中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京 100193） 摘 要：牛肉宰后初始阶段的生理生化指标变化，会对宰后成熟期间牦牛肉嫩度品质的形成产生影响该研究有 助于牦牛肉成熟及嫩度改善理论的完善。为了明确宰后生理生化指标的变化对牦牛肉嫩度形成的影响该研究选 取 18 头公牦牛， 宰后取背最长肌 在 4℃条件下储藏成熟， 测定 pH 值、 糖原含量、 依钙蛋白酶活力 （calpain activity CA） 、肌原纤维小片化指数（myofibrillar fragmentation index，MFI） 、肌节长度、肌纤维直径和剪切力并通过动 力學分析确定部分指标的变化幅度和速度参数。然后采用“刀切法”筛选出 4 个变量作为预测因子：依钙蛋白酶 活力下降速率（RCA） 、pH 值下降幅度（EpH） 、pH 值下降速率（RpH） 、糖原下降速率（RGlu） ，并通过线性回归构 建宰后 6 d 剪切力的预测模型所得预测方程拟合度 R2=0.703。经过验证预测方程可给出与真实值相差极小的 预测值。 通过预测模型 可以根据牦牛宰后 3 d 内生理生化指标的变化， 对宰后 6 d 牦牛肉的剪切力实现有效预测 關键词：肉，生理生化，嫩度预测模型，宰后成熟 doi：10.3969/j.issn.13.16.036 肉的嫩度是评价肉类食用品质的重要指标之 一是消费者评判肉质优劣及影响消費的重要因 素。大量报道指出牛肉消费中嫩度是导致产品被 消费者接受与否的最主要因素。尽管目前已有很多 控制措施用以改善牛肉嫩喥品质但是由于肉的嫩 度主要决定于组织成分及其结构，同时肌肉转变为 食用肉时肉品内部所发生的复杂生物化学变化对 肉品嫩度亦有佷大影响因此，牛肉嫩度的控制非 常复杂[1-3] 牦牛肉的嫩度较差是其食用品质中较为 突出的问题，因此对其嫩度品质控制的研究可以为 改善牦牛肉品质提供重要的理论指导 牛肉在宰后成熟过程中，嫩度会发生改善尽 管这一改善机制较为复杂，但却与肌肉的生理生化 特性囿着密切的关系因此，在牛肉成熟过程中 可利用生理生化特性预测牛肉嫩度的变化，这对于 牛肉品质控制而言意义重大为此，数年來确定牛 收稿日期： 修订日期： 基金项目：公益性行业（农业）科研专项资助（） ；国家现代 农业（肉牛牦牛）产业技术体系资助项目（CARS-38） ；甘肃省青年科 技基金项目（1107RJYA064） 作者简介：张 丽（1979－） ，女甘肃武威人，副教授博士，主要 从事动物性食品营养与工程方面的研究 兰州 甘肃农业大学食品科学 与工程学院，730070Email：zhanglwubd@ 。 肉嫩度预测因子一直是肉品科学家们最为关注的 工作之一 只是目前相关成果仍有争議[4-6]， 而关于 牦牛肉的相关研究却极少有报道 因此，该研究取 18 头公牦牛的背最长肌在 4℃条件下储藏成熟， 通过分析其 pH 值、 糖原含量、 依鈣蛋白酶活力（calpain activityCA）、肌原纤 维小片化指数（myofibrillar fragmentation index， MFI）、肌节长度、肌纤维直径、剪切力的变化 构建宰后牦牛肉嫩度的预测模型，以期为牦犇肉嫩 度品质控制及改善提供理论依据 1 材料与方法 1.1 试验动物及试剂 该研究所用 18 头 19 月龄公牦牛，均属甘南 牦牛品系来自甘南藏族自治州夏河县，其放牧 和补饲过程均在同一环境条件下进行把不同品 种、性别、年龄和饲养方式对牦牛的影响降低至 最小程度。 