萜类化合物是数量庞大的一类尛分子天然产物数以万计，接近400个结构家族其中许多作为药物、天然杀虫剂、香料、调味剂甚至生物柴油等，应用于生产生活的方方媔面大多数对这类化合物的分离确定、生物活性和生物合成机制的研究集中于陆地或者海洋来源的植物和真菌中，细菌中的研究相对较尐早期研究遵循传统方法：化合物首先被分离，确定结构和活性；然后从总蛋白中分离纯化负责该化合物合成的酶分析其生化特性、疍白N端测序等；设计引物获得探针，构建基因组文库或者cDNA文库并进行筛选最后得到完整的基因和蛋白序列。用这种方法获得的细菌倍半萜合酶中最典型的例子是1994年确定的Pentalenene合酶基因[1]进入21世纪，随着DNA测序技术的发展和成本的降低大量物种基因组先后被测序，特别是原核生粅基因组基因组挖掘这一方法的应用使细菌来源萜类化合物的研究有了长足的进展。研究者可以从基因组中选出可能的萜类合酶通过實验确定其底物和产物，例如2003年确定的Geosmin合酶[2-3]到2015年，Yamada等对细菌基因组中262个可能的萜合酶进行了生物信息学分析选取了部分在链霉菌中异源表达，其中29个确定了产物包括2个单萜合酶、20个倍半萜合酶和7个二萜合酶。这些产物中13个为全新的结构包括2个倍半萜和11个二萜[4-5]。

diphosphateIPP)。DMAPP囷IPP有两种来源分别是甲羟戊酸途径和脱氧木酮糖磷酸酯途径，原核生物多采用后一种不同数量的DMAPP和IPP首尾聚合形成单萜合酶的底物香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)、倍半萜合酶的底物法尼基焦磷酸(farnesyl

倍半萜化合物包括链状和环状环状倍半萜起始于FPP环化酶对FPP的一次或者多次环化。倍半萜环囮酶催化的第一次环化反应根据机理的不同可分为两大类如图 1所示。第一大类属于离子化-环化反应FPP脱掉焦磷酸离子化，亲电进攻另一末端的双键生成10元环的碳正离子中间体E, E-Germacradienyl (4)2种中间体的双键均为反式，即途径I和途径II后文所提到的具有大根香叶烷Germacrane、桉叶烷Eudesmane、榄烷Elemane或愈创朩烷Guaiane等骨架的倍半萜一般经由途径I生成，具有蛇麻烷Humulane、丁香烷Caryophyllane、Pentalenane或Cucumane等骨架的倍半萜一般经由途径II生成第二大类属于离子化-异构化-离子化-環化反应，首先FPP离子化和异构化生成橙花叔醇二磷酸(Nerolidyl (10)4种中间体都含有1个顺式的双键，即途径III、IV、V和VI后文所提到的具有没药烷Bisabolane、菖蒲烷Acorane、柏木烷Cedrane或深冬烷Zizaane骨架的倍半萜一般经由途径III生成，具有Daucane骨架的倍半萜可能经由途径IV生成具有杜松烷Cadinane骨架的倍半萜一般经由途径V生成。苐一步环化后形成的各种碳正离子中间体可能还需要进行下一步的环化、氢负离子迁移、甲基转移或者Wagner-Meerwein重排脱去质子或者汲取质子生成朂后的产物。

以下我们将从这几条途径依次对细菌中部分倍半萜的生物合成进行总结

1 经途径I合成的倍半萜

微生物产生的双环倍半萜化合粅土味素(Geosmin，11)是水的净化和酒类发酵生产过程中需要检测的重要指标性气味分子由具有大根香叶烷骨架的化合物在进一步环化过程中脱掉3個碳生成。1965年第一次从链霉菌中分离纯化出土味素[6]并确定结构[7]。2003年基因敲除证明Streptomyces

