大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用3下载券
想免费下载本文？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩9页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢PFGE(脉冲场凝胶电泳) 标准操作规程(SOP)_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
PFGE(脉冲场凝胶电泳) 标准操作规程(SOP)
上传于||文档简介
&&P​F​G​E​(​脉​冲​场​凝​胶​电​泳​)​ ​标​准​操​作​规​程​(​S​O​P​)
阅读已结束，如果下载本文需要使用0下载券
想免费下载更多文档？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩6页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢关注今日：8 | 主题：152271
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
【求助】PFGE 图像，Maker有条带，菌少量条带，原因？
页码直达：
问题已关闭悬赏丁当:2
如图，是不是酶切不完全。非发酵菌，SmaI 4小时。难道要过夜？还是其他原因？
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
原因可能会很多，如果是自己摸索条件的实验，可能：1. 可能菌液浓度过高，细胞裂解不彻底，核酶污染。2. 洗胶不够，可以用水多洗2遍试一下。3. 胶块是否是新鲜制备的。4. 酶切不够完全，活性不够或者配比不合适，smaI的酶切条代数也太少了，可以考虑换用其他酶尝试一下。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
原因可能会很多，如果是自己摸索条件的实验，可能：1. 可能菌液浓度过高，细胞裂解不彻底，核酶污染。2. 洗胶不够，可以用水多洗2遍试一下。3. 胶块是否是新鲜制备的。4. 酶切不够完全，活性不够或者配比不合适，smaI的酶切条代数也太少了，可以考虑换用其他酶尝试一下。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
只是为了做PFGE而做的吗？或者有什么研究目标做的呢？比如要做分型，分型方法有很多，PFGE算是操作最需要技术含量的一种了，呵呵。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
分型啊。做了SmaI 几次都是这个图。文献里好多条带。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
kikor 原因可能会很多，如果是自己摸索条件的实验，可能：1. 可能菌液浓度过高，细胞裂解不彻底，核酶污染。2. 洗胶不够，可以用水多洗2遍试一下。3. 胶块是否是新鲜制备的。4. 酶切不够完全，活性不够或者配比不合适，smaI的酶切条代数也太少了，可以考虑换用其他酶尝试一下。谢谢 您的解答。重新做了。2.3可以排除。1，下次试试，不过之前浓度小，条带不清晰时，也是这个结果。4. 过夜后也是这几个条带。可是文献显示好多条带。另外，我换了2个酶，请大家帮忙看一下。两边marker没有跑出来，不知道为什么。问题；2-12孔我换了XbalI切的，只有一个细菌有条带，其他都没有条带，但这几个菌缺失是同一种。
13.14孔我是用Mul I切的，怎么是这个条带，为什么？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
是什么菌方便说么？参考的电泳条件是别人文献的？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你最好把你的实验步骤详细的说一下， 要不这样让大家猜，怎么帮得上你？不同的菌株有不同的条件，其次，别人的实验步骤是别人实验室的，有时候你照着标准操作规程未必能做出来！那只是一个参考，因为每个实验室有自己的操作规程！你的加样孔里较亮，而几乎没有条带，也没有“拖曳”，说明没切开，可能是在裂解的时候就有问题，或者是酶的种类，温度，酶切时间都存在可能，你可以在摸索实验条件的时候，多做对照，比如加酶和不加酶，酶切时间不同等，这样可以为你节省时间。我们都是用Xba I，没用过Xba II，这个酶没见过，你可以自己找找相关参考。菌液的浓度一定要达到，因为有时候菌液浓度较低，酶较多，同样会影响到效果。还有就是“无菌操作”，以防混入对酶有抑制作用的物质或是可降解片段的物质。再就是洗胶的时候一定要充分，溶液是否保存时间很久了？13,14孔呈这样，我猜猜吧，可能细胞裂解的时候不充分或是酶不合适？具体你得自己摸索。欢迎有问题接着问