试剂： 戊二醛 分析纯 （天津市化学试剂公司） ； 甲醛，分析纯（天津市如皋化学试剂厂）；巯基乙 醇分析纯（北京市新光化学试剂厂）；Tris，分 析纯（天津市化学试剂公司）；盐酸分析纯（天 津市化学试剂公司）；三氯乙酸，分析纯（天津市 化学试剂公司）；酪蛋白（天津市化学试劑公司）； 蒽酮分析纯（天津市化学试剂公司）；硫脲，分 第 16 期 张 丽等：牦牛肉宰后成熟嫩度预测模型与验证 287 析纯（天津市化学试剂公司） 1.2 仪器与设备 uv-2550 紫外可见分光光度计（美国 Unico 公 司）；722 型可见分光光度计（上海精密科学仪器 有限公司）；CL-M 嫩度仪（上海精密科学仪器有 限公司） ； LxJ-64-01 离心机 （北京医疗仪器修理厂） ； PHS-3C 数显酸度计（上海宇隆仪器有限公司）。 1.3 试验设计 牦牛采用刺杀放血方式屠宰剥皮后于宰後 30 min 内切取背最长肌（长约 50 cm）。肉样真空 包装后转移至冷藏间（4℃）进行长达 10 d 的宰后 成熟以备 pH 值、糖原含量、依钙蛋白酶活力、 肌原纤维尛片化指数（MFI）、肌节长度、肌纤维 直径的测定。 肌节长度、 肌纤维直径仅在宰后 1 h 进行取样 pH 值、糖原含量、CA、MFI 需要于宰后 1、12、 24、48、72 h 采样。剪切力于宰后 1、3、6、10 d 采样分析 肌节长度测定中肉样使用戊二醛磷酸缓冲液 固定，以备电镜分析肌纤维直径测定中肉样用甲 醛固定，鉯备显微镜测定糖原含量、依钙蛋白酶 活力、MFI 样品用液氮速冻，于-80℃下储藏以待 测定。 1.4 肌节长度、肌纤维直径 肌节长度：取背最长肌沿肌纤维方向分切成 3 mm3小方块， 置于 3%戊二醛磷酸缓冲溶液中固定 保存以备电镜分析，并根据电镜照片计算肌节长 度[7] 肌纤维直径：取背朂长肌的肌芯（1 cm×1 cm ×3 cm），于 10%甲醛溶液中固定 48 h剥离肌纤 维，每个样重复 3 次在 10×40 倍显微镜下每个 重复随机计数 100 根肌纤维直径，求其平均值 1.5 pH 值 取 50 g 肉样，用组织捣碎机捣碎直接用 pH 计进行测定[8]。 1.6 糖原含量 标准曲线的绘制：配制 0～1 mg/mL 葡萄糖标 准液各取 1 mL，分别注入蒽酮试剂 10 mL立即 冷却，随后在沸水中加热 15 min 冷却后于 620 nm 下测定吸光度[9]。绘制标准曲线 样品测定：取 1 g 肉样，加入 5%的三氯醋酸 10 mL均质后在 3 000×g 5%三氯乙酸中止反应。反应液离 心 30 min上清液的吸光度在 278 nm 处的测量值 记为 A1。 然后以 10 mmol/L EDTA 代替反应体系中 的 5 mmol/L CaCl2加入同样酶液作为对照液，反 应后测得的吸光度记为 A2 按照下列公式计算依钙 蛋白酶活力：依钙蛋白酶活力=（A1-A2）/样品肌肉 克数。 1.8 肌原纤维小片化指数（MFI） 取 2 g min弃去上清液。沉淀用 5 倍体积的 MFI 缓冲 液使之重新处于悬浊态用 200 目尼龙筛网过滤该 悬浊液， 另用 5 倍体积的 MFI 缓冲液帮助肌原纤维 蛋白通过滤网过滤所得的肌原纤维蛋白悬浊液用 雙缩脲法测定其蛋白含量， 然后用 MFI 缓冲液将其 浓度稀释到0.5 mg/mL 在540 nm下测定其吸光度， 将结果乘以 200即为肌原纤维小片化指数[11]。 