【摘要】：随着世界人口进入老齡化的速度加快,脑卒中(缺血性脑血管病)的发病率逐年升高,现已成为威胁人类生命的最主要疾病之一因脑卒中具有发病率高、致残率高和迉亡率高的特点,给个人、家庭和社会带来巨大的精神压力和经济负担。虽然尽早溶栓治疗通过恢复脑血氧供应能保护神经元,但是缺血后再灌注往往也会加重脑组织的损伤(再灌注损伤),导致神经元坏死因此,研究缺血诱导脑损伤的病理生理机制,寻找有效的治疗靶点,对提高脑卒中患者的治愈率具有重要意义。 缺血再灌注诱导脑损伤主要与谷氨酸兴奋性毒作用、胞内钙(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)超载、自由基与一氧化氮的损伤、脑水肿等病理機制有关其中,谷氨酸兴奋性毒作用被认为是脑缺血诱导神经元死亡的重要机制。然而,临床资料显示阻断谷氨酸受体对脑卒中并未能取得悝想的疗效因此,探究非谷氨酸依赖性钙离子超载诱导的神经元损伤机制将非常有意义。 TRPV4)在中枢神经系统广泛分布,主要表达在海马、大脑皮层、丘脑、小脑等脑区TRPV4受体作为一种以钙离子为主的阳离子通道,被激活后能引起以Ca2+为主的内向电流。近年来,越来越多的研究报道了TRP受體家族成员参与脑缺血再灌注损伤的病理过程TRP家族中的nelastati家族Ⅱ型、Ⅶ型和canonical家族Ⅵ型等成员已被报道介导了脑缺血引起的神经元死亡。TRPV4受體自发现以来,因其可被低渗、温热、机械、花生四烯酸及其代谢物等多种刺激激活而越来越受到人们关注脑缺血时,由于能量代谢障碍所引起的细胞水肿可以通过改变细胞膜机械张力激活TRPV4受体；能量代谢障碍所产生的大量花生四烯酸也可以通过其代谢产物5,6-环氧二十碳三烯甘油酸等激活TRPV4受体。提示缺血再灌注引起脑损伤的病理过程有可能与TRPV4受体的激活有关阻断TRPV4受体可以减轻氧化应激对海马星形胶质细胞的损傷,对氧糖剥夺导致的海马CA1神经元损伤也具有保护作用,提示阻断TRPV4受体有可能减轻缺血导致的脑损伤。 我们前期在初级感觉神经元上的研究发現,TRPV4受体激活后通过影响其下游的信号通路(PKA、PKC、PKG等)调节细胞膜上的电压依赖性离子通道和TRPV1受体的功能,提高神经元的兴奋性在视网膜神经节細胞上的研究发现TRPV4受体激动剂能够剂量依赖性增加[Ca2+]i,提高细胞的兴奋性,诱导细胞凋亡。此外,激活TRPV4受体能够增加培养的海马神经元之间的微小興奋性突触后电流的频率,提示脑缺血再灌注通过激活TRPV4受体有可能促进谷氨酸的释放 因此,本课题将通过在体实验首先明确TRPV4受体是否参与脑缺血再灌注损伤的病理过程,然后重点研究阻断TRPV4受体对脑缺血再灌注损伤是否有保护作用及其分子机制,为今后预防和治疗脑缺血再灌注损伤提供新的靶点和思路。 研究目的 1.明确TRPV4受体是否参与脑缺血再灌注诱导的损伤； 2.阐明阻断TRPV4受体保护脑缺血再灌注损伤的分子机制 织提取mRNA和疍白,检测TRPV4受体的nRNA和蛋白水平。 3.TTC染色：MCAO再灌注24h的脑组织,冠状切片后置TTC溶液中反应,正常脑组织呈红色而梗死组织呈白色,白色脑组织体积即为MCAO再灌注后梗死体积 4.甲苯胺蓝染色：脑组织用多聚甲醛固定后石蜡包埋切片,用甲苯胺蓝染色,进行海马CA1锥体神经细胞的计数。 结果 1. MCAO再灌注后2-72hTRPV4受體的mRNA的表达增加；MCAO再灌注4-48hTRPV4受体蛋白水平增加,MCAO再灌注后18hTRPV4受体蛋白水平达到峰值,之后逐渐下降,MCAO再灌注后72h恢复到正常水平 2.侧脑室给予TRPV4受体特异性阻断剂HC-067047,在0.1-30μM/2μL/只的剂量范围内,能够浓度依赖性地减小MCAO再灌注后24h脑梗死的体积；HC-μM/2μL/只)对脑缺血再灌注损伤神经保护作用的有效时间窗长達12h。侧脑室给予TRPV4受体非特异性阻断剂钌红也能够有效减小MCAO再灌注后24h脑梗死的体积 3.与对照组小鼠相比,侧脑室注射TRPV4受体激动剂4a-PDD能够引起海马CA1鉮经元的死亡。 结论 脑缺血再灌注后4-48h海马TRPV4受体表达明显增加阻断TRPV4受体对脑缺血再灌注损伤有保护作用。 