 3.初步认识细菌的形态特征。 实验原理 二、实验原理 微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把菌悬液浮于水滴内，用光学显微镜观察 时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构， 所以，用不同光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作 用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，为了研究微生物的形态特 征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物实验中十分重要 的基本技术。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌 体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞 通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时， 其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。 经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色 的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复 红或刚果红等酸性染料染色。 实验器材 三、实验器材 1.菌种 白色葡萄球菌 （Staphylococcus albus） 斜面菌种， 青虫菌(Bacillus thuringiensis var.)染色标本片。 2.溶液或试剂 液体石蜡，无菌水，石炭酸复红染液。 3.仪器或其他用具 显微镜、酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲 苯），擦镜纸等。 四、实验操作 （一）细菌的简单染色 1.涂片 取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取 1~2 环）生理盐水（或蒸馏水） 于玻片中央、用接种环以无菌操作从白色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀 并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取 2~3 环直接涂于载玻 片上。 载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜过厚。 2.干燥 室温自然干燥或酒精灯干燥。83.固定 涂面朝上，通过火焰 2~3 次。此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固， 以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫 手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。 4.染色 将玻片平放于玻片搁架上， 滴加染液于涂片上 （染液刚好覆盖涂片薄膜为宜） 。 石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约 1min。 5.水洗 倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直 接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。 6.干燥 自然干燥，或用吸水纸吸干。 7.镜检 涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。最后清理显微镜。 （二）观察前的准备 1.显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约 3~4cm。镜检时 姿势要端正。取放显微镜时应一手握住镜臂，一手托住底座，使显微镜保持直立、平稳。 切忌用单手拎提；且不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少 眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录。 2.光源调节： 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度， 而使用 反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选 用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。 3.根据使用者的个人情况， 调节双筒显微镜的目镜， 双筒显微镜的目镜间距可以适当 调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不 同观察者。 4.聚光器数值孔径值的调节：调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略 低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径值，而没有具体的光圈数刻度。使用这种 显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看着视野，一边缩放光圈，调整光 圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每 转换一次物镜都应进行这种调节。 在聚光器的数值孔径值确定后，若需改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源 的亮度来实现，原则上不应再通过虹彩光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度 及照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可 根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。 （三）显微观察 在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都 是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到 油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。 1.低倍镜观察： 白色葡萄球菌染色片或青虫菌染色标本片置于载物台上， 用标本夹夹 住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降 10Χ 物镜，使其接近标本，用粗调 节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图象清晰。通过玻 片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录 所观察到的结果。9在任何时候使用粗调节器聚焦物像时，必需养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本， 然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏 镜头及玻片。 2.高倍镜观察： 低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后， 轻轻转动物镜 转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器 使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。 在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转 到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦 (parfocal)。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离 短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误 操作而损坏镜头或载玻片。 3.油镜观察：高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器 将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开 足光圈， 若所用聚光器的数值孔径值超过 1.0， 还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油， 保证其达到最大的效能。调节照明使视野亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至 视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上 升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意 不要因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻 片。 （四）显微镜用毕后的处理 1.上升镜筒，取下载玻片。 2.用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦 去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 3.用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 4.将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光 镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、思考题 1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察? 3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又 会怎么样呢？10实验三 细菌的革兰氏染色 革兰氏染色及观察 实验三 细菌的革兰氏染色及观察一、实验目的 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验原理 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 Chrstain Gram 氏创立的，而后一些学者在 此基础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构 和组成不同决定的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、 类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透 性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留 初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所 以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物 比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、实验器材 1.菌种：大肠杆菌(E. coli)和青虫菌(Bacillus thuringiensis var.)的斜面菌种。 2.染色剂：革兰氏染色液。 3.仪器或其他用具：同实验一 四、实验操作 1.制片 取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色； 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2.初染 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色 1~2min，水洗，吸干。 3.媒染 用碘液覆盖约 1min，水洗。 4.脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95％的乙醇脱 色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴 性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约 20~30s。 5.复染 用石炭酸复红染色液染约 2min，水洗。 6.镜检 干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰 氏阴性菌。117.注意事项 （１）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时， 不可过热， 以载玻片不烫手为宜。 （２）乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。 （３）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色 液被稀释而影响染色效果。 （４）选用幼龄的细菌。G+菌培养 12h～16h，E.coli 培养 24h。若菌龄太老，由于菌 体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 五、思考题 （1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么? （2） 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌， 请你鉴定其革兰氏染色反应。 你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果 正确性。 （3）你的染色结果是否正确?如果不正确，请说明原因。 （4）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什 么问题? （5）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革 兰氏阴性菌应分别是什么颜色？ （6）你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果?在什么情况下可以 采用？12实验四 实验四 放线菌形态观察一、实验目的 辨认放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态；学习放线菌的观察方法。 二、实验原理 放线菌是由不同长短的、纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分， 即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝）和生长在培养基表面的气生菌丝。有些种 类在气生菌丝的末端分化成各种孢子丝，呈螺旋形，波浪形或分枝状等；由孢子丝形成 成串的分生孢子，孢子常呈圆形、椭圆形或杆状等，气生菌丝和孢子的形状、颜色常作 为放线菌分类的重要依据。 将培养于高氏平板上的放线菌压印在载玻片上，最容易印在玻片上的是处于菌体生 长先端、且易于脱离的孢子，其次是孢子丝，在印片较深时，也有少量气生菌丝被印在 玻片上，将印片染色后镜检，可以清楚地看到未受扰乱的放线菌分生孢子的排列情况。 三、实验器材 1.供试菌种：紫色直丝链霉菌（Streptomyces violaceorectus） ，吸水链霉素――井 冈变种(Streptomyces hygroscopicus var. Jingganggensis Yen)，诺卡氏菌（Nocardia） ， 小单孢菌（Micromonosporaceae） 2.试剂：石碳酸复红，95%乙醇 3.器皿：显微镜，载玻片，盖玻片，接种铲等 四、实验操作 （一）观察放线菌菌丝体形态（涂片法） 1.取诺卡氏菌菌落少许，在无菌水中仔细分散。 2.风干，固定，用石碳酸复红作简单染色。 3.油镜下观察繁杂的分枝丝状体，绘图。 （二）观察放线菌孢子丝及分生孢子形态（印片法） 1.制片 取干净载玻片一块， 用小刀切取紫色直丝链霉菌培养体一块 （带培养基切下） ， 放在载玻片上，用另一载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻按压，然后将载玻片垂直拿起。 注意不要使培养体在玻片上滑动，否则会打乱孢子丝的自然形态。 2.固定 将印有放线菌的涂面朝上，通过酒精灯火焰 2～3 次加热固定。 3.染色 用石碳酸复红染色液染色 1min。 4.水洗 晾干（不要用吸水纸吸干） 。 5.镜检 先用低倍镜，后用高倍镜，最后用油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排列 情况。 （三）注意事项 培养放线菌中要注意，放线菌的生长速度较慢，培养期较长，在操作中应特别注意 无菌操作，严防杂菌污染。 附 插片培养法13放线菌的插片培养是将放线菌菌种制成孢子悬液后， 0.2mL 滴在平板培养基表面， 取 用玻璃刮铲涂布均匀，然后将灭过菌的盖玻片斜插入固体培养基中，置 28℃下培养。镜 检时，取出盖玻片放在载玻片上镜检。也可以将盖玻片上菌体固定染色后用油镜观察。 适合于观察放线菌完整的自然生长的形态。 五、思考题 1.印片法成败的关键在哪里？ 2.在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？14实验五 真菌形态观察（ 实验五 真菌形态观察（Ⅰ）一、实验目的 1.观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式 2.学习掌握区分酵母菌死、活细胞的染色方法 二、实验原理 酵母菌是多形的、 不运动的单细胞真核微生物,较细菌个体为大,通常为卵圆形、 圆形、 圆柱形或柠檬形。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母。酵 母菌的细胞核与细胞质已有明显的分化，原生质中常含有肝糖、脂肪粒等内含物，成年 细胞中央有很大的液泡。其繁殖方式也较为复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵 母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子，为生孢酵母，属于真菌子 囊菌亚门，有的不能形成子囊孢子，故列入半知菌亚门。 