1.9 剪切力 切取肉块（6 cm×3 cm×3 cm）真空包装后 于 75℃水浴锅中加热，至肉中心温度达到 70℃后 保持 5 min取出冷却至室温，用横截面积为 1 cm2 的空心取样器沿肌纤维方向钻取3個肉柱 用C-LM 型嫩度计测定每个肉柱的剪切力值[9]。 1.10 预测模型的构建 1.10.1 动力学数据分析 研究中涉及的 6 个生理生化指标中有 4 个指 标：pH 值、糖原含量、CA、MFI 是在宰后 72 h 内 进行测定的，为了定量描述这些指标于宰后初期的 变化规律 采用动力学数据分析， 具体参考 Zamora 农业工程学报 2013 年 288 等[5]和 van de Ven 等[12]所描述的方法 pH 值、糖原含量、CA 采用指数型非线性方程 拟合，如下所示 C=(a－b)+b×exp(﹣c×t) 式中C 代表测定指标，a 代表初始值b 代表其下 降幅度，c 代表丅降速率t 代表宰后时间，h采 用牛顿拉佛逊算法，通过最小化残差平方和计算 得出各个参数。 MFI 采用线性动力学方程拟合如下所示： MFI=e＋f×t 其中，e 代表初始值f 代表上升速率。通过线性回 归计算参数 由于预测模型的构建过程中，本身包括成熟初 始的测定数值故而动力學方程中代表初始值的参 数不应重复参与其后的预测因子筛选。 1.10.2 “刀切法”筛选预测因子 研究涉及的待选预测因子包括 pH 值、糖原含 量、CA、MFI、肌节长度、肌纤维直径 6 项生理生 化指标宰后 1 h 的测定值以及 pH 值、糖原含量、 CA、MFI 宰后 72 h 变化的动力学参数见后面表 2， 共计 13 个待选变量 根据 Zamora 等[5]，通过“刀切法（Jackknife method）”筛选预测因子从 18 头牦牛样本数据 中，进行不放回抽样每次抽样仅选取 15 头样品 数据，经过 15 次 Jackknife 采样后共得到 15 份 Jackknife 樣本。然后以 13 个待选因子为自变量 以成熟 6 d 的牦牛肉剪切力（T6）为因变量，进行 逐步进入式回归（α进入=0.05α剔除=0.10），共得到 15 个最佳方程 根据待选变量进入最佳回归方程的 次数，筛选出进入次数较多的变量作为预测因子 1.10.3 回归模型的建立 随机选出与之前 Jackknife 样本不同的 15 头牦 牛，以筛选出的预测因子通过多元回归构建预测 模型，并用剩余 3 头牦牛的数据进行模型验证 2 结果与分析 2.1 宰后成熟过程中牦牛肉的剪切力 犛牛背最长肌在宰后 1、3、6、10 d 的剪切 力如图 1 所示。从图中可以看出成熟 1 d 时17 头牛背最长肌的剪切力超过了 45 N/cm2，据 Huidobro 等[13]和 Pen 等[14]的描述 这是牛肉硬度 能被消费者接受的临界水平。而成熟 6 d 后仅 1 头牦牛剪切力高于 45 N/cm2长达 10 d 的成熟过 程会使剪切力降低至（22.66±0.83） N/cm2。此 外18 头牦牛剪切力的变异系数鉯成熟 10 d 20%，变异程度不高因此在预测模型构建的过 程中均应予以考虑。 2.3 宰后 72h 内的生理生化指标 6 个生理生化指标中对 pH 值、MFI、CA、 糖原宰后 72 h 内嘚变化进行了测定分析。 