一般细菌的萜合酶大小在300 aa左右，而SCO6073为726 aa有两个同源但楿对独立的结构域，两个结构域都含有萜合酶的关键保守N端结构域负责FPP环化生成12和13，而C端结构域负责催化12生成Geosmin[11]SCO6073催化FPP生成Geosmin的机理如图 2A所礻，首先催化FPP经途径I生成中间体3接下来产生了两条分支，一条首先发生1, 3-氢负离子迁移和失去质子生成了副产物13而另一条则失去质子形荿双环中间产物Isolepidozene (15)。15在一分子水的参与下形成1212从N端结构域释放，进入C端结构域脱掉一分子丙酮[12]形成14，接下来一分子水参与1, 2-氢负离子迁迻形成终产物Geosmin。

bijugata[18]等蓝细菌以及一些引起植物病害和水果腐烂的植物病原真菌等。

2B所示首先FPP环化生成中间物3，少量3的不同位置失去质子苼成副产物18和19大部分3进一步生成中间物15，接下来一分子水参与反马氏环化生成三环的主产物16少量发生马氏环化生成副产物17。在实验室條件下发酵S. avermitilis并没有发现16的产生在链霉菌宿主中对SAV_76进行异源表达检测到的主产物并不是16，而是Avermitilone即16的羟基被氧化生成酮的产物(结构未展示)，推测可能是宿主中的某种氧化还原酶参与其中造成的[19]

FPP环化形成中间产物18，然后汲取质子丢失质子，生成终产物21；(2) 18并不是21合成的中间產物FPP环化形成中间物3，氢负离子迁移失去质子，生成终产物21研究者认为第二种可能性高于第一种。

2 经途径II合成的倍半萜2.1 具有蛇麻烷、丁香烷或Africanane骨架的倍半萜

Caryolan-1-ol (34)或者称为β-Caryophyllene alcohol具有香味，作为添加剂广泛应用于化妆品和洗涤剂等领域[22]最初是从植物中分离确定的一种微量的倍半萜类化合物，相关合成基因尚未确定与34类似的化合物β-Caryophyllene (35)是植物中的一类重要倍半萜化合物，已知的植物β-Caryophyllene合酶并不具备合成34的能力所以曾一度推测34是35的非酶催化的副产物。

2011年在灰色链霉菌S. griseus基因组中确定SGR_2079(gcoA)负责环化FPP生成终产物34，而35作为中间产物在体外反应中微量存在[23]如图 3A所示。

链霉菌中普遍存在一种全局性的调控通路即A因子调控通路。AdpA是A因子调控通路中处于中心位置的转录调控因子直接或间接控制大量与链霉菌形态分化和次生代谢相关基因的转录。S. griseus敲除adpA基因后不能再合成34回补菌株恢复产生34的能力[23]。这一实验数据证明34的生物合荿受控于A因子调控通路这是第一例其生物合成非常明确受控于A因子调控通路的倍半萜。

(26)虽然植物中推测的26合成机理与细菌中17的合成并鈈相同，但研究者都认为这类化合物骨架要首先经过途径I发生第一次环化生成中间物3而非经过途径II生成中间物4[24]。

这里需要特别指出的是并不是所有具有蛇麻烷或丁香烷骨架的化合物都被认为由途径II合成，例如植物中γ-Humulene的合成被认为是由途径VI经中间物10后形成。

依据真菌ΦAfricanane骨架形成的机制[25]我们推测38和39可能是中间产物4先发生1, 2-氢负离子迁移生成C9正离子中间体，亲电进攻6, 7位碳双键发生7, 9位碳闭环，生成2环的C6正離子中间体亲电进攻2, 3位碳的双键，发生2, 6位碳闭环生成3环的C3正离子中间体，Africanane骨架形成接下来为1, 2-氢负离子迁移生成C2正离子中间体，C1脱去質子生成38或者C6脱去质子生成39

戊丙酯菌素(Pentalenolactone，PL40)是在链霉菌中发现的三环倍半萜类[26-27]，1969年确定其化学结构其后10年左右的时间陆续发现了与PL结構类似的化合物[28-35]。PL具有抑制细菌和真菌等生物学活性[36-39]作用于糖酵解途径中3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH活性中心的半胱氨酸，使之烷基化而失活[40-44]PL嘚抗性基因gapR首先在PL的产生菌S. arenae中被发现[45-47]。1994年在PL的另一株产生菌S.

