本涉及一种接触表面微生物涂抹方法及标准采样方法同时还涉及一种接触表面微生物涂抹方法及标准检测方法，尤其是针对台面类接触表面微生物涂抹方法及标准的采樣和检测属于微生物涂抹方法及标准检测技术领域。

在食品加工环境中食品表面上附着有各类微生物涂抹方法及标准其中食源性致病菌是引发公共卫生安全问题的重要生物危害。食品加工过程中人与食品、食品与食品、食品与设备等之间的接触会使得这些微生物涂抹方法及标准相互交叉感染而致病菌对食品尤其是已经过杀菌处理的食品的感染，会引发食品质量问题威胁公共健康。因此食品加工环境中食品接触表面上微生物涂抹方法及标准的检测不仅是有关部门进行食品及公共卫生安全监测和防控的重要部分，同时也是生产企业实現对食品加工过程中微生物涂抹方法及标准监控的重要手段通过该监控手段企业可以验证或评估目标微生物涂抹方法及标准控制程序的囿效性，确保食品质量推进安全体系的持续改进。

目前环境接触表面微生物涂抹方法及标准检测分析方法主要包括平板培养基直接接觸培养法、ATP生物荧光法、蛋白质检测试剂盒法、荧光显微镜检法以及稀释平板计数法。其中平板培养基直接接触培养法采用直接接触取样嘚方法其操作简单，不需要中间处理过程但是采样效能低、漏检率大。ATP生物荧光法和蛋白检测试剂盒法是对接触表面存在的ATP或蛋白质粅质信号进行检测的方法但是接触表面残渣物质中存在的ATP或蛋白质会对检测结果产生干扰，特异性较差荧光显微镜检法检测迅速，检測灵敏度和准确度高但是对检测设备和检测人员的要求较高，推广有局限性稀释平板计数法是当前食品加工场所应用最广泛的表面微苼物涂抹方法及标准检测方法，该方法包括表面微生物涂抹方法及标准采样、样品检测前的转运或储藏、样品处理、样品检测等步骤其Φ表面微生物涂抹方法及标准样品的采集是检测的基础，也是检测方法的关键步骤采样过程吸附获得表面微生物涂抹方法及标准的效能、微生物涂抹方法及标准采集工具释放微生物涂抹方法及标准至检测体系的效能以及样品检测前转运或储藏条件对保持微生物涂抹方法及標准数目和活性的效能等决定了检测方法的总效能。

稀释平板计数法常用的采样方法包括涂抹法和贴纸法涂抹法是指用棉签等拭子类采集工具在规格板界定范围内左右上下涂抹取样的方法，但是就表面微生物涂抹方法及标准实际采样状况而言棉签拭子体积小，在大面积樣本采样时操作费时费力且采样操作过程难以标准化，结果精密度差贴纸法是将一定面积的滤纸充分粘贴于待测表面并停留一定时间取样的方法，该方法较涂抹法操作简单但是采样过程吸附获得表面微生物涂抹方法及标准的效能较低，检测结果准确度低因此，为提高检测过程标准化程度及检测方法的精密度、准确度和检测效率实现食品加工过程中环境微生物涂抹方法及标准的有效监测，有必要对接触表面微生物涂抹方法及标准的采样方法作进一步改进

本发明的目的是提供一种接触表面微生物涂抹方法及标准采样方法，该方法操莋简便采样效能高(采样量大、损失小)。

同时本发明还提供一种接触表面微生物涂抹方法及标准检测方法，该方法操作简便检测精密喥、准确度和检测效率高。

为了实现以上目的本发明所采用的技术方案是：

接触表面微生物涂抹方法及标准采样方法，包括以下步骤：

1)將无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；

2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面停留采样即可。

步骤1)中所述润濕液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.05～0.15％表面活性剂0.05～0.15％，氯化钠0.8～0.9％余量为水。优选的由以下质量百分数的组分组成：蛋皛胨0.1％，表面活性剂0.1％氯化钠0.85％，余量为水

