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【求助】我的冰冻切片为什么总掉片？
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这个帖子发布于6年零139天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位战友：我对脊髓组织进行了冰冻切片，但发现组织脱片现象严重，不知原因为何？先是PBS灌注，然后PB为溶媒配的4%多聚甲醛灌注。在冰箱放一夜。第二天放在30%蔗糖溶液中过夜。然后冰冻切片。染色过程中出现标本掉片现象，不知原因何在？请教大家分析原因。上传试验图片，现在倒不是整体图片了，是局部出现问题。请高人告知原因何在？
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至于烤过的片子能不能放在室温下，要看你是不是要做免疫组化。 对于要做HE染色或尼氏染色的片子，放室温下是没有问题的。 但是，对于要做免疫组化的片子，在室温下放太久会破坏抗原性的。我们以前都是烤干后放-80度保存。即使是放4度的片子，一周以后基本上没有抗原性了。 总之，要做免疫组化的话，片子越新鲜越好。如果不能及时做，就烤干后放-80度保存吧，半年以内都可以做。
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我的也是啊，唉，10片中有6片脱掉。
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今天试了一下 先把切好的片子充分晾干就可以了
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片子首先要打胶的
然后一定要晾干
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我们30%的蔗糖是要过两夜才开始切片，一般还要梯度脱水才好的。 还有你们切片的厚度是？还有灌流液的浓度是？希望楼主说清楚。贴片法做的应该很薄，我也是切的脊髓，不过漂片法做的，厚度25到30um，从不掉片的。
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片子用多聚赖氨酸处理比较好，贴片尽量平整
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切完之后室温晾干再保存，组织取出来干冰冷冻就可以，-80保存，切片子的时候拿出来可以直接用的
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1.我们用进口的片子，上面带有静电，吸附好，VWR 的， . 国产片子是掉的厉害些2.我们用的OCT 包埋，ISH切18um，室温晾干后先50℃烘干15~30mins，再做实验，第一步是放4%PFA 20mins，
蛋白酶K处理后还要PFA再泡10mins3.动作一定要轻、要慢。上次北京协和的来我们这学ISH，我看了，他们动作太大了，虽然看起来没那么大。一定要
慢，多慢多轻都不过分。4. 我看你那图ISH 颜色不对啊，背景那么高。显色要避光，不要总是看；可以换甲醇直接脱色20mins，不用乙醇
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看一下我们做的，这个样子的才好看啊
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忘说了，你显色那个背景太高，做的过程中一定注意不要让片子上的组织干掉，拿出来擦的时候组织上留点水，一旦干了接触空气就会产生高背景
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hh hznu不知你的片子是什么染色？感觉你的片子虽然背景很好，但感觉形态不是太好。我不太会看片子，请高人继续指教。
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不是形态不好，是我们的取的材料时期不同
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我发的图中间那张是胚胎期16.5天（E16.5）的，没有把脊髓剥出来；第一张和第三张是出生后15天（p15）的。估计你那个是成体的spinal cord，白质比例比较大，灰质相对比较小。
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我那个图的形态没的说，很漂亮。你可以去看看神经生物学的几个top级得期刊，Nature，Cell，Neuron，The Journal of Neuroscience，Neuroscientists，就明白了
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我做的是原位杂交，免疫荧光也没问题，不过看你那个应该不是这两种。
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首先谢谢战友的回帖。我做的就是简单的HE染色。你的图片不太会看，我的认识是灰质在脊髓的中央，所以主要的细胞分布在中央。期盼高人给予解答。另外如果战友有相关文章的题目，如果方便，能否告知？我也想学习一下。谢谢。