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
试验步骤；实验步骤一、胶块制备
从MH平板上挑取已培养过夜的纯菌落，用1ml细菌悬浮液（CSB）混匀。（OD=6）2
吸取200μl上述菌悬液，加入10ul蛋白酶K，轻轻颠倒混匀2-4次。3
1%胶制备：称0.1g胶，加10mlTE，微波炉加热，54℃水浴30min备用。（Gold Agarose）4
吸取200ul胶加入菌悬液，充分混匀并迅速加入模具中。将模块在4℃冰箱中放置至少5分钟。二、裂解与洗涤 1 将胶块放入离心管中，加5ml细胞裂解液（CLB）、25μl蛋白酶K，54℃水浴摇床4h （或者过夜），150-200rpm。2 弃去细胞裂解液，用预热至55℃的超纯水和TE各洗3次，每次15min。3 弃去液体，每管加入5m l室温放置的TE，4℃过夜或长期保存。 三、酶切与上样 1 切下2mm胶块放入2ml离心管中，加入120μl酶切缓冲液（不含酶），25℃孵育15min。（沙门菌37℃）2 弃去酶切缓冲液，加入新鲜的含SmaI的酶切缓冲液120μl，25℃酶切3-4h。3弃去酶切缓冲液，加入0.5*TBE 200μl，室温放置5min。4 用0.5*TBE缓冲液配制1%的胶，把消化好的包埋有细菌的胶块小心放入梳孔中，空隙无需密封，放置30min。四、电泳 1 打开电泳仪，加入2500 ml0.5*TBE，打开泵，排空气泡后打开制冷伐，调成14℃。
（根据电流量加TBE的量，电流需控制在135-145mA，电流高需放水。）2 电泳条件设置：分子量30K-600k，6V/cm，脉冲时间5s至20s，14℃，电场角度120°，总时间为19h。 第四天五、结果观察1 电泳结束后染色45min。然后紫外线透射仪下观察结果。
2 结果分析CSB 配方
1M Tris-HCl
稀释至100mlCLB配方
1M Tris-HCl
SarcosylTE配方
1M Tris-HCl
稀释至1LTBE配方
170.5g粉剂 + 1L dd H2O SmaI体系
10*Cutsmart
内切酶SmaI
XbaI体系 ddH2O
90ul 10*M Buffer
6ul电泳凝胶取160ml +1.6g 金胶
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
这次是细菌裂解过夜。第一孔为 maker接着为SmaI 酶切3h，酶多加1ul，之前做过酶切2h。3h。过夜均是这样的条带。中间一条多条带的为XbaI 酶切的，仅有1个菌被切，最后3个用MluI酶切，文献上也是小片段。200kb以下。貌似这个选择这个酶，片段多，小，不合理。附 文献SmaI酶切图
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
实验步骤不知你从哪里整的，并不代表你的试验数据，没意思就不看了！还有个问题，就是你做的非发酵菌中的什么菌？你用的是Sma I ，难道做的是不动？其次你的酶和菌株是否配套？酶切25℃，是酶说明书的要求还是你参考的文献？我当时做肠杆菌，xbaI 37℃ 6h，细胞裂解是过夜的。我感觉比前几次的要好，最少说明你已经切开了，还有就是（若真是按你所谓的步骤所做），你的细菌OD值为6,但是我发现你的条带颜色很淡，而且“加样孔”并未出现想象中的那么，我是用的比浊仪，换算过来浊度比你的小，但是片段和加样孔都比你的亮，你是小胶块切的小还是你试验中存在一些“污染物”，可抑制酶的活性或降解DNA片段？你觉得是否需要把你所有的试剂重新配一遍，然后高压灭菌？一般酶切以前的步骤，条件都差不多，所以，你可以同时裂解多块小胶块，然后分别摸索不同的条件，如不同的酶，酶切时间，温度等，而且一定要做不加酶的阴性对照，看加样孔是否发亮！剩下的小胶块可以于裂解液中4℃保存下来，等下次接着摸索条件。这样可以节省很多时间。这是我当时做的一些体会，希望对你有帮助！PFGE是个令人头疼的试验，当时我做了一个半月才做出来，很多条件都是自己摸索的，和文献上报道的差别很多，最后祝你好运！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我做的是香味类的一种。GC含量少，貌似不能用XbaI切。找不到基因组序列。请帮忙分析。谢谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢你的解答。我写的OD值是6，但是没有测，因为我们的比浊仪职能测到4. 我估摸的。你说配的试剂有问题。那么我marker为何能跑出来呢？沙门XbaI。不加酶的胶块对照，加样孔的亮度能说明什么问题？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