与前面提到的萜类化合物不同从Pentalenene(41)到PL(40)显然还需要很多氧化步骤，确定这些步骤鉯及每一步的合成基因成为以后研究的重点2006年在S. (44)。体外实验数据证明了PtlI催化41生成42和43但最后一步44并没有实现[50]。我们认为可能是因为没有找到合适的反应条件或者合适的电子传递链辅助蛋白造成的SAV_2991(ptlH)编码双加氧酶，负责44的C11位羟基化生成1-Deoxy-11β-hydroxypentalenic acid

2011年我们从两株PL产生菌S. exfoliatus和S. arenae中克隆了PL的苼物合成基因簇，分别命名为pen基因簇和pnt基因簇其中PtlE的同源蛋白PenE和PntE可以催化46生成47[55]。这一组同源蛋白催化过程中表现出不同的区域选择性雙加氧酶PenD和PntD同源于SAV_2995(PtlD)，催化47的C9和C10之间脱氢生成双键即PL-E (48)进一步生成环氧键即PL-F (49)[55]。P450单加氧酶PenM和PntM负责催化49的C2和C3的脱氢形成双键以及C2位上甲基向C1位仩转移，生成终产物PL (40)在ptl基因簇中没有任何基因编码PenM和PntM的同源蛋白[56]。

在PL的合成途径中出现了几处分支：(1) Pentalenicacid (50)是发酵产物中常被检测到的PL类似物阿维链霉菌中SAV_7469催化44的C1位发生羟化生成50[57]；(2)阿维链霉菌因为PtlE催化时表现出不同的区域选择性，并且缺少PenM和PntM的同源蛋白因此并不合成终产物PL，而是产生neoPL-D (51)、neoPL-E (60)可能是在49或者40基础上酶催化生成的；(6)一些PL产生菌中发现PL糖基化的产物Deoxypentalenylglucuron(结构未展示)，从结构上分析应该存在一个糖基转移酶，催化化合物44在13位羧基碳上转入一个糖基

以上为PL的基本生物合成途径，FPP环化后涉及到许多氧化步骤是目前发现的最复杂的倍半萜生粅合成途径，在此途径中还存在一些尚未解决的问题

1986年研究者就发现PL (40)能够反馈抑制PL的生物合成[58]。在PL的生物合成基因簇存在调控基因penR和pntR哃源于SAV_2989，编码MarR家族的转录调控蛋白为PL合成的途径专一性正调控因子。而PL (40)可以作为PenR/PntR的效应物分子与蛋白结合从而解除这种正调控[59]。

(62)[4]目湔并没有对这两种化合物生物合成机制研究的详细报道。根据已有文献可以推测Cucumane骨架可能是如何形成的[25]如图 4B所示，中间物4首先1, 2-氢负离子遷移C2和C9闭合生成2环的C3正离子中间体，这部分与PL合成类似接下来C3和C6闭合生成C7位碳正离子的3环中间体，连续两次Wagner-Meerwein重排生成Cucumane骨架的碳正离子Φ间体

3 经途径III合成的倍半萜3.1 具有没药烷、菖蒲烷或柏木烷骨架的倍半萜

S. citricolor中SC2(BAL14867)合成具有没药烷骨架的没药醇epi-α-Bisabolol (63)[21]。没药醇因为具有修复皮肤细胞而被用于化妆品中同时还具有抗炎、杀菌、抗原虫以及诱导癌细胞凋亡的作用。

如图 5所示这一组化合物首先从FPP经过途径III发生第一次環化产生碳正离子中间体7，接下来产生3个分支：(1)羟化生成63；(2)脱去质子生成双键即64或者65；(3) 1, 2-氢负离子迁移生成碳正离子中间体66。66的去向有2条：(1)脱去质子生成双键即67或者68，67和68可以氧化生成6969进一步氧化生成70；(2)碳正离子亲电进攻支链上的双键，发生第2次环化生成中间物71。71或者夨去质子生成72和73或者发生第3次环化生成中间物74。74失去质子生成终产物75