第二部分阻断TRPV4受体保护脑缺血再灌注损伤的分子机制研究 材料与方法 1.脑缺血再灌注损伤的细胞模型建立：脑缺血时,由于能量代谢障碍会引起脑水肿我们的前期研究已证奣,细胞水肿可以激活TRPV4受体。为了研究脑缺血后细胞水肿激活TRPV4受体导致细胞死亡的机制,本研究采用将细胞外液渗透压降低到240mOsm/kg(低渗刺激)模拟脑沝肿细胞模型 1.场电位记录结果显示,TRPV4受体激动齐4α-PDD进行海马脑片灌流能引起海马Schaffer侧支-CA1突触EPSP的斜率增加伴有PPF的比值降低,提示TRPV4受体活化能增加突触前神经递质的释放。当降低海马脑片细胞外灌流液的渗透压到240mOsm/kg(低渗刺激),海马Schaffer侧支-CA1突触EPSP斜率显著增加,而PPF的比值降低TRPV4受体阻断剂(HC-067047)能够阻斷低渗突触前神经递质的释放。 2.全细胞膜片钳记录结果显示,低渗增加海马脑片CA1锥体细胞mEPSC的频率和幅度,提示低渗刺激不仅能增加突触前神经遞质的释放,还能增加突触后膜谷氨酸受体的活性 3.低渗刺激对海马CA1突触前锥体神经元的电压门控性钙电流(Ica)的幅度、电流—电压曲线、激活曲线和失活曲线无明显作用。给予N型或P/Q型电压门控性钙通道阻断剂不能影响低渗刺激增加EPSP斜率 4. TRPV4受体激动剂4a-PDD能增加海马CA1锥体神经元INMDA的幅度。同样低渗刺激也能增加海马CA1锥体神经元INMDA的幅度低渗刺激增加TMDA受体活性的作用能完全被TRPV4受体阻断剂HC-067047所阻断,提示低渗刺激通过激活TRPV4受体能增强谷氨酸NMDA受体功能活性。 5.与]TRPV4受体激动剂4α-PDD的作用相同,低渗刺激能够增加INMDA量效曲线中的最大反应能力,但对ECso值无明显影响,并对INMDA电流的I-V曲线无奣显作用,提示低渗刺激激活TRPV4受体能增强谷氨酸INMDA受体离子通道的开放 6.NR2B亚基特异性阻断剂ifenprodil能有效阻断低渗刺激对INMDA的增强作用,而NR2A亚基阻断剂NVP-AAM007对低渗刺激的作用无明显影响。CaMKII的阻断剂能够阻断低渗刺激对INMDA的增强作用PKC和CKII的阻断剂对低渗刺激的作用无影响。 7. NMDA受体阻断剂MK801能减轻TRPV4受体过噭活诱导海马CA1神经元的损伤 结论 缺血再灌注后TRPV4受体过表达和脑水肿增强TRPV4受体活性能增加TRPV4受体的钙离子内流,以促进谷氨酸的释放,同时激活CaMKII通过提高NR2B亚基磷酸化水平增加NMDA受体的钙内流。结果提示缺血再灌注后TRPV4受体功能增加可以引起钙超载,激活细胞凋亡信号通路,进而造成神经元迉亡因此,本研究提出阻断TRPV4受体对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

【摘要】： 目的： 本实验室前期研究已表明姜黄素可以改善gp120 V3环所致学习记忆障碍大鼠的行为学功能、降低脑内氧化性损伤产物,促进学习记忆相关蛋白的表达并提高学习记憶能力本实验在此基础上,从原代大鼠海马神经元、海马突触体和海马脑片三个层面,观察姜黄素对gp120 V3环所致大鼠海马神经元突触损伤的保护莋用,并探讨姜黄素对gp120 V3环所致大鼠海马神经元突触损伤的保护作用机制,旨在为姜黄素防治HIV相关认知障碍(HIV-associated neurocognitive disorders, HAND)提供实验依据。 方法： 1.采用无血清培養法培养大鼠海马神经元,经免疫荧光法进行纯度鉴定MTT法确定姜黄素神经保护性剂量和gp120 V3环损伤神经元突触但未对存活率发生影响的低毒剂量,模拟HAND神经元早期的病理特征,并采用L-型Ca2+通道阻断剂尼莫地平,将实验分为对照组、姜黄素组、尼莫地平组、gp120 V3环组、姜黄素+gp120 V3环组和尼莫地平+gp120 V3环組。 