就怕是SmaI的酶切位点就这么多，这样找来找去，找不到原因怎么办？上班好忙。胶块切1/3到1/2之间大小。一般一块胶用2次，剩下一点太小不能用了。 条件如何摸索？ 已经试了3种酶。SmaI酶切时间也试了。希望寄托在SmaI上。 切来切去就是这6条片段。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
加样孔亮说明DNA未被降解，如果不是很亮，而且出现了拖曳的现象，说明存在某些物质降解了细菌的基因组DNA.我说的试剂有问题，意思是说害怕不是新鲜的，里面的成分发生了变化，至于为什么你的marker切出来了，原因很多了，就像条件一样，有些菌株切开，有些未切开。我们当时都是配好试剂后半个月内就换，而且部分试剂最好高压一下。OD值是吸光度值，比浊仪测定的是细菌的浊度，虽然两者意思差不多，但是绝不是相等关系，有个公式可以换算。我当时做的菌株是按照文献上的酶，还真没有去关注细菌GC比，好像GC比例比较低的话，Xbal 的效果不是很好。小胶块我们也是切成两三个，但是我当时制小胶块就制了两个，所以在结果还没出啦的时候，另一组条件已经摸上了。条件摸索，你哪个学校的，最好问问你们师兄师姐，当时他们怎么弄的，因为不同实验室仪器、试剂厂家不同，多少会存在一些偏差，这就是为什么文献上的试验可重复性那么低。条件主要还是集中在酶切的温度和时间，电泳条件，当然了细菌的浓度有时候也算吧！最后，祝你好运，你的痛苦我明白，哈哈哈哈！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
制胶块加蛋白酶K前，我看有的操作是200ul菌液37度孵育5分钟，再加10微升蛋白酶K。
我没有37度孵育，这步骤影响结果吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
lovelypucca 制胶块加蛋白酶K前，我看有的操作是200ul菌液37度孵育5分钟，再加10微升蛋白酶K。
我没有37度孵育，这步骤影响结果吗？我们没有孵育，就是用CLB裂解完直接制胶，我也不清楚这步是干什么，会不会是害怕温度太低，凝固太快，导致菌液、蛋白酶K和凝胶未充分混匀之前就凝固，分布不充分？我猜的。PS. 你下次再回复，把我的回复引用，要不我看不到你的回复。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
赵慧铮 我们没有孵育，就是用CLB裂解完直接制胶，我也不清楚这步是干什么，会不会是害怕温度太低，凝固太快，导致菌液、蛋白酶K和凝胶未充分混匀之前就凝固，分布不充分？我猜的。PS. 你下次再回复，把我的回复引用，要不我看不到你的回复。我跑出来了，试了实验室里的其他酶，终于找到一个合适的了。估计之前的酶就只能切6个片段，跑不出来文献的条带。还请教个问题: 1. NEB的酶说明书都是50ul体系加1ul酶。
我这个酶是5000U/ml，那我100ul体系加多少酶合适？ 两边为marker ，前7个为3ul的酶，后5个为4ul的酶切。2.为啥我的条带不清晰啊？看别人的都是很细的一条线，并且背景发黑不泛白。我是用？red染液，没用EB。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
lovelypucca 我跑出来了，试了实验室里的其他酶，终于找到一个合适的了。估计之前的酶就只能切6个片段，跑不出来文献的条带。还请教个问题: 1. NEB的酶说明书都是50ul体系加1ul酶。
我这个酶是5000U/ml，那我100ul体系加多少酶合适？ 两边为marker ，前7个为3ul的酶，后5个为4ul的酶切。2.为啥我的条带不清晰啊？看别人的都是很细的一条线，并且背景发黑不泛白。我是用？red染液，没用EB。1.NEB的酶我没用过，说明书上应该有吧，应该是50ul体系加多少单位的酶，然后给出你酶的浓度，然后算出加的体积，如果按你的这个说法，应该是通过加入的体积1ul算出你体系中加入了多少酶。2.从你的图中，好像没看出来3ul和4ul酶有什么区别，整数第2个，倒数第4、5个是不是切小胶块的时候不是规整的小长方体，怎么感觉条带中间有个缺口？3.条带算可以的了，至于为什么黑白之类的，你可以调整条带和背景的亮度，选择合适的对比度。4.测试菌株相对于MARKER，条带有点粗，可能与胶的浓度，缓冲液的缓冲能力和跑胶时的温度有关。5.正数第3、4个，条带存在降解的可能，因为加样孔比不是很亮，而条带很模糊，隐约之间的确存在。6.给你个提醒，下次跑胶的时候，中间多放几个marker，以后你会懂得滴。PS.你这样上传你的图片，而且也不编号，真是治好了我多年的颈椎病啊！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
