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核酸分离与纯化的原则与技术路线
核酸分离与纯化的原则与技术路线
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细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白(nucleoprotein)。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(deoxyribonucleoprotein，DNP)，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状，单链环状，双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3。0×109个碱基对(base pair，bp)组成，与5243bp的猿猴病毒(simian virus 40，SV40)相比，其长度约为后者的5。7×105倍。相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类，大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。
材料与方法的选择
(一)材料与方法的选择
临床常见的标本有血液，尿液，唾液，组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量，完整性，纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。
(二)选择的原则
核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量，待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则:一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。
(三)核酸完整性的保持
为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理，化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。
其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏；DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+，Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA，柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
技术路线的设计
(一)核酸的释放
正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞，释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化
细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的，符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异，物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。
(三)核酸质量与提取步骤的关系
一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。
(四)核酸的浓缩，沉淀与洗涤
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠，醋酸钾，醋酸铵，氯化钠，氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇，异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。
相关实验方法
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DXY All Rights Reserved.磁珠法核酸提取过程中的6种常见误区
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|系统分类:|关键词:磁珠法核酸提取，核酸提取，磁珠法
文章来源：洛阳吉恩特生物科技有限公司使用生物磁珠提取核酸，在国内还属于较为新颖的核酸提取方式，相比于传统的氯仿异戊醇抽提法和离心柱试剂盒法，这种方法还有很多人不慎了解，在使用磁珠法提纯核酸的过程中，也存在着一些误区。误区一：磁珠使用的越多，提取效果越好有很多老师喜欢在提取效果不佳的时候，增加磁珠的用量，认为磁珠多加一点，就能吸上更多的核酸，不得不说这种想法是不可取的。磁珠的主要特点是既可以分散于液体中，也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离，任何试剂体系，磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的，超过一定的比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中，而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质，对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候，过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分，导致整个试剂盒效率低下。有很多时候，在提取效果不佳的时候，减少磁珠使用量，反而是提升提取效果的最优途径。通常情况下，磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的，因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多，但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好，是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。以GNT-02系列磁珠为例，在提取常量样本（植物组织，全血等）时，通常用量为10ul/次；在提取微量样本（如血清游离DNA，口腔拭子等）时，磁珠用量为15~20ul/次。如需超过这个使用量，需要和技术工程师进行沟通。误区二：试剂使用的越多，提取效果越好裂解效果不好？多加点裂解液。洗涤效果不好？多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。但是对于磁珠法而言，每增加一部分液体体积，就减少了更多的磁珠碰撞几率，而降低磁珠碰撞几率，会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候，虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的，所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。对于GNT-B02全血基因组DNA试剂盒而言，一般裂解液使用量不应超过400ul/次，洗涤液使用量不应超过500ul/次。如果确实需要放大体系，磁珠和样本用量也应该相应增加，这种放大不一定是等比例的。误区三：洗涤次数越多，提取效果越好提取得到的核酸杂质过多时，使用者会考虑多进行几次洗涤，以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸，但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸，且增加了核酸断裂水解的可能性，所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。GNT系列的试剂盒，单一纯化类试剂盒的洗涤次数为2次，植物、动物类试剂盒的洗涤次数为3次，血液类试剂盒洗涤次数为3~4次。误区四：样本取用的越多，提取效果越好在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下，往往核酸提取效果不好，很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。但简单地增加样本取样量，有时会引入过多的杂质，超出裂解液裂解能力，也会使提取效率降低，所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低，建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性，使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。误区五：某一种磁珠好，就应该在所有试验中效果都好磁珠的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导致磁珠特性千差万别。所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂，配方也并不完全相同，同样应用于核酸提取的磁珠，性质也并非完全一致。有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪；有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况，除了固定的试剂盒配合，多数情况下，磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。误区六：和某种试剂盒对比效果不好，就是磁珠不好很多客户在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下，简单地等量替换磁珠，用于比较磁珠效果。这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论，但实际上，由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的，往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。吉恩特生物除了生产磁珠和试剂盒外，也提供磁珠提取技术服务，包括帮助客户调整磁珠的用量和试剂的细节，让客户能够找到更适用的体系获得最佳的实验效果。
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细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成(nucleoprotein)。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖(deoxyribonucleoprotein，DNP)，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状，单链环状，双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3。0×109个碱基对(base
pair，bp)组成，与5243bp的猿猴病毒(simian virus 40，SV40)相比，其长度约为后者的5。7×105倍。相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类，大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。
材料与方法的选择
(一)材料与方法的选择
临床常见的标本有血液，尿液，唾液，组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量，完整性，纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。
(二)选择的原则
核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量，待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则:一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。
(三)核酸完整性的保持
为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理，化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。
其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏；DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+，Ca2+等二价金属离子，若使用，柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
技术路线的设计
(一)核酸的释放
正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞，释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化
细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的，符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异，物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。
(三)核酸质量与提取步骤的关系
一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。
(四)核酸的浓缩，沉淀与洗涤
随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠，醋酸钾，醋酸铵，氯化钠，氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇，异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。
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摘要 : 本文介绍了从组织或细胞中分离纯化RNA的简单实验步骤，并列举了一些提取RNA过程中常见失败的原因供大家参考。
本文介绍了从组织或细胞中RNA的简单实验步骤，并列举了一些提取RNA过程中常见失败的原因供大家参考。
实验步骤：
1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。
2. 将匀浆室温放置5 min。
3. 加入200 &l 氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3min。
4. 12000 rpm，4℃ 离心15 min。
5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml中(取400&l )，加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。(此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。)
6. 12000 rpm， 4℃ 离心15 min 。
7. 小心移去上清液，防止沉淀丢失。
8. 用70%乙醇(DEPC处理的水)洗涤1次，加入700 &l乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。(此时RNA是不溶解的)
9. 8000 rpm，室温离心10min。
10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。
11. 真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。
12. 沉淀用30 &l DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68 ℃处理10 min。
13. RNA检测
(1)测定样品在260 nm和280 nm的吸光值按1OD=40 &g/ ml RNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0 。
(2)进行甲醛变性电泳,确定RNA的完整性和污染情况。
常见失败原因：
A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.最后得到的RNA沉淀未完全溶解
2、A260/A280&1.65
A.检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而
是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280
值会较高。
B.样品匀浆时加的试剂量太少。
C.匀浆后样品未在室温放置5分钟。
D.水相中混有有机相。
E.最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
3、RNA降解
A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.样品或提取的RNA沉淀保存于-5--20℃，
未在-60--70℃保存。
C.在胰酶处理时被破坏。
D.溶液或离心管未经RNase去除处理。
作者：sovia 点击：次
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核酸分离与纯化过程中材料与方法
(一)材料与方法的选择临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等;核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求;至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑;在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。(二)选择的原则核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求;二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。(三)核酸完整性的保持为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理、化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害;另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏; DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+、Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA、柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
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