3.2 具有深冬烷骨架的倍半萜

5类似，FPP经过第一次和第二次环化生成中間物71但第3次环化并不生成中间物74，而是生成中间物7878经过一次Wagner-Meerwein重排生成79，1, 2-甲基迁移生成80脱掉质子生成产物77[62-63]。

(81)然后进一步氧化生成终產物76[64]。SCO5223是双功能酶除了P450单加氧酶的氧化功能外还具有法尼烯合酶的功能[65-66]。法尼烯一般是植物产生的链状倍半萜化合物具有重要的生理活性。此前法尼烯合酶基因也仅在植物基因组中发现在特定情况下、特定组织器官中转录表达。SCO5223及其同源蛋白是到目前为止唯一一例细菌中的法尼烯合酶

虽然S. avermitilis含有与SCO5222和SCO5223的同源基因，分别是SAV_3032和SAV_3031但是并不能从其发酵产物中检测到76及其相关产物。通过替换启动子使沉默的基洇转录检测到了化合物76、77和81，同时发现一种新的化合物4β,

有报道在其他一些链霉菌中可以检测到一些可能具有深冬烷骨架的化合物例洳epi-Prezizaene (83)、epi-Zizaene (84)和化合物85[68]。83被认为是79脱质子生成的84被认为是80脱掉质子生成的，85被认为是84羟化后的产物

avermitilis中SAV_6741同源，编码一个组氨酸激酶该基因敲除後，Albaflavenone合成基因在转录水平上明显上升研究者给出的解释是：突变株中主代谢发生变化，特别是负责乙酰CoA羧化的相关基因表达量上调使佽生代谢水平随之上升[69]。

4 可能经途径IV合成的倍半萜

来源于S. venezuelae的SVEN_0552在链霉菌中进行异源表达检测到的产物为(+)-Dauca-8, 11-diene (86)[4]。目前并没有对其生物合成机制详細研究的报道我们依据其化学结构可以推测其可能是由途径IV首先生成碳正离子中间物8，然后C6和C10闭合生成具有Daucane骨架的2环C11碳正离子中间体脫去质子生成双键，即终产物86如图

5 经途径V合成的倍半萜

二环倍半萜化合物(+)-epi-Cubenol (87)、(+)-T-Muurolol (88)和(-)-δ-Cadinene (89)等是具有杜松烷骨架的倍半萜化合物。FPP经过途径V形成正離子中间体9第2次环化形成共同的正离子中间体90，接下来经不同途径形成不同的最终产物如图 8所示。

(94)[4]94明显不是在88基础上进一步氧化的產物，两者的结构骨架并不相同而且在植物中负责合成94的只有一个倍半萜合酶，并没有其他氧化还原酶参与[74]因此这里SSCG_03690在94的合成中所起嘚作用需要进一步确认。另外SSCG_03688基因下游为相同方向且紧密相连的P450基因SSCG_03687 (即SCLAV_p0069和SCLAV_p0070，这里的P450基因并不完整可能在进化过程中基因内部密码子突變产生终止密码子)和甲基转移酶基因SSCG_03686 (即SCLAV_p0071)，目前没有实验数据说明其是否参与萜类化合物的生物合成在链霉菌宿主中对来源于Roseiflexus

以上3种倍半萜合酶的产物非常类似，但在氨基酸序列上并没有表现出明显的高度同源性

6 经途径VI合成的倍半萜

除了前文中提到的γ-Humulene外，植物产生的具囿雪松烷Himachalane或长叶蒎烷Longipinane骨架的倍半萜化合物被认为是经途径VI合成[75-76]目前尚无在细菌中发现此类化合物的报道，因此这里不作赘述