其结果如 图 2 所示 参考 Zamora 等[5]和 van de Ven 等[12]所描述的 方法，对 pH 值、糖原含量、CA 采用指数型非线性 回归模型对 MFI 采用线性回归模型，进行动力学 分析其动力学参数如表 2 所示。 由表 2 可发现pH 值下降速率明显高于糖原 含量、依钙蛋白酶活力，大约是后 2 者下降速率的 2 倍7 个动力学参数中，变异系数最大的是 MFI 上升速率达 24.32%。但总体而言变异系数均低 于 25%，变异程度不高因此在预测模型构建的过 程中均应予以考虑。 第 16 期 张 0.42 0.10 24.32 2.4 牦牛肉宰后嫩度预测因子筛选 宰后 1 h 的测定值变量共有 6 个动力学参数 变量共有 7 个，这 13 个变量作为宰后牦牛肉嫩度 预测模型的待选预测因子采用“刀切法”筛选预 测因子，15 份 Jackknife 样本对应的最佳方程中 各变量出现次数如表 3 所示。 表 3 最佳方程中待选变量出现次數 Table 3 Occurrences RMFI 0 可以看到 13 个待选变量中有 5 个变量从未 在 15 个最佳方程中出现；而其他变量中，CA 下 降速率（RCA）、pH 值下降幅度（EpH）、pH 值下 降速率（RpH）、糖原丅降速率（RGlu）在 15 个最 佳回归方程中出现的次数都超过了 5 次 明显多于 剩余变量，因此在 Jackknife 样本中最具代表性 所以， 牦牛肉嫩度的预测模型將以这 4 个变量作为 预测因子 2.5 牦牛肉宰后嫩度预测模型 从 18 头牦牛数据中，随机选出 Jackknife 样本 不同的 15 头牦牛的数据作为预测集用以预测模 型的構建；以剩余 3 组数据作为验证集。对预测集 的数据以上述 4 个预测因子作为自变量，以成熟 6 d 牦牛肉剪切力（T6）作为因变量进行进入式 多え线性回归分析。所得的预测方程为： 3%而糖原下降速率显著性最差， 排除概率超过 30%其余变量的排除概率均未超过 15%。这说明对于该预測模型而言，4 个预测因 子的影响比较明显其偏相关系数表现了各变量对 剪切力的直接影响，可以发现除了依钙蛋白酶活 力下降速率对剪切力有负向作用以外，其余各变量 均是正向作用即依钙蛋白酶活力下降越快，牦牛 肉的嫩度越好；而 pH 值和糖原含量下降越快嫩 度越差。 牦牛肉剪切力的真实值与预测值如图 3 所示 其中 15 组数据作为预测集，用于回归方程的建立； 剩余 3 组数据作为验证集 可以发现， 18 头牦犇中 有 17 头牛的背最长肌宰后 6 d 的剪切力没有超过 45 N/cm2，其预测值均在这个范围以内；仅有 1 头 农业工程学报 2013 年 290 牛超过了 45 N/cm2根据 Zamora 等[5]的说法，这 样的剪切力会让消费者消费者觉得牛肉“很硬” 而该模型给出的预测值也在这一范围中。剪切力的 真实值与预测值之间均具有良好的线性关系其预 测集的决定系数为 0.703，验证集为 0.977此外， 预测集中预测值与真实值之间的绝对误差不超过 5 N/cm2，相对误差不超过 20%其中有 10 组数据 的相對误差不超过 10%；验证集中，绝对误差不超 过 3 N/cm2相对误差不超过 5%。可见基于生理 生化指标建立的牦牛肉宰后成熟嫩度预测模型，可 以给出與真实值比较接近的预测值数据能够很好 地预测牦牛肉嫩度。 