本实验通过用美蓝染色制成水浸片，来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝 是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞 进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝 色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老 细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用 美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间 等均有影响，应加注意。 酵母菌的子囊孢子生成与否及其形状，是酵母菌分类上的重要依据。一部分酵母菌 只有当它在最适条件下，才能观察到形成的子囊孢子，不同种属的酵母菌，形成子囊孢 子的条件不同。本实验用生长在克氏或麦氏培养基上的啤酒酵母为材料，进行子囊孢子 的观察。 三、实验器材 1. 供 试 菌 种 啤 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae) ， 热 带 假 丝 酵 母 (Candida tropicalis)，青霉（Penicillium） 。 2.试剂 0.1%吕氏碱性美蓝染液。 3.器皿 显微镜，载玻片，盖玻片，接种环等 四、实验操作 （一）观察啤酒酵母的菌体形态 1.在清洁载片上滴 0.1%美蓝(或碘液)一滴； 2.用接种环挑取少许啤酒酵母菌落与上液混合,盖上盖玻片(勿使产生气泡)； 3.用低\高倍镜观察形态特征(注意与细菌有何区别),出芽生殖情况； 4.区分酵母菌死、活细胞。 （二）观察青霉、热带假丝酵母的形态――载片培养法 1.取直径约 7cm 的圆形滤纸一张，铺于直径 9cm 的培养皿底部，放一 U 形玻璃棒于 滤纸上，其上平放一洁净的载玻片和盖玻片，盖好培养皿后灭菌。 （见图 4-1）152.取 8cm 固体培养基加热熔化，于酒精灯火焰旁注入另一无菌培养皿中，使凝成薄 层。用无菌的解剖刀把琼脂切成 1cm 见方小块，并将此琼脂块移至载玻片中央。 3.按无菌操作， 用接种环取孢子悬液或孢子接种在琼脂块四周， 将培养皿中已灭菌的 盖玻片覆盖于琼脂块上。往培养皿的滤纸上滴加 2～3mL 无菌水。 4.将培养皿放入温箱培养 2～3d，待菌丝体已经生长到琼脂块周围的载玻片及盖玻片 上，并产生孢子时镜检。 5.将载玻片取出置低倍镜和高倍镜下直接观察，也可取下盖玻片，翻转并滴加一滴 95%酒精，使之扩散到菌丝体上，在酒精全部挥发前再翻转，盖在加有一滴无菌水的载玻 片上观察，或者将载玻片上的琼脂块移去，加一滴 95%酒精润湿菌丝体，加一滴无菌水 和盖玻片镜检。图 4-1 载片培养示意图五、思考题 1.酵母菌的假菌丝是怎样形成的？与霉菌的真菌丝有何区别？ 2.如何区分营养细胞和释放出的子囊孢子？16实验六 真菌形态观察（ 实验六 真菌形态观察（Ⅱ）一、实验目的 学习霉菌的标本制备方法，观察根霉、犁头霉的接合孢子形态结构。 二、实验原理 霉菌是指常见的丝状真菌，它和放线菌一样，具有繁杂的分枝丝状体，但是它的菌 丝粗大，为多细胞的个体，菌丝中有隔膜或无隔膜，具有完整的多个细胞核。霉菌有无 性繁殖和有性繁殖。无性繁殖产生的孢子叫无性孢子，如分生孢子、孢囊孢子、游动孢 子或节孢子等。有性繁殖产生有性孢子，如接合孢子、卵孢子、子囊孢子、担孢子等。 一般凭形态特征即可鉴定到属。 霉菌菌落粗大作棉絮状，蓬勃地长满培养皿，或细密作绒毛状，表面和背面常具有 各种颜色，有的还分泌色素。 霉菌的有些结构在制片过程中易破坏，影响观察，可采用载片培养法。此法便于直 接在显微镜下观察，尤其适用于根霉的假根，曲霉的足细胞及分生孢子链等结构的着生 和生长情况的观察，并且还可在同一标本上观察到微生物发育的不同阶段的形态。 三、实验器材 1.供试菌种 根霉（Rhizopus） ，梨头霉(Absidia coerulea) 2.培养基 马铃薯培养基 3.器皿 无菌吸管，载玻片，盖玻片，U 形棒，解剖刀，滤纸，无菌水等 四、实验操作 （一）根霉（接合菌亚门）形态的观察 1.在清洁的载玻片上滴一滴无菌水， 用两个解剖针象夹筷子似的于培养皿或自皿盖上 取根霉菌丝少许置于水滴中。 2.仔细用解剖针分散开菌丝，盖上盖玻片。 3.镜检观察下列几个部分，并绘图： （1)菌丝有无隔膜。 （2)有无假根，假根的形状和颜色。 （3)孢子囊形状、颜色和着生情况。 （4)孢囊孢子形态。 （二）梨头霉接合孢子的培养和观察 1.将马铃薯培养基熔化后，倒入三个灭菌的培养皿中，使其冷却凝固。 2.将梨头霉（+）（－）两菌株孢子各接种于一个培养皿中。 、 3.在第三个培养皿内左右两边分别接上犁头霉（+）及（－）两菌，置 25℃培养 7～ 14d。 置于低倍镜下观察哪个培养皿中有接合孢子的产生及接合孢子和配子囊的形状，并绘图。 五、思考题 1.根霉水浸片取样时应该注意哪些问题？172.梨头霉接合孢子应该出现在培养皿的哪个位置，为什么？18实验七 实验七 土壤中各类微生物群体分离及形态观察Ⅰ. 培养基的制备一、实验目的 了解培养基的制备原理并掌握其制备过程 二、实验原理 培养基是按照微生物生长发育的需要,用不同组份的营养物质调制而成的营养基质. 把一定的培养基放入一定的器皿中,就提供了人工繁殖微生物的环境与场所.自然界中,微 生物种类繁多,由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验 和研究上的目的不同,所以培养基在组成原料也各有差异.但是,不同种类和不同组成的培 养基中,均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特 需的微量元素,此外,培养基还应具有适宜的酸碱度(pH)和一定缓冲能力及一定的氧化还 原电位和合适的渗透压. 培养基的类别 1．按照配制培养基的营养物质来源,可将培养基分为 d 然培养基、半合成培养基、合 成培养基三类。 （1）d 然培养基 凡是利用来自生物的组织、器官以及它们的抽提物或制品制成的 培养基。牛肉汁，马铃薯，麦芽汁，玉米粉等可用于制备此类培养基。 （2）半合成培养基 采用 d 然有机物质作为氮源和生长物质，再添加一部分已知成 分的化学药品作为碳源和无机盐的培养基，叫半合成培养基。在微生物学工作中，半 合成培养应用最广泛。 （3）合成培养基 完全采用已知成分的化学药品配制而成的培养基，称为合成培养 基。 此种培养基， 由于可以精确地掌握各成分的性质和数量， 常用于研究微生物形态、 生理特性以及微生物代谢产物的测定各方面。 2．按照培养基制成后的形式，可以分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。 这些培养基是根据不同试验或研究目的以及观察微生物不同特性而采用的。 （1）液体培养基 把各种材料的抽提物或化学药品按一定量溶于定量的水中，得液 体培养基。微生物在其中生长时，可以更均匀地接触和利用营养物质，有利于微生物的 生长和代谢产物的积累。实验室中，多用液体培养基观察微生物的生长特性，还用于研 究微生物的某些生理生化特性，如糖类发酵、吲哚产生、硝酸盐还原等。土壤微生物区 系分析时，也应用液体培养基进行稀释培养计数以反映各生理类群的数量关系。 （2）固体培养基 在液体培养基中，添加凝固剂，即制成固体培养基。常用琼脂、 明液、硅酸钠等，其中以琼脂最常用。琼脂是由海藻红藻中的石花菜等加工制成的藻胶。 主要成分是多糖，其化学性质较稳定，一般微生物不能分解，故用作凝固剂不致引起化 学成分的变化。就物理性质而言，琼脂在 95℃以上的热水中开始由凝胶融化为溶胶，冷 却到 45℃以下重新凝固。因此，用琼脂制成的固体培养基理化性质稳定，且在一般微生19物的培养温度范围内（25～37℃）不会融化而保持良好的固体形态。加 1.5%、2.0% （3）半固体培养基 在液体培养基中加入 0.2%～0.5%琼脂即成。此种培养基可用来 观察细菌的运动性，经穿刺培养后，可运动的细菌，沿穿刺线向外活动，在穿刺线周围 都有细菌生长发育，不能运动的细菌则只在穿刺线内生长。半固体培养基也常用于观察 细菌对糖类的发酵能力，因为在发酵过程中产生的气体，可以以气泡形态保持在培养基 内而易于识别。 3．按照培养基的用途，可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基 等。 （1）基础培养基 营养要求相似的微生物所需要的物质比较接近，除少数几种外， 其大多数物质是相同的。例如牛肉膏蛋白胨琼脂，其中含有一般腐生性细菌所需的营养 成分，是适用于细菌培养的基础培养基。 （2）加富培养基 也称增殖培养基，其中加入有利于某种微生物生长繁殖所需的营 养物质，使这类微生物增殖速度比其他微生物快，从而使这类微生物能在混有多种微生 物的情况下占优势地位。 （3）选择培养基 在一定的培养基中加入某些物质或除去某些营养以阻抑一般腐生 性微生物的生长,从而达到有利于某一个类群或某一种微生物的生长.藉此,我们可从微生 物混杂的自然环境中分离我们所需的微生物。 （4）鉴别培养基 用来检查微生物的某些代谢特性，一般在基础培养基中，将组成 成分进行补充或调整而制成的。如明胶培养基为检查细菌的明胶水解特性之用的鉴别培 养基。 三、实验器材 1.溶液或试剂 牛肉膏， 蛋白胨， 琼脂， 可溶性淀粉， 10% NaOH， 10% HCl， KNO3， NaCl， 2HPO4?3H2O， K MgSO4?7H2O， FeSO4?7H2O， 2PO4 ， KH CaSO4?2H2O， CaCO3， （NH4） 2SO4 2.