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片子打胶没有？多聚赖氨酸或明胶可以用漂片染，然后贴片
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你描述的内容基本没什么问题，只是两个与脱片相关的步骤你没写，不知是没做还是做了没网上写。现把我们以前的做法简要列出，希望对你有帮助。 1、多聚赖氨酸包被载玻片（详细过程请站内搜索）2、灌注、固定、脱水、切片如你所述注意：铺片要平整，防止有气泡3、将铺好片的载玻片于孵育箱60摄氏度烤片2个小时或37摄氏度烤过夜（7-8h)烤片有助于防止脱片，新切好的片子最好烤干后再放冰箱保存 我们以前一直这样做的，基本不会出现脱片现象。
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感谢战友的解释。我的标本用的是多聚赖氨酸包被的载玻片。我的标本缺乏烤片过程，再做的时候我试一下。烤过的片子放在室温中可以吗？我们实验室没有人烤片。都是放在实验室中，自然放置。谢谢。还是按原先办法做了HE染色，请问视野中的黑点是什么物质，是染料中的吗？我在做的过程冲洗很轻，期盼高人解答。
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至于烤过的片子能不能放在室温下，要看你是不是要做免疫组化。 对于要做HE染色或尼氏染色的片子，放室温下是没有问题的。 但是，对于要做免疫组化的片子，在室温下放太久会破坏抗原性的。我们以前都是烤干后放-80度保存。即使是放4度的片子，一周以后基本上没有抗原性了。 总之，要做免疫组化的话，片子越新鲜越好。如果不能及时做，就烤干后放-80度保存吧，半年以内都可以做。
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hh_hznu 1.我们用进口的片子，上面带有静电，吸附好，VWR 的， . 国产片子是掉的厉害些2.我们用的OCT 包埋，ISH切18um，室温晾干后先50℃烘干15~30mins，再做实验，第一步是放4%PFA 20mins，
蛋白酶K处理后还要PFA再泡10mins3.动作一定要轻、要慢。上次北京协和的来我们这学ISH，我看了，他们动作太大了，虽然看起来没那么大。一定要
慢，多慢多轻都不过分。4. 我看你那图ISH 颜色不对啊，背景那么高。显色要避光，不要总是看；可以换甲醇直接脱色20mins，不用乙醇你好，请问VWR的片子多少钱？还有，为什么烘干后还要4%PFA处理？谢谢！
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夏雨儿 至于烤过的片子能不能放在室温下，要看你是不是要做免疫组化。对于要做HE染色或尼氏染色的片子，放室温下是没有问题的。但是，对于要做免疫组化的片子，在室温下放太久会破坏抗原性的。我们以前都是烤干后放-80度保存。即使是放4度的片子，一周以后基本上没有抗原性了。总之，要做免疫组化的话，片子越新鲜越好。如果不能及时做，就烤干后放-80度保存吧，半年以内都可以做。请问，烤干的片子放-80冰箱，会进去水汽的啊，玻片表层一层霜，如何保持干燥呢？
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my2009summer 你好，请问VWR的片子多少钱？还有，为什么烘干后还要4%PFA处理？谢谢！ 目前进口Superfrost Plus防脱片子主要是Thermo、Fisher、VWR，可以到丁香通搜索一下。
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【求助】关于冰冻切片做免疫组化的问题！
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各位大神们，我准备用鼠脑的冰冻切片做免疫组化，我在网上搜了很多关于冰冻切片的问题，说法不一，因此我有几个方面需要向大家求助：1.冰冻切片前的新鲜脑组织需要固定吗？用什么固定？固定时间？
2.脑组织一般切片厚度？
3.切好片后必须马上使用吗？如果不马上使用怎么保存？能放多久？
4.切好片后，若要使用，那么使用前需要固定吗？需要做啥处理吗？
5.切片使用前，是自然风干30min后就可以马上做免疫组化了吗？
6.我的免疫组化用的是SABC的方法，若切片使用的是冰冻切片，是否就省去了抗原修复的步骤，其他不变？
希望大家能帮忙解决一下这么个问题！感激不尽啦，，，，在线等~~~~~
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1、可以固定也可以不固定，不固定用包埋剂包埋好后放入液氮速冻（也可保存在液氮中任意长时间），然后转入冰冻切片机（放至切片温度）直接切片；固定的可以用常用的固定液（多聚甲醛、福尔马林等，固定24h以上），这个固定保存在常温就可以（任意长时间），切片之前拿出来用流水冲洗过夜（去除固定液），然后蔗糖梯度（20%和30%）脱水沉底即可，拿出后放入切片机用包埋剂包埋好后冻至需要的温度，再行切片。2、冰冻切片的脑组织切20-30μm左右，或许可以更薄（贴片的可以薄，漂片的要厚）。3、切好后放入-20度长期保存（贴片直接放，漂片需要加点甘油之类物质防冻），半年内应该没问题。4、不需要固定了，直接做免疫组化。5、是。6、液氮速冻的可以不修复，固定过的可能要修复。