赵慧铮 1.NEB的酶我没用过，说明书上应该有吧，应该是50ul体系加多少单位的酶，然后给出你酶的浓度，然后算出加的体积，如果按你的这个说法，应该是通过加入的体积1ul算出你体系中加入了多少酶。2.从你的图中，好像没看出来3ul和4ul酶有什么区别，整数第2个，倒数第4、5个是不是切小胶块的时候不是规整的小长方体，怎么感觉条带中间有个缺口？3.条带算可以的了，至于为什么黑白之类的，你可以调整条带和背景的亮度，选择合适的对比度。4.测试菌株相对于MARKER，条带有点粗，可能与胶的浓度，缓冲液的缓冲能力和跑胶时的温度有关。5.正数第3、4个，条带存在降解的可能，因为加样孔比不是很亮，而条带很模糊，隐约之间的确存在。6.给你个提醒，下次跑胶的时候，中间多放几个marker，以后你会懂得滴。PS.你这样上传你的图片，而且也不编号，真是治好了我多年的颈椎病啊！哈哈。谢谢你的解答。用手机发的图，上传后发现歪了，想想算了。凑合吧。1. 说明书是50ul体系： 10 units is sufficient, generally 1ul is used。但这酶是5000U／ml。并且我也不知道我有多少DNA啊。另外，你菌液浓度多少麦氏。我没有测，估计得有6.7麦氏吧。是不是太大？2.确实有2块胶中间断了2半，我又拼上跑的。有几块边缘是不整齐，下次胶的上下两边都切一切。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
lovelypucca 哈哈。谢谢你的解答。用手机发的图，上传后发现歪了，想想算了。凑合吧。1. 说明书是50ul体系： 10 units is sufficient, generally 1ul is used。但这酶是5000U／ml。并且我也不知道我有多少DNA啊。另外，你菌液浓度多少麦氏。我没有测，估计得有6.7麦氏吧。是不是太大？2.确实有2块胶中间断了2半，我又拼上跑的。有几块边缘是不整齐，下次胶的上下两边都切一切。那这样的话，酶一定写着一支是多少体积，然后你就知道你加了多少单位的酶。我当时大概是3.8-4.0左右浊度，用麦氏比浊仪测定的，估计的肯定不行，很有可能你估计大了，6.7的确有点大，可能造成酶的量相对不足。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园|/|/|/|/|/|
//|//|//|//|//|
【求助】PFGE酶切总是不能完全切开
小弟正在做PFGE测定基因组大小,现在遇到了一个及其头疼的问题,酶切总是不能完全切开.我用的酶是生工的,酶切16小时.1lane是MARKER,2是未酶切的plug对照,3到4分别是用不同的酶切的plugs.电泳条件:two state:bio-rad mapper cheftime:22h;initial switch time:90final swtich time:110including angle:120;voltge:6v/cm做了一个多月了,到酶切卡壳了.j急啊望各位大侠们猛烈拍砖,多提宝贵以意见.小弟在这先谢过了!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 具体酶切方法是:177ul的dd水+20的buffer+3ul的酶.酶总单位一共30U.在1.5mlEP管中37度温箱温育. 具体酶切方法是:177ul的dd水+20的buffer+3ul的酶.酶总单位一共30U.在1.5mlEP管中37度温箱温育. 具体酶切方法是:177ul的dd水+20的buffer+3ul的酶.酶总单位一共30U.在1.5mlEP管中37度温箱温育.帖光s！这是小弟跑的PFGE图片
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=480 height=640 title="Click to view full .jpg (480 X 640)" border=0 align=absmiddle>dinng!!难道大虾们都归隐山林了吗？？？？？？？？你电泳用的水能否保障是18.2欧姆的超纯水吗？1.酶的量够不够，很多用50U，2.酶切时间16h?