仪器或其他用具 铝锅，电炉，试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，d 平，牛 角匙，pH 试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管，止水夹等。 四、实验操作 （一）配制培养基的过程 大体流程如下：原料称量、溶解调节 pH 值、过滤澄清、分装、塞棉塞、包扎及灭菌。 1.容器中先加入所需水量的一半或三分之二 （蒸馏水或自来水视培养基的需要而定） 。 然后按照培养基的配方，准确地称取各种原料，依次放入水中。待各种药品充分溶解后， 再补加水到所需要的量。 2.pH 测定与调节。根据需要，可用 pH 试纸或酸度计测定培养基的 pH 值，并用 10% 氢氧化钠或 10%盐酸调节至所需要的酸碱度。 制备固体培养基 先将琼脂称好洗净，煮沸已配好的液体培养基，在沸腾状态下，将琼脂加入，不断 搅拌，以免糊底烤焦，直到琼脂完全融化为止，并补足在加热过程中所蒸发掉的水份。 3.分装。固体培养基待琼脂完全融化后，用漏斗趁热分装在试管或三角瓶中。分装时 不要让培养基沾试管口或瓶口。 一般试管装量为其高度 1/5～1/4。 三角瓶装量不得超过其20高度的 1/3。 4.培养基分装好后应立即塞上棉塞，棉塞的大小和松紧都要适当。太松容易污染，太 紧则妨碍操作。棉塞要做得光滑、平整。一般要 3/5 长度在管（瓶）口内，用普通棉花， 切勿用脱脂棉。 5.棉塞部分用牛皮纸或塑料包扎好，送灭菌室进行加压蒸汽灭菌。 灭菌完毕， 最好取出二只试管在温箱中培养 1～2d， 检查无杂菌生长证明无菌， 方能使用。 制好的培养基要放在清洁的柜中保存备用。培养基保存时间过长会由于失水干燥，不再 适用。 （二）注意事项： 1.称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。 2.调 pH 时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 3.分装时不要让培养基沾试管口或瓶口。 （三）几种常用的培养基配方： 1. 肉 汁 蛋 白 胨 培 养 基 （ 培 养 腐 生 细 菌 ） 牛 肉 膏 3.0g ， 蛋 白 胨 10.0g，NaCl 5.0g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。调节 pH7.0~7.2，121℃/30min 灭菌。 2.淀粉铵培养基 可溶性淀粉 10.0 g， （NH4)2SO4 2.0g，K2HPO4 1.0g， MgSO4?7H2O1.0g，NaCl1.0g，CaCO33.0g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。 淀粉需要事先放入少量冷水中调成糊状，再放入培养基中，调匀。调节 pH7.2~7.4。 121 ℃/30min 灭菌。 3. 阿 须 贝 （ Ashby ） 无 氮 培 养 基 甘 露 醇 （ 或 蔗 糖 ） 10.0g ， KH2PO4 0.2g，NaCl0.2g，MgSO4?7H2O0.2g，CaSO4?2H2O0.1g，CaCO35.0g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。pH7.0 121℃ /30min。 4. 孟 加 拉 红 - 链 霉 菌 培 养 基 葡 萄 糖 10.0g ， 蛋 白 胨 5.0g ， KH2PO4 1.0g ， MgSO4?7H2O0.5g，孟加拉红 0.034g，琼脂 20.0g，蒸馏水 1000mL，121℃ /30min。链 霉素 0.03g，使用前临时加入灭菌的培养基中， 五、思考题 l.配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2.培养基配制完成后， 为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培 养基如何进行无菌检查?Ⅱ. 灭菌与消毒一、实验目的 1.了解干热灭菌的原理和应用范围。学习干热灭菌的操作技术。 2.了解高压蒸气灭菌的基本原理及应用范围。学习高压蒸气灭菌的操作方法。 二、实验原理 一般灭菌的方法有以下几种： （一） 、加热灭菌法 1.火焰灭菌：适用于接种环、镊子等金属小工具，试管口和瓶口也可以在火焰上短暂 的灼烧灭菌。玻璃刮铲，玻片，金属匙和小刀等最好先沾酒精，然后在酒精灯火焰上占21燃，等器具上的酒精烧完，也就完成了灭菌操作。这样做灭菌效果好，温度也不太高， 不至于烧坏器皿。 2.干热灭菌：利用干燥的热空气杀死全部细菌和芽孢，所需温度为 160～170℃，时 间为 2h。玻璃器具之灭菌常用此法。 3.煮涝灭菌。常用之器具可用此法灭菌，但往往不能将细菌芽孢完全杀死。一般医院 消毒多用此法。 4.蒸汽灭菌；液体物品及培养基等均用此法灭菌，常用的有柯赫蒸汽灭菌器，阿诺式 蒸汽灭菌器及加压灭菌器，因其所用温度、灭菌时间和灭菌方式不同，有以下几种灭菌 法。 （1）巴斯德灭菌法：此法能杀毒绝大部分的细菌营养体，一般不耐高温的培养基及 牛乳消毒多用此法。加热至 60℃，15min，或加热至 70～80℃经 5-10min。 （2）丁道尔灭菌法：此法是巴斯德灭菌法间歇施行，每次间隔一昼夜，陆续间断几 次，温度不能超过 80～90℃，也可以得到灭菌的培养基。 （3）间歇灭菌法：每 d 蒸煮一次（100℃） ，每次 30min，连续蒸煮 3d。在每两次蒸 煮之间将培养基放在 28～30℃培养，这样在第一次蒸煮时将培养基中一切微生物的营养 体杀死，只留下一部分芽孢没有被杀死。放在 28～30℃培养一 d，芽孢发芽成为营养体， 在第二次蒸煮时就可以杀死了。极少数在第一次培养中新形成的芽孢在第二单次培养中 转化为营养体，于第三次蒸煮时杀死。此法手续较麻烦，时间长，可用于缺乏加压设备 的地方，或温度不能超过 100℃的物品。 (4)高压灭菌法：在密闭的蒸汽锅中，利用加压提高水的沸点的原理以杀死全部生活 细胞和芽孢。高压灭菌是最迅速最完全之灭菌法，在高压和高温状态下不起变化之物品 可用此法灭菌。 （二） 、过滤除菌法 1.液体过滤除菌：某些不耐热的液体物质（如一些抗生素、蛋白质培养基、血清等） 可用过滤方法除菌。用特制的细菌过滤器进行，用此方法还可以将细菌和病毒或噬菌体 分开。广泛地应用于病毒学技术中。 2.空气过滤除菌：培养细菌用的试管及三角瓶都要塞棉塞，一方面可使空气流通，另 一方面可以隔绝空气中的细菌和真菌的孢子，使进入之空气无菌。 (三)、光线及射线灭菌 紫外线有杀菌的能力，常用于实验室空气灭菌。如 30 瓦的紫外线灯，距桌面 1m， 照射 1min 就可以灭菌，也有用特制之紫外线发生器杀灭工厂用水及发酵液中的杂菌。一 般使其在日光下晒一定时间，也可以杀死其附着的细菌。红外线和干热灭菌常结合进行， 能提高灭菌效率，γ 射线用于生产根瘤剂的草炭灭菌。X 射线及各种放射性物质的射线的 杀菌作用也很强，可用于食品工业和实验室。 (四)、化学药品灭菌 实验室用具和其他物体表面常用化学药剂灭菌或消毒。常用的表面灭菌或消毒剂有： 1.升汞水：0.1%升汞（HgCl2）水溶液加 0.25%盐酸。 2.AgNO3：0.1～1%硝酸银可用作皮肤消毒。 3.福尔马林： 3～5%的福尔马林， 可作喷射全室消毒。 生产上常用福尔马林熏蒸消毒，22每立方米空间用 2mL。用法是将它倒在碗中，加火熏蒸。 4.硫磺：用来熏蒸可达消毒目的。15g/m3。 5.酒精：70%酒精用于手、器具表面消毒。 6.石碳酸：2～5%石碳酸，作皮肤，桌面及吸过菌液的吸管消毒用。 7.漂白粉：2～5%漂白粉可用于洗刷接种室、恒温室的墙壁。 8.高锰酸钾：0.1%高锰酸钾溶液可作皮肤、水果、器皿的表面消毒剂。 9.新洁尔灭：原液为 5%，稀释成 0.25%用于皮肤、医疗器械、器皿及接种室空气等 消毒灭菌。 实验器材 三、实验器材 1.培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，淀粉铵培养基，阿须贝（Ashby）无氮培养基 2.仪器及其他用具 培养皿（6 套一包） ，试管，吸管，干热灭菌器，高压蒸气灭菌锅 四、实验操作： 实验操作： （一）干热灭菌法 不能在火焰上灼烧灭菌的器皿， 放在干热灭菌器中加热到 160～170℃维持 2h 进行灭 菌。大的物品或难于传热的物品，则需要更长的时间。棉花和纸在 180℃以上会烘焦，因 此有棉塞和有纸包扎的物品， 进行干热灭菌时， 不能超过 180℃。 干热灭菌只适用于玻璃， 金属和木质的空器皿，如果器皿中含有水分或培养基，都不能用此法进行灭菌。 1.洗涤清洁准备灭菌的玻璃器皿，要经过充分干燥（可置 45～60℃烘箱内烘干） 。 2.培养皿每 5～6 个用清洁纸包好或放在特制的铁盒内。 吸管先在上端距管口 2～3cm 处用铁丝疏松地塞上 2cm 长的一段棉花，然后用 4～5cm 宽的长纸条，成约为 46°的角 度逐支以螺旋式包扎起来，上剩余纸条折叠打结。包扎好的吸管可直接放在干热灭菌器 内灭菌，或放在铁盒内进行干热灭菌。带有橡皮管或橡皮塞的玻璃器皿不能用干热灭菌。 3.将包扎好的玻璃器皿放入灭菌器内， 注意不发放得过满， 妨碍气流流通。 并闭器门， 找开通气孔，接通电源加热，等灭菌器内温度达到 100～105℃时，关闭通气孔，继续加 热，待温度升到 160～170℃，控制温度不变，维持 2h，关闭电源。 4.灭菌后切不可立即打开器门，必须等器内温度逐渐下降到 60℃以下，才能打开器 门，在灭菌过程中，温度上升或下降都不能过急，否则玻璃器皿容易炸裂。 