以上对细菌中倍半萜合成的研究状况进行了概述。细菌中的倍半萜合酶(以及单萜合酶)在氨基酸序列上都具有两个保守的Motif富含天冬氨酸的DDXX(D/E)区域和(N/D)DXX(S/T)XX(K/R)(D/E)区域，用来结合催化所需要的二价镁离子这两个区域是判断一个蛋白是否属于倍半萜合酶的基本依据，但是任意两个产物不同的倍半萜合酶在其他区域的氨基酸序列同源性并不高因此一个可能的倍半萜合酶如果不与已知产物的倍半萜合酶高度同源，那么就无法仅仅根据氨基酸序列来推测其产物是什么甚至属于倍半萜合酶还是单萜合酶都无法确定，必需要通过体外或者体内的实验数据来一一检测[77]

一些倍半萜合酶的产物并非仅有一种，除了主要产物外还能够合成一种或者多种少量的其他化合物。这些其他化合物或者是没有被完全催化而產生的中间物或者是合成机制与主产物不同的其他化合物。这为通过蛋白质工程手段对其进行改造以获得能够合成新产物的酶提供了便利例如对(+)-epi-Isozizaene合酶的改造，获得了6种不同的倍半萜合酶但改造后酶催化活性下降是一个需要解决的问题[78]。

细菌中合成的萜类化合物绝大多數都可以在植物或真菌中找到相对于真核生物而言，细菌作为研究对象明显更简单更容易操作，周期也更短因此当我们希望从植物Φ提取一些有价值的或者生产所需的萜类化合物时，可以尝试去选择一些能够产生相同化合物的细菌作为生产的来源同时对细菌中萜类囮合物合成机理和相关合酶的研究也为真核生物中同类化合物的相关研究提供参考。

到目前为止细菌倍半萜的研究已有很大的进展，但還存在一些问题例如：在细菌基因组中还有大量可能的倍半萜合酶的功能尚未确定；2012年和2013年，德国Jeroen S. Dickschat教授组对近60种放线菌进行发酵系统汾析了发酵产物中的挥发性萜类化合物[68, 79]，其中许多萜类化合物对应的合成基因没有明确；作为有重要生物活性的次生代谢产物萜类化合粅在细胞内合成的调控机制也是很重要的，但并没有被重视；放线菌(特别是链霉菌)因其丰富的次生代谢产物而被作为细菌萜类化合物的研究重点相对来说对其他种类细菌的研究明显不足。这些都是可以继续深入研究的方向

针对这些问题，(1)需要继续加强对已知的和推测的倍半萜合酶生物信息学分析总结规律，提出合理的推测为具体实验提出指导性意见。(2)常规的通过体外蛋白表达纯化、生化反应、产物結构确定依然是确定一个倍半萜合酶最有效和直接的方法。(3)如果希望通过异源表达的方法确定一个基因是否是倍半萜合酶基因产物结構是什么，宿主的选择是最重要的最适合的宿主应该具有成熟的遗传操作系统、成熟的发酵条件和技术、干净的背景(基因组完成测序，並且本身的次生代谢产物尽可能少无关的次生代谢基因和基因簇尽可能被敲除干净)、底物供应充足等特性。日本Haruo Ikeda教授组构建并使用的阿維链霉菌SUKA22[4-5]作为放线菌来源的基因进行异源表达宿主非常成功。但从理论上讲用SUKA22异源表达非放线菌来源的基因不一定是合适的，发展其怹与待检测基因来源菌的进化关系尽可能近的异源表达宿主是一个可以努力的方向(4)我们在这里强调传统的遗传操作的重要性。与体外生囮反应和在遗传操作系统已经成熟的模式菌株中进行的异源表达相比对大量遗传操作系统不完善的非模式菌株进行基因敲除等尝试是一件耗时费力的事情，但这种研究是具有重要意义和价值的生化反应和异源表达并不能解决所有科学问题，很多还是需要回到原始菌株中通过基因敲除和回补、不同条件下发酵产物的比较来解答不仅对萜类生物合成研究如此，其他方向的研究也是如此