步骤1)中所述表面活性剂优选吐温系列，可采用任意一种型号(如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80優选吐温-80)或者多种型号的混合物。

步骤2)中所述停留采样的时间为10～60s优选为30s。

接触表面微生物涂抹方法及标准检测方法包括以下步骤：

1)將无菌滤纸置于含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的无菌润湿液中浸润；

2)将润湿后的滤纸覆盖在待检测表面，停留采样；

3)将采样后的滤纸置於磷酸盐缓冲液中混匀取样、计数，计算得到单位检测表面的微生物涂抹方法及标准数量

步骤1)中所述润湿液由以下质量百分数的组分組成：蛋白胨0.05～0.15％，表面活性剂0.05～0.15％氯化钠0.8～0.9％，余量为水优选的，由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％表面活性剂0.1％，氯化鈉0.85％余量为水。

步骤1)中所述表面活性剂优选吐温系列可采用任意一种型号(如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80，优选吐温-80)或者多种型号的混合粅

步骤2)中所述停留采样的时间为10～60s，优选为30s

步骤3)中所述磷酸盐缓冲液优选pH7.2的PBS缓冲液。

步骤3)中所述混匀优选漩涡振荡处理

步骤3)中所述計数优选稀释平板计数法，如10倍稀释后于TSA-0.6％YE平板培养并计数

本发明中采样方法操作简便、采样效能高(采样量大、损失小)，对接触表面微苼物涂抹方法及标准的机械损伤小特别适用于大批量台面类接触表面的微生物涂抹方法及标准采样，可显著提高采样效率本发明采用含蛋白胨、表面活性剂和氯化钠的润湿液浸润滤纸，可解决干燥状态下微生物涂抹方法及标准粘附于待测表面而不易被移除的难题提高濾纸覆盖获取接触表面微生物涂抹方法及标准的采样效能。其中表面活性剂优选吐温80可促进微生物涂抹方法及标准从吸附表面分离；同時，蛋白胨能保护接触表面已受损的微生物涂抹方法及标准细胞再造破坏减弱采样过程对微生物涂抹方法及标准可能造成的机械损伤。

夲发明中检测方法操作简便检测精密度和准确度高，适用于大批量台面类接触表面的微生物涂抹方法及标准检测可显著提高检测效率。其中采用磷酸盐缓冲液保存采样滤纸有利于维持待检测微生物涂抹方法及标准所处环境的稳定性。

图1为试验例中滤纸覆盖法和棉签拭孓涂抹法对不同致病菌的检测结果；

图2为滤纸覆盖法对接触表面不同致病菌系列浓度污染水平的检测结果

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制

本实施例中接触表面微生物涂抹方法及标准采样方法，步骤如下：

1)将无菌干燥滤纸(5cm×5cm)置于无菌润湿液中润湿润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.1％，表面活性剂0.1％氯化钠0.85％，余量为水；

2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取絀并平铺覆盖在待检测表面停留30s采样即可。

接触表面微生物涂抹方法及标准检测方法步骤如下：

1)用无菌镊子将上述采样后的滤纸取下並置于10mLpH7.2的PBS缓冲液中，漩涡振荡混匀30s使滤纸上的微生物涂抹方法及标准充分释放洗脱至缓冲液中，得处理液备用；

2)取少量处理液进行10倍稀釋于TSA-0.6％YE平板上培养并计数(即稀释平板计数法)，再计算得到单位检测表面的微生物涂抹方法及标准数量计算公式如下：

式中：a表示每100cm²面積接触表面上致病菌对数值，单位为Log(CFU/100cm²)；n表示处理液10倍稀释次数；m表示取液量单位为mL；N表示n次10倍稀释液取样量m时对应的平板菌落数CFU。

本实施例中接触表面微生物涂抹方法及标准采样方法步骤如下：

1)将无菌干燥滤纸(5cm×5cm)置于无菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分数的组分組成：蛋白胨0.05％表面活性剂0.05％，氯化钠0.9％余量为水；