灭菌过的器皿，在使用前不应打开铁盒或包装纸，以免受空气中杂菌的污染。 （二）高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌法是在密闭的加压灭菌器内进行。加热使器内的水产生蒸汽，蒸汽不 能逸出，增加了灭菌器内的压力。水的沸点随着上升，因而可以获得比 100℃更高的蒸汽 温度。 ，30min，可以一次达到完全灭 一般培养基采用 1kg/cm3 的压力（即蒸汽温度 121℃） 菌的目的，但压力的大小，时间之长短，顺视培养基的性质，容积及导热性而延长或缩 短。有些培养基，如明胶，牛乳等，会因受热而变质，最好采用 0.7kg/ cm3 的压力（蒸汽 温度 115℃）15～20min。用这样的温度和时间灭菌，为保证效果，装培养基的器皿，配 培养基用的水等，应先经过 121℃，30min 灭菌。如果灭菌对象体积大，蒸汽穿透困难， 如砂、泥土等，应提高压力到 1.4 kg/cm3，蒸汽温度 126℃，灭菌 1h。 盛培养基的试管，三角瓶须塞好棉塞，包上牛皮纸成塑料。23高压灭菌器的主要构成部分为：灭菌锅，盖，压力表，温度计，出汽孔或安全活塞 等。 使用高压灭菌器的程序和注意事项： 1.使用前，在灭菌器中加入适量清水，水过多会延长沸腾时间，降低灭菌功效；水过 少，就有将灭菌器煮干而引起炸裂的危险。 2.放入准备灭菌的培养基及器具。 3.将灭菌器盖盖好，注意平稳端正，扭紧螺丝，保证紧密封闭。 4.打开出汽孔，点火（或供电）加热，将锅中水煮沸。 5.沸腾后，蒸汽会将锅蛤的冷空气由汽孔排出。排汽时间约 3～5min，关闭排汽孔。 注意：一定要将锅内冷空气全部排出，否则后来压力和温度的关系发生了变化，如压力 达到了 1 kg/cm3，而温度达不到 121℃，由于温度偏低影响灭菌效果。 6.继续加热使温度升至 121℃，压力达到 1 kg/cm3 时，控制热源，使其维持 30min， 停止加热。 7.温度降至 100℃，压力降至 0 时，锅内压力与外界一致时，打出出汽孔，使外界冷 空气徐徐进入锅内补充由于蒸汽继续冷却而造成的真空。注意，出汽孔如放开过早（即 锅内温度在 100℃以上时） ，压力骤然降低，会引起培养基突然猛烈沸腾，冲到管口或三 角瓶口，污染棉塞，这就容易引起培养基的污染。 8.当灭菌器皿温度降到 50℃左右时，开盖取出物品。做斜面试管培养基，取出后立 即摆成斜面。 思考题： 五、思考题： l.在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题，为什么? 2.为什么干热火菌比湿热灭菌所需要的温度要高，时间要长? 3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽?灭菌完毕后，为什么待压力 降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 4.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素? 5.灭菌在微生物实验操作中有何重要意义?Ⅲ. 微生物纯种的分离一、实验目的： 实验目的： 1．掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2．进一步熟练和掌握微生物的无菌操作接种技术。 二、实验原理 自然条件下，微生物常常成群成群落存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合 体。为了研究某种微生物的特性，或者要大量培养和使用某一种微生物，必须从这些混 杂的微生物群中获得线培养，即从自然界或混有杂菌的培养体中所需的微生物提纯出来。 这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。 在自然界中，土壤是微生物生活的大本营，这里生活的微生物的数量和种类都是极24其多样的。因此土壤是人类开发利用微生物资源的重要基地。土壤中微生物的数量主要 与肥力有关，肥沃的土壤中多，反之则少；好气性微生物占有绝对优势。本实验以菜园 土为材料分离土壤中的好气性细菌，并进行计数。 分离微生物时，一般是根据该微生物对营养、pH、氧气等要求不同，而供给它们适 宜的生活条件，或加入某种抵制剂造成只利于此菌生长，不利于其他菌生长的环境，从 而淘汰不需要的菌。分离微生物常用的方法有稀释平板法各划线分离法，根据不同的材 料，可以采用不同的方法，其最终目的是要发培养基上出现欲分离微生物的单个菌落， 必要时再对单菌落进一步分纯。在用稀释平板分离微生物时，还可以同时对所分离的微 生物进行计数。 三、实验器材 菜园土，90mL 无菌水 1 瓶，45mL 无菌水 1 瓶（内装玻璃若干） ，9mL 无菌水 6 支， 10mL 无菌吸管 1 支，1mL 无菌吸管 6 支，直径 9cm 无菌平板，d 平，酒精灯，接种环， 玻璃刮铲，记号笔，牛肉膏蛋白胨培养基（见培养基制备） 。淀粉铵琼脂培养基（见培养 基制备） ，阿须贝培养基（见培养基制备） 。 四、实验操作 稀释平板分离法 （一）准备工作 1.将桌面充分擦洗干净，或用药物消毒。 2.在水浴锅中融化所需数量的培养基（培养基种类，根据所要分离的微生物而定）然 后保持在 50℃左右待用。 3.将装有无菌水的三角瓶，试管及无菌培养皿等写上标记，如 10-1、10-2、10-3 等（培 养皿上还要写上姓名、日期）及所要分离的菌名并依次放好。 （二）制备稀释液 1.取出一定量的分析样品，例如土壤，可称取混合样本 5 克至 45mL 无菌水（内装玻 璃珠若干，以充分的打碎菌落）这便是稀释 10 倍，并写上标记为 10-1，充分振荡 10min。 2.用无菌吸管吸取 10-1 溶液 10mL（振荡后土壤悬液静默 15 秒）至 90mL 无菌水中， 反复吹吸调匀，便是稀释了 100 倍，是 10-2。 3.吸取 10-2 溶液 1mL 至 9mL 无菌水中，便是 10-3，如此稀释至 10-4、10-5、10-6、10-7， 可根据土壤含菌量的多少而决定稀释度大小。 4.如果要分离芽孢细菌。可将 10-1 稀释液使出一部分（10mL 左右）于一无菌试管中， 在水浴中加热 70～80℃15min（从达到 70℃时开始计算时间） 。进行巴斯德灭菌以后，再 作如上稀释液。 （三）分离的接种方法 1.混均法 （1） 选取适当的几个稀释度 （依含菌量多少而定） 的菌悬液， 由稀到浓。 分别用 1mL 无菌吸管吸取 1mL 至无菌培养皿中（每个稀释度有重复） 。 （2）将保温 50℃左右、处于融化状态的培养基，倒入接种了的培养皿中（每皿约 15mL）立即轻微摇动，混合菌液和培养基。静默凝固、凝固后送保温室培养（将培养皿 倒置）。252.涂抹法 （1）在无菌培养皿中，先倒入融化了的培养基，静置冷凝。 （2）为了去掉培养基表面的冷凝水，可将培养皿打开，在消毒了的 60℃烘箱中烘去 水分（约 20min）。 （3） 将适当的几个稀释度中的菌液由稀到浓， 分别用 1mL 或 0.1mL 灭菌吸管滴下 1 滴（0.05mL）或 0.1mL 稀释液至培养基上。每总体上稀释度均需重复。每换一个稀释度 可不必换吸管，但每次取稀释液时必须把稀释液摇匀。 （4）用无菌玻璃刮铲迅速抹均培养基表面。也是从稀到浓。涂抹后的培养皿在桌上 放 1h，而后送保温室培养（培养皿倒置）。 3．划线法 （1）将融化了的培养基倒入无菌培养皿中，每皿 15～20mL 冷凝成平面，记上标记。 （2）用灭菌接种环取分离的悬液一环，在培养基上轻轻划线，注意不要用接种环将 平板表面划破。划线的方法很多，如图，任选一种。 （3）送保温室培养（倒置）。（四）培养和纯化 1.上述培养皿通常置于 28～30℃温箱中培养（根据不同培养目的）。也有在低温或 高温下培养的。或在嫌气罐中培养嫌气细菌。 2.菌落长出后（注意各种微生物培养时间长短不同。）观察菌落，并镜检菌体，一般 一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是为纯培养（如结果混杂，未得纯培养，可 进行再次分离培养，直到纯化为止）。 3.将纯培养移到斜面培养基上，必须用无菌接环沾取纯菌落少许，在斜面上划线（直 线或波浪曲线均可）。置保温室或恒温室中培养，长出菌落后即可供研究观察用的纯菌。 试管应贴上标签，注明菌号及接种日期。 （五）注意事项 1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。262.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。 五、思考题： 思考题： 1.为什么要把培养皿倒置培养？ 2.用各种方法接种时，怎样才能更好地保证菌种不被污染？Ⅳ.各类微生物群体形态的观察一、实验目的 观察已知菌的菌落的形态、大小、色泽、透明度、致密度和边缘等特征，识别细菌、 酵母菌、放线菌和霉菌四大类微生物的菌落特征。 根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。 二、实验器材 大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粘红酵母(Rhodotorula gracitis)、热带假丝 酵母(Candida tropicalis)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus，又称“5406”抗生菌)、 灰色链霉菌(Streptomyces griseus )、黑曲霉(Aspergillus niger )、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、球孢白伍菌(Beauveria bassiana)等实验室常用斜面菌种。 牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基、高氏 1 号培养基、无菌水。 接种环、接种针、酒精灯、无菌培养皿多套、电热恒温箱。 三、实验操作 (一)制备已知菌的单菌落 1．制备平板 将已融化的无菌培养基待冷却至 50℃左右，分别制备牛肉膏蛋白胨培 养基平板、马铃薯蔗糖培养基平板和高氏 1 号培养基平板各一皿。 2．制备菌悬液或孢子悬液 在培养好的斜面菌种管内加入 5mL 无菌水，制成菌悬 液后备用。 3．制备单菌落 通过平板划线法获得细菌、酵母菌和放线菌的单菌落。用三点接种 法获得霉菌的单菌落。细菌于 37℃恒温培养 24～48h，酵母菌于 28℃培养 2～3d，霉菌 和放线菌置 28℃培养 5～7d，待长成菌落后，仔细观察四大类微生物菌落的形态特征， 并将观察结果记录于表中。 (二)观察未知菌落 将培养好的未知斜面，逐个编号，根据菌落识别要点区分未知菌落类群，并将判断 结果填入实验报告的相关表格中。 (三)直接观察菌落 直接用实验三中的“土壤稀释分离”获得的单菌落进行观察识别，并将结果填入表 中。 四、注意事项 观察菌落特点时，要选择分离得很开的单个较大菌落；已知菌落和未知菌落要编好 号，请勿随意移动开盖，以免搞混菌号。 五、思考题 1．各类微生物的个体特征与菌落特征之间有何相关性？ 2．如何根据菌落特征将细菌、放线菌、霉菌和酵母菌四大类群微生物区分开？27实验八 实验八 微生物大小的测定一、实验目的 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下 来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺（图 7-1 左）是一块圆形玻片，在玻片中央把 5mm 长度刻成 50 等分，或 把 10 mm 长度刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放 大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同目镜、物镜组合的放大倍 数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大 h 须先用镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长 度。目镜测微尺和 图 7-1 目镜测微尺和镜台测微尺镜台测微尺（图 7-1 右）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm 等分为 100 格，每格长 l0μm（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测 微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜 的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从 镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放 大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微 尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。图 7-2 目镜测微尺与镜台测微尺校准三、实验器材 实验器28啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌悬液。 显微镜,目镜测微尺,镜台测微尺,盖玻片,载玻片,滴管,双层瓶,擦镜纸。 四、实验操作 1.目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台 测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺 的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重 叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度(图 7-2)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的 刻度每格长 l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜测微尺每格长度（μm）= 两条重合线间镜台测微尺的格数×10 两条重合线间目镜测微尺的格数例如:目镜测微尺 5 小格正好与镜台测微尺 5 小格重叠，已知镜台测微尺每小格为 l0μm，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/5＝10μm. 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微 镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用， 当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 2.细胞大小的测定 (1) 取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。 (2) 移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍 镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点 后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测 量菌体的大小要在同一个标本片上测定 10～20 个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大 小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。 3.注意事项 (1)目镜测微尺和物镜测微尺的安装方向一定要正确,否则影响测定。 (2)对细菌等原核微生物大小的测定需要使用油镜。 五、思考题 1.为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜微尺进行 标定？ 2.若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台 上的菌体细胞的实际长度（或宽度）是否相同？为什么？29实验九 实验九 微生物数量的测定Ⅰ.显微镜直接计数法一、实验目的 1.明确血细胞计数板计数的原理。 2.掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 实验原理 二、实验原理 显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积 的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser 计菌器以及 Hawksley 计菌器等， 它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于 盖上盖玻片后，总容积为 0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有 0.02mm，因此 可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微 镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显 微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是 死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培 养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球 计数板为例进行显微镜直接计数。另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。 用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一 块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半， 每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为 计数室。血细胞计数板构造。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成 25 个中方格，而每个中方格又分成 16 个小方格；另一种是一个大方格分成 16 个中方格， 而每个中方格又分成 25 个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小 方格都是 400 个。每 1 个大方格边长为 lmm，则每 1 个大方格的面积为 lmm2，盖上盖玻 片后， 盖玻片与载玻片之间的高度为 0.lmm， 所以计数室的容积为 0.lmm3(万分之一毫升)。 