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做冰冻切片前动物（鼠）一般是经过灌注（先盐水后甲醛，从心尖注射）处理后取组织，20%蔗糖沉底后30蔗糖沉底。OCT包埋后-20度保存也可以包埋后直接切片，厚度5-30μ，一般用8-10μ。切好的片子固定液固定10分钟左右，清洗晾干后-20度以下温度保存。实验前取出PBS浸泡复温。冰冻片可以先不修复，结果不好再适当进行修复，酶消化或微波热修复都可以，视预实验结果而定
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Justin001 做冰冻切片前动物（鼠）一般是经过灌注（先盐水后甲醛，从心尖注射）处理后取组织，20%蔗糖沉底后30蔗糖沉底。OCT包埋后-20度保存也可以包埋后直接切片，厚度5-30μ，一般用8-10μ。切好的片子固定液固定10分钟左右，清洗晾干后-20度以下温度保存。实验前取出PBS浸泡复温。冰冻片可以先不修复，结果不好再适当进行修复，酶消化或微波热修复都可以，视预实验结果而定可以不用OCT包埋而直接接下去做吗？
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lirong1 Justin001 做冰冻切片前动物（鼠）一般是经过灌注（先盐水后甲醛，从心尖注射）处理后取组织，20%蔗糖沉底后30蔗糖沉底。OCT包埋后-20度保存也可以包埋后直接切片，厚度5-30μ，一般用8-10μ。切好的片子固定液固定10分钟左右，清洗晾干后-20度以下温度保存。实验前取出PBS浸泡复温。冰冻片可以先不修复，结果不好再适当进行修不包埋怎么切片？
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关于丁香园(请问）我的冰冻切片为何容易脱片(冰冻切片,丙酮,多聚甲醛,小鼠) - 免疫实验 - 生物秀
标题: (请问）我的冰冻切片为何容易脱片(冰冻切片,丙酮,多聚甲醛,小鼠)
摘要: [(请问）我的冰冻切片为何容易脱片(冰冻切片,丙酮,多聚甲醛,小鼠)] 小鼠脑4%多聚甲醛灌注和后固定，30%蔗糖下沉，冰冻切片(16 微米）置于中山公司的多聚赖氨酸处理后玻片，冷丙酮浸泡10分钟进行免疫组化，脱片严重，请赐教。另外，切片先晾干后放入丙酮，还是相反？谢谢！ 关键词:[冰冻切片 丙酮 小鼠 多聚甲醛 免疫组化 切片 蔗糖]……
小鼠脑4%多聚甲醛灌注和后固定，30%蔗糖下沉，冰冻切片(16 微米）置于中山公司的处理后玻片，冷丙酮浸泡10分钟进行免疫组化，脱片严重，请赐教。另外，切片先晾干后放入丙酮，还是相反？谢谢！
回复你的切片太厚了,贴片厚度应该控制在8微米内
希望对你有所帮助回复这样处理应该先晾干，固定组织冰冻切片容易掉片，如果新鲜组织，液氮冰冻，切片后固定，不容易掉片。现在较多用30%蔗糖我以前用holt氏阿拉伯胶蔗糖液蔗糖30g阿拉伯胶1g100ml做酶组织化学，效果不错。回复原因可能是你的材料预先灌注和后固定，这样其粘附性大大降低。切片厚度不是主要原因，但材料如此处理后，切片厚度应当减小，脑片因组织原因，有一定困难。如果你的材料必须如此处理，我建议你再切厚点，比如30微米，做漂片法，最后再粘片。因为脑材料可以取大点。我们院这样做的人挺多，到我这切过片子，一直这样做。回复处理后的组织用16个微米的贴片,组织掉的可能性是非常大的,即使没有掉,但是当你在显微镜下看的时候回看见全是皱褶,片子染的再好也没有办法照相,如果想用快染的话,就要把组织切片的厚度降下来,才能避免掉片,还有就象sprac朋友说的那样,先用液氮速冻,切片后固定,这个方法是很有效的.其实在我遇到的科研单位,用冰冻快染的少,而用30到40微米的切片的漂染的很多,经典的染色技术,条件很成熟,没有恒冷切片机都可以做到的,缺点就是费抗体,时间长.但是如果你要做的指标表达的很少的话,我建议你用漂染,如果多的话,就用快染,把切片的厚度降一点.当然,选择的方法因条件而异,你就选择适合你的方法吧.实验顺利. 以后再交流回复最好使用0.5%明胶+0.05%硫酸络钾两次浸泡(每24h一次并烤干)后使用回复小鼠脑4%多聚甲醛灌注和后固定，30%蔗糖下沉，冰冻切片(16 微米）置于中山公司的处理后玻片，冷丙酮浸泡10分钟进行免疫组化，脱片严重，请赐教。另外，切片先晾干后放入丙酮，还是相反？谢谢！ 请教俺有点不懂，你用甲醛固定了，为什么还要用冷丙酮处理？有什么好处么？甲醛和丙酮都是固定剂，很多标明只能用丙酮固定（santa cruz公司的好多都是这样），而不能用醛类固定。我现在的就是来自santa cruz公司，说不能用甲醛固定。上面有兄弟说可以先用液氮冷冻，切片后用冷丙酮固定。但是，我们师兄试过，说这样子固定，如果用漂片法染，组织就全碎掉了，然完后没有完整的片子。没有试过用贴片法染。回复感觉脱片原因应该不是切片厚度原因，我现在所作就是18微米，效果不错的。我觉得要避免脱片大概要从以下几个方面做起：1. 贴片时注意避免褶皱和气泡。若切片出来是呈凹状，用小毛笔调成凸状，吸至载玻片时不易产生褶皱和气泡。2. 切好后立刻冷风扇吹干，30分钟左右。3.不能立即组化染色时-20度密封保存。回复建议你切片后37度烤30min再行免疫组化。另4%多聚甲醛固定后无须在冷丙酮固定切片。我认为切片的厚度不是你掉片的原因，脑组织切片16um不是太厚。回复用铬钒明胶吧，便宜又实用。
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