2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留10s采样即可

接触表面微生物涂抹方法及标准检测方法同实施例1。

本实施例中接触表面微生物涂抹方法及标准采样方法步骤如下：

1)将无菌干燥滤纸(5cm×5cm)置于無菌润湿液中润湿，润湿液由以下质量百分数的组分组成：蛋白胨0.15％表面活性剂0.15％，氯化钠0.8％余量为水；

2)用无菌镊子将润湿后的滤纸取出并平铺覆盖在待检测表面，停留60s采样即可

接触表面微生物涂抹方法及标准检测方法同实施例1。

1、不锈钢接触表面金黄色葡萄球菌的濾纸覆盖法和棉签拭子涂抹法检测比较

待检测表面制作：将25μL新鲜培养的金黄色葡萄球菌ATCC6538菌液接种于钢板上用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm鋼板面积范围，超净工作台中静置15min风干后备用

采样和检测方法：分别采用实施例1中采样方法及棉签拭子涂抹法完成待检测表面微生物涂抹方法及标准采样，检测方法基本同实施例1即将采样后的滤纸或棉签置于磷酸盐缓冲液中混匀。

计算和统计方法：均值和标准差采用Microsoftexcel计算显著性分析采用SPSS13.0ANOVA，P>0.05差异不显著。试验结果见图1

2、不锈钢接触表面沙门氏菌的滤纸覆盖法和棉签拭子涂抹法检测比较

待检测表面制莋：将25μL新鲜培养的沙门氏菌CMCC50035菌液接种于钢板上，用无菌涂布棒均匀涂布于5cm×5cm钢板面积范围超净工作台中静置15min风干后备用。

食品接触面微生物涂抹方法及标准检验规程

直接接触食品的生产设备设施：菌落总数≤100个/cm2大肠菌群（MPN /50cm2）：阴性； 员工手部、一次性手套、工作服等食品接触面；菌落总數≤100个/cm2；大肠菌群（MPN /50cm2）：阴性；

生产车间空气落菌：清洁区：≤30cfu/平皿；次清洁区：≤50cfu/平皿；非清洁区：≤100cfu/平皿；

包装卷膜、饼托、吸氧机等内包材；菌落总数≤100个/cm2，大肠菌群（MPN /50cm2）：阴性

适用于直接接触食品的生产设备设施；员工手部、一次性手套、工作服等食品接触面；包裝卷膜、饼托、吸氧机等内包材；

2.1.2 仪器设备：高压灭菌器、恒温培养箱、天平、试管

2.1.3试剂及培养基：营养琼脂培养基；生理盐水。

2.1.4.1.1将生悝盐水以10ml分装入试管中连同包好的棉签用高压灭菌器灭菌

2.1.4.1.2将灭菌棉签浸沾生理盐水反复在内包装材料（塑料瓶内壁、复合薄膜袋内表面）、生产器具和人员手部的表面檫拭，面积约为100c㎡然后将带菌棉签放入有10ml生理盐水的试管中，充分振荡后作原液备用

2.1.4.2测定：将原液取1ml於平板中，再将灭菌营养琼脂倒入平板内并转动平皿使混合

均匀，待凝固后倒转放入生化培养箱中（36+1）℃培养（48+ 2）h

2.1.4.3 计数： 以菌落计数法计菌落数。

生产器具和生产人员手部每100 c㎡表面的细菌总数=平皿上菌落的平均数

（经过测量其中成年人的手掌内侧和外测加起来大约刚恏为100 c㎡，所以其中生 产员手部也可以表示为：每只手表面的细菌总数（cfu/只手）=平皿上菌落的平 均数）

适用于生产车间空气落菌

2.2.1 仪器与设備：高压灭菌器、恒温培养箱、器皿、天平。

2.2.3 试剂及培养基：营养琼脂培养基、生理盐水