计数时，通常数 5 个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上 25 或 16，就得出 1 个大方格中的总菌数，然后再换算成 lmL 菌液中的总菌数。 设 5 个中方格中的总菌数为 A，菌液稀释倍数为 B，如果是 25 个中方格的计数板， 则 1mL 菌液中的总菌数=A/5×25×104×B=50000A?B（个） ；同理，如果是 16 个中方格的计 4 数板，1mL 菌液中的总菌数=A/5×16×10 ×B=32000A?B（个）30细胞计数板正面、 图 8-1 细胞计数板正面、侧面观与正面方格放大示意图三、实验器材 实验器 菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。 实验操作 四、实验操作 l.菌悬液制备 以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 2.镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹 干后才能进行计数。 3.加样品 将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片， 再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿 酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室， 一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。 4.显微镜计数 加样后静止 5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用 低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。 调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一31边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。 在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要 求每小格内约有 5～10 个菌体为宜。每个计数室选 5 个中格(可选 4 个角和中央的一个中 格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽， 芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中 计得的平均数值来计算样品的含菌量。 5.清洗血细胞计数板 使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用 硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其 他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 6.注意事项 (1)取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。 (2)加样后菌体静止时方可计数,否则影响实验结果。 五、思考题 1.根据你的体会， 说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?应如何尽量减 少误差? 2.某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计 1～2 种可行的检测方法。Ⅱ. 平板菌落计数法一、实验目的 实验目的 学习平板菌落计数的基本原理和方法。 二、实验原理 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后， 其中的微生物充分分散成单个细胞， 取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见 的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和 取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个 细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的 2～3 或更多个细胞。因此平板菌落计 数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单 位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易 受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被 广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数 或污染程度的检测。 实验器 三、实验器材 大肠杆菌菌悬液。 牛肉膏蛋白陈培养基，lmL 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5mL 无菌水的试管，试管 架，恒温培养箱等。 实验操作 四、实验操作 l．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明稀释度 10-4、10-5、10-6 各 3 套。另取 632支盛有 4.5mL 无菌水的试管，依次标记 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2．稀释 用 lmL 无菌吸管吸取 lmL 已充分混匀的大肠杆菌菌县液(待测样品)，精确 地放 0.5mL 至 10-1 的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 -1 1 将 10 试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 lmL 吸管插入 10- 试 管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时 吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用 此吸管吸取 10-1 菌液 lmL，精确地放 0.5mL 至 10-2 试管中，此即为 100 倍稀释。其余依 次类推，整个过程如图 8-2 所示。 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则 稀释不精确，结果误差较大。 3.取样 用三支 1mL 无菌吸管分别吸取 10-4、10-5 和 10-6。的稀释菌悬液各 lmL，对 号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放 0.2mL。 不要用 lmL 吸管每次只靠吸管尖部吸 0.2mL 稀释菌液放入平皿中，这样容易加大同 一稀释度几个重复平板间的操作误差。图 8-2平板菌落计数操作步骤4.倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至 45℃左右的 牛肉膏蛋白胨培养基约 15mL/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均 匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于 已冷却至 45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起， 影响计数。 待培养基凝固后，将平板倒置于 37℃恒温培养箱中培养。 5.计数 培养 48h 后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并 按下列公式进行计算： 每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 一般选择每个平板上长有 30～200 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。 同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。实际工作中33同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-4、10-5、 10-6 三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的 第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在 50 个左右为好，否则要适当增加或减 少稀释度加以调整。 平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进 行。二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝 固后编号，并于 37℃左右的温箱中烘烤 30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无 菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒 将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上 20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后 倒置 37℃的恒温箱中培养 24～48h。 