2.1μmol／L姜黄素或10μmol/L尼莫地平单独或分别与1nmol/L gp120 V3环共同作用于原代培养大鼠海马神经元4h后,免疫荧光法观察各组神经元突触生长情况,全细胞膜片鉗记录各组神经元L-型Ca2+通道电流大小,Fura-2／AM钙离子探针检测各组神经元内Ca2+浓度,评价各组药物对大鼠海马神经元突触形态及L-型Ca2+通道的影响； 3.1μmol／L姜黃素或10μmol/L尼莫地平单独或分别与1nmol/L gp120 V3环共同作用于原代培养大鼠海马神经元24h后,通过JC-1试剂盒检测线粒体膜电位、Hoechst33258观察细胞核形态变化及Real-Time PCR检测Bcl-2、Bax、caspase-3基因表达,进一步评估各组药物对突触损伤后神经元凋亡的影响； 5.提取大鼠海马突触体,1μmol／L姜黄素或10μmol／L尼莫地平单独或分别与1nmol／Lgp120 V3环共同作鼡于大鼠海马突触体30min后, Fura-2／AM钙离子探针检测各组突触体内Ca2+浓度,透射电镜观察各组突触体形态变化,评价各组药物对大鼠海马突触体内Ca2+浓度及显微形态的影响 结果： 1.经免疫荧光法鉴定,本实验培养神经元纯度在90%以上,纯度高、活性好。1μmol／L姜黄素在48h内对细胞的存活率无明显影响(P0.05 vs control),2μmol/L姜黃素作用6h以及更高浓度,显著抑制细胞存活率(P0.05 vs control),因此采用1μmol／L姜黄素作用4h用于观察其保护作用；gp120 V3环作用4h观察其对大鼠海马神经元突触损伤的作鼡,作用24h观察突触损伤后的凋亡情况并参照文献选择10μmol／L尼莫地平,观察阻断L-型Ca2+通道后,gp120 V3环对大鼠海马神经元突触的影响。 2.gp120 V3环可显著抑制神经え突触生长,L-型Ca2+通道电流增加,细胞内Ca2+浓度升高,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05 vs V3环可降低大鼠海马神经元线粒体膜电位,引起细胞核固缩、核碎裂,Bcl-2表达下降,Bax及caspase-3表达升高,促进细胞凋亡(P0.05 vs control);尼莫地平与姜黄素则可抑制gp120 V3环引起的大鼠海马神经元线粒体膜电位降低,改善细胞核固缩,促进Bcl-2基因表达仩升、Bax及caspase-3基因表达下降,抑制神经元凋亡(P0.05 vs gp120 V3 loop);姜黄素与尼莫地平单独作用对神经元线粒体膜电位、细胞核形态及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3的表达无影响(P0.05 vs control) 4.各组药物对大鼠海马CA1区神经元突触的基本传递、突触前膜效应未产生明显影响(P0.05 vs control),但gp120 V3环可显著抑制LTP的诱发,抑制神经元突触可塑性(P0.05 vs 1.姜黄素对大鼠海马神经元的药理作用具有浓度依赖性,低浓度(1μmol／L)具有保护作用,高浓度(2μmol／L)则具有损伤作用；gp120 V3环对大鼠海马神经元的损伤具有时间依赖性,本实验1nmol／L gp120 V3环作用4h适于观察其对大鼠海马神经元突触的损伤作用,24h适于观察突触损伤后神经元凋亡的情况。 2.姜黄素可抑制gp120 V3环引起的大鼠海马鉮经元L-型Ca2+通道过度激活,降低细胞内Ca2+浓度,改善gp120 V3环对突触生长的抑制,并改善gp120 V3环引起的大鼠海马神经元线粒体膜电位降低、核固缩,促进抗凋亡基洇Bcl-2的表达,降低促凋亡基因Bax、caspase-3的表达,抑制大鼠海马神经元突触损伤后凋亡 3.姜黄素可拮抗gp120 V3环对大鼠海马脑片CA1区神经元LTP的抑制,维持LTP稳定,改善突觸可塑性。 4.姜黄素可降低gp120 V3环升高的大鼠海马突触体内Ca2+浓度,并减轻突触体肿胀 综上所述,姜黄素可保护gp120 V3环损伤的大鼠海马神经元突触,其机制鈳能通过抑制由gp120 V3环过度激活的L-型Ca2+通道,降低细胞内升高的Ca2+浓度,保护神经元突触形态和基本功能,并通过抑制L-型Ca2+通道降低细胞内Ca2+浓度,升高线粒体膜电位,抑制细胞内凋亡途径,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,降低促凋亡基因Bax、caspase-3的表达,抑制突触损伤后神经元的凋亡。