我做脑膜炎奈瑟菌，Nhe1酶切，只用切2h 3.在酶切前菌体裂解是否充分？洗胶是否彻底？PFGE做起来很麻烦，但最好每一步都严格按照protocol做，试剂的品质、用量和作用时间都要有保证。提供个链接（包括大肠，李斯特，空弯的prococol），不知道对你有没有用?> ... ria_protocol%20.pdf首先非常感谢b]juchy3572战友提出的宝贵建议.1.关于酶量,我曾经用50的ECORI切过,效果还是不太好. 不过可以考虑用其它的酶试试.2.酶切时间过长的话,不会切不开啊??另想问一下你用的酶是那个公司的,用的是50U吗?3.我的protocol是按照美国cdc的大肠的protocol做的,不过是把proteinaseD的量加大到0.5mg/ml.proteinaseD 应该是proteinase K.不好意思呵呵.呵呵，会不会是酶失活了啊，因为生工送东西不是通过快递，而是通过EMS，这样酶类很容易失活。我就有一次买的PCR试剂，结果也是扩了一个多月不行，然后从Takala买了酶，只一次，就OK了。所以先查一下酶有没有失活是最主要的。祝你好运！希望大家多提宝贵意见!!在下万分感激还是没有啊！！郁闷哦。请高手们研判研判!!!
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=480 height=640 title="Click to view full PFGE 06.5.23.jpg (480 X 640)" border=0 align=absmiddle>1:2.smaI;3BamH I;4.EcoR I;5.XhoI.smaI 和XhoI的量是100个单位.3BamH I;4.EcoR I分别是200个单位。酶切了16个小时。电泳体系：6V/CM;PULSE TIME 60-120SEC;ANGLE:120;RUN TIME 24HOURS.BamH I和EcoR I是不是没有切开，还是太小跑出去了，后者的可能行觉得太小。因为背景很干净。那么问题是不是应该在PLUG的制作上？？是菌没有裂解完全？？？还是蛋白酶K消化的问题？？还是洗胶的问题？？？？请高手多多指教啊！！！！！做不出来急啊÷！！！！！问题应该出在PLUG的制作上（1）加大蛋白酶K浓度0.8mg/ml同时延长蛋白酶K消化时间（48H，期间也可更换蛋白酶K溶液）（2）蛋白中K消化好后，PLUG用TE　BUFFER多冲洗几次。（3）酶切时PLUG先用10倍稀释BUFFER　4度浸泡20分钟，再进行酶切。顺便问一句在做什么细菌？laoyang wrote:问题应该出在PLUG的制作上（1）加大蛋白酶K浓度0.8mg/ml同时延长蛋白酶K消化时间（48H，期间也可更换蛋白酶K溶液）（2）蛋白中K消化好后，PLUG用TE　BUFFER多冲洗几次。（3）酶切时PLUG先用10倍稀释BUFFER　4度浸泡20分钟，再进行酶切。顺便问一句在做什么细菌？ 我做的是reimerella
anatipestifer（鸭疫里默氏杆菌）目前在这个菌上pfge还是一片空白。再请教laoyang一个问题：如果问题是在plug的制作上，那么是蛋白酶k消化的时间不够还是细菌裂解的不充分？现在我的PLUG能切开，但是跑出来的条带很模糊。不知道是什么原因。是酶切体系还不构好，还是电泳有问题？？？请高手多多指教！！！
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=480 title="Click to view full PFGE
06.6.10.jpg22.jpg (640 X 480)" border=0 align=absmiddle>自顶哦！！！！！！您好，我曾经做过一段时间的PFGE， 现在对做PFGE都有些害怕了，就是向您一样，做了很多天，最后一看没有结果，还不知道原因在哪？我自己的体会是这样，希望对您有帮助，但不一定是正确的：1）做完plug后，酶切我们实验室一般是先将plug在2X的buffer中室温孵育半小时，然后吸出液体，加入含有酶的2X的buffer。根据酶的孵育温度，消化3-12小时不等，3小时一般足够了，但我多用6小时。2）上样时，您可以同时加不做酶切的和做了酶切的同一个样本，并加一个marker。这样的话方便找原因。marker条带正常的话，就说明电泳是正常的，没有问题。不做酶切的话，应该在加样孔有很亮的条带，在泳道上没有信号，如果有信号的话，说明基因组有部分或者全部降解，如果全部降解，加样孔就没有条带了。你把你三张图的条件（包括前期试验）说明一下；把你试验的过程说明一下，尤其是制胶的过程及细菌的处理过程；试剂来源；改天我给你分析问题所在。