6.注意事项 涂布平板用的菌悬液量一般以 0.1mL 较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则 在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。 五、思考题 1.为什么融化后的培养基要冷却至 45℃左右才能倒平板? 2.要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?为什么? 3.试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。Ⅲ. 光电比浊计数法一、实验目的 1.了解光电比浊计数法的原理。 2.学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。 二、实验原理 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在 一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度 可以由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度 ―菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制 作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方 法。本实验采用血细胞计数板计数。 光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。但是，由 于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所 采用的光波长等因素的影响。因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用 相同的菌株和培养条件制作标准曲线。 光波的选择通常在 400～700nm 之间， 具体到某种 微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。另外，对于颜色太深 的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。 实验器 三、实验器材 酿酒酵母培养液34721 型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理 盐水等。 实验操作 四、实验操作 1.标准曲线制作 （1）编号 取无菌试管 7 支，分别用记号笔将试管编号为 1、2、3、4、5、6、7。 （2）调整菌液浓度 用血细胞计数板计数培养 24h 的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生 理盐水分别稀释调整为每毫升 1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106 含 菌数的细胞悬液。再分别装入已编好号的 1 至 7 号无菌试管中。 （3） OD 值 将 1 至 7 号不同浓度的菌悬液摇均匀后于 560nm 波长、 测 1cm 比色皿 中测定 OD 值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将 OD 值填入下表 管号 细 胞 106/mL 数 1 2 3 4 5 6 7 8光密度 （OD） 每管菌悬液在测定 OD 值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定。 （4）以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。 2.样品测定 将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用 560nm 波长、lcm 比色皿测定光密度。测定时用无菌生理盐水作空白对照。 3.根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。 4.注意事项 (1)各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不 准确。 (2)此法简便快捷，但只能检测含有大量细菌的悬浮液，得出相对的细菌数目，对颜 色太深的样品，不能用此法测定。 五、思考题 1.光电比浊计数的原理是什么?这种计数法有何优缺点? 2.光电比浊计数在生产实践中有何应用价值? 3.本实验为什么采用 560nm 波长测定酵母菌悬液的光密度?如果你在实验中需要测 定大肠杆菌生长的 OD 值，你将如何选择波长?35实验十 水中总大肠菌群的测定― 实验十 水中总大肠菌群的测定――多管发酵法一、实验目的 掌握多管发酵法测定水中总大肠菌群的技术。 二、实验原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌 能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三 个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数 （most probable number） ，简称 MPN 表示。 实验器材 三、实验器材 高压蒸气灭菌器，恒温培养箱，冰箱，生物显微镜，载玻片，酒精灯，镍铬丝接种 棒培养皿（直径 100mm） ，试管（5×150mm） ，吸管（1 mL、5 mL、10mL） ，烧杯（200、 500、2000mL） ，锥形瓶（500 mL 和 1000mL） ，采样瓶等。 实验操作 四、实验操作 1.培养基及染色剂的制备 （1）乳糖蛋白胨培养液 将 10g 蛋白胨、3g 牛肉膏、5g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶解 于 1000mL 蒸馏水中，调节溶液 pH 为 7.2~7.4，再加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL，充 分混匀，分装于试管中，于 121℃高压灭菌器中灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。 （2）三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法配制。除蒸 馏水外，各组分用量增加至三倍。 （3）品红亚硫酸钠培养基 贮备培养基的制备：于 2000mL 烧杯中，先将 20―30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中， 加热溶解，然后加入 3.5g 磷酸氢二钾及 10g 蛋白胨，混匀，使其溶解，再用蒸馏水补充 到 1000mL，调节溶液 pH 至 7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加 10g 乳糖，混匀， 定量分装于 250 或 500mL 锥形瓶内，置于高压灭菌器中，在 121℃灭菌 15min，贮存于 冷暗处备用。 平皿培养基的制备：将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容 量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的 5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌试管中；再按比例 称取无水亚硫酸钠，置于另一灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，再置于沸水浴中 煮沸 10min（灭菌） 。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液 内至深红色再退至淡红色为止 （不宜加多） 将此混合液全部加入已融化的贮备培养基内， 。 并充分混匀（防止产生气泡） 。立即将此培养基适量（约 15mL）倾入已灭菌的平皿内， 待冷却凝固后，置于冰箱内备用，但保存时间不宜超过两周。如培养基已由淡红色变成 深红色，则不能再用。 （4）伊红美蓝培养基 贮备培养基的制备：于 2000mL 烧杯中，先将 20~30g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加 热溶解。再加入 2g 磷酸二氢钾及 10g 蛋白胨，混合使之溶解，用蒸馏水补充至 1000mL，36调节溶液 pH 值至 7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入 10g 乳糖，混匀后定量分 装于 250 或 500mL 锥形瓶内，于 121℃高压灭菌 15min，贮于冷暗处备用。 平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形瓶内培养基的容量， 用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的 2%伊红水溶液（0.4g 伊红溶于 20mL 水中） 和一定量已灭菌的 0.5%美蓝水溶液（0.065g 美蓝溶于 13mL 水中） ，加入已融化的贮备培 养基内