我现在遇到了和你一样的问题酶切的不完全，但是如何解决这个问题成为一个问题，所以顶一下，请教高手，谢谢被降解了一种可能，在制作plug时，还没有加入蛋白酶K时，细菌菌体已经死亡（水浴温度过高？应严格控制水浴温度），菌体内DNA酶释放，基因组DNA被降解。二种可能，制作Plug的整个体系的某个步骤存在DNA酶污染，建议重新配制各种缓冲液，并高压灭菌。（csb和clb均应现配现用）三种可能，酶切过程中DNA酶污染，可在电泳时同时加入没有酶切的Plug进行对照试验。四种可能，电泳缓冲液中有DNA酶，加适量硫脲可使之变性。最后，酶切对水的要求很高的，一定要18M以上的纯水。以上几种可能 解决好了，肯定没问题的，祝搂主好运！！现在终于能切开了。最后的结论是实验室保存的菌有问题，吐血啊！！我大把的时间就这么浪费了。。。lane1：plugs凝固后取样的对照；2：消化后的对照；3：用te洗后的对照；4：PMSF处理后再用te洗的对照；5：酶切对照；6：Apa I 酶切。有几个不明白的地方想再请教各位大侠们：1.1-5为什么样品有部分降解？2.在图片的上部2-5为什么都有一条比较大的带呢？？？？非常感谢大家以前给予的宝贵意见。真是获益非浅那！！！！
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=70 height=197 title="Click to view full PAGE RA5 -2ps.jpg (70 X 197)" border=0 align=absmiddle>ding一下先刚跑的ＰＦＧＥ，准备构建物理图谱！有个问题想请教大侠们：两个大小相似或者完全一样的片段在胶上位于同一位置，用那种方法可以判断胶上的一条带中含有两个完全不同的片段．
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=597 height=985 title="Click to view full
PFGE RA5-2ps.jpg (597 X 985)" border=0 align=absmiddle>图惨不忍睹啊，只要胶块处理的好，酶切时间2－4H足够。但是酶的量一定要足够！一般应在50U左右。看了你的图，脉冲条件选的不好，而且图像偏移太多。建议参考美国CDC的标准操作规程！呵呵，没看见前面有个人发了操作规程了。一定要严格按照操作规程去做，特别是使用的胶。你的实验不合格啊,朋友!根本没有明显的酶切条带.你一直没有说是什么菌.如果是球菌,按照美国CDC的操作规程是不够的.我曾做过金黄色葡萄球菌的PFGE,按美国CDC的规程是做不出来的,后来是按照美国BIO-Rad公司提供是试剂盒说明书操作,加上自己的摸索才比较顺利.你的plug制作的不好,降解的厉害.如果是球菌,非常注意低温操作,CLB和CSB都要4度,菌液放冰上.另外,增菌前一定要先分出单个菌落,然后才用单个菌落增菌.我个人的经验是,PFGE的plug一定要做好,否则后面的实验就是浪费时间和精力.plug做好了,酶切浓度和电泳条件都只是锦上添花的事情 了.如果没有现成的电泳条件,不要着急制plug.可以先将酶切好的maker上不同的电泳条件,marker跑好了,你再上菌株也不迟.这样避免浪费精力.“如果是球菌,按照美国CDC的操作规程是不够的”呵呵，阳性的球菌我也做了不少，按照美国CDC的规程没问题的。jiqimao7878 wrote:“如果是球菌,按照美国CDC的操作规程是不够的”呵呵，阳性的球菌我也做了不少，按照美国CDC的规程没问题的。你做的是那个菌？不需要加溶菌酶和低温操作吗？李斯特和链球菌都做过，低温操作要求不是那么严格，溶菌酶是要用的。感谢大家的意见．我现在做的细菌，目前还没有人做过ＰＦＧＥ，所以那种酶能交好的用于该菌的ＰＦＧＥ还是未知数．上一张图片是我探索那几种酶能较好切开该菌．从图中可以看到，所选的酶几乎都不能用于该菌，包括常用的NOT I ,因为切不开．从我目前的实验结果来看，plug的问题已经基本解决．现在的问题是寻找合适的酶．jiqimao7878 wrote:李斯特和链球菌都做过，低温操作要求不是那么严格，溶菌酶是要用的。美国CDC网站有链球菌 的protocol?我也在作pfge，在试着作金黄色葡萄球菌的PFGE，请问一下制胶块和一般的细菌有什么区别么？我看到文献上是用lysostaphin（溶葡球菌酶）帮助裂解细胞的，是不是可以使用溶菌酶代替裂解金葡？？需要的使用浓度是？？按照一般的操作规程，做出来的是完全空板：（
您的位置： &&