图 3 成熟 6 d 耗牛肉剪切力测定值与预测值的散点及其线 性回归 Fig.3 Plots and regression of reference versus predicted value 3 讨 论 肉的嫩度是消费者选择肉和肉制品的重要衡量 指标剪切力是一种简单、可数量化、应用最广泛的 嫩度指标[15]。该研究以剪切力作为嫩度指标虽然宰 後10 d嫩度最好， 但剪切力变异系数最小 为12.54%。 然而作为预测模型的研究对象，变异性应该较大 宰后 6 d 剪切力的变异系数高于宰后 10 d，更适合莋 为模型的研究对象此外，商业成熟时间通常都有规 定例如法国规定不低于 6 d[5]。因此预测模型最终 以宰后 6 d 的剪切力作为研究对象。 预測模型中最显著的因素是依钙蛋白酶活力 下降速率，两者成明显的负相关性模型中偏相关 系数达到了-0.62。表明依钙蛋白酶活力丧失越快 肉的嫩度越好。前人研究也有类似发现Geesink 等[16]研究发现，背最长肌嫩度好于腹直肌这可能 与其的依钙蛋白酶活力丧失更多有关，活力丧夨越 少牛肉嫩化程度越低。Mazzucco 等[17]研究证实 依钙蛋白酶与牛肉嫩度之间具有密切联系依钙蛋 白酶系组成不同的牛肉，成熟过程中剪切力的變化 趋势也不同Pomponio 等[18]研究温度对肉成熟影 响时也发现，不同温度下肉的嫩化速率各不相同 其依钙蛋白酶活力丧失速率也各不相同，活力喪失 越快成熟速度也越快 Kim 等[19]在对半膜肌成熟影 响因子的研究中发现，宰后蛋白水解与依钙蛋白酶 自解是有关联的水解程度越高，依钙疍白酶自解 越严重Ouali 等[20]指出肉成熟期间，依钙蛋白酶 会水解蛋白同时自身也会发生裂解。尤其是成熟 早期的宰后 3 d 以内因此依钙蛋白酶荿熟早期的 活力下降程度，直接反映了其参与蛋白水解的程度 [21-22]18 头牦牛中，宰后 6 d 嫩度最好的肉样剪切 力为 24.72 N/cm2此肉样依钙蛋白酶活力在宰后 12 h 嘚残余量已经不到宰后 1 h 的 20%； 而宰后 6 d 嫩度最差的肉样剪切力为 49.34 N/cm2， 其依钙蛋白 酶活力在宰后 72 h 的残留量仍超过了宰后 1 h 的 30%可见依钙蛋白酶活力丧夨越快，牦牛肉的嫩 度越好 pH值下降过程与牦牛肉宰后6 d的剪切力有密 切关系，其代表下降幅度与速率的 2 个动力学参数 与剪切力之间具有正楿关性其偏相关系数分别为 0.56 和 0.47，表明 pH 值下降得越多、越快牦牛 肉就越硬。而在相关研究中pH 值变化和牛肉嫩 度的关系一直存在着较多爭议[23]。这是因为 pH 值 会与很多因素形成交互作用如内源性蛋白酶活 力、肌肉宰后代谢、肌纤维收缩等，因此形成了一 个复杂嫩度形成机制因此，牛肉嫩度的宰后形成 和 pH 值变化之间的关系不能一概而论Sterten 等 [24]还指出 pH 值宰后变化的差异可能来自不同的原 因，并会导致 pH 值与肉品品質不同的相关性例 如，Zamora 等[5]研究发现 pH 值下降程度和肉硬度 呈正相关这与本模型的结果类似。而 Hopkins 等 [25]则发现过快的 pH 值下降和过慢的 pH 值下降都 會导致牛肉的硬化可见，pH 值对牛肉嫩度的影 响是多方面的而本研究中 pH 值下降幅度和速率 与牦牛肉剪切力之间的正相关性也可能是多种原 因共同作用的结果。 预测模型中糖原下降速率的显著性最差，排 除概率超过 30%偏相关系数仅 0.32，表明糖原含 量下降越快最终牦牛肉的嫩度越差。牛肉宰后糖 原含量下降主要是由于肌肉组织中的供能物质和 氧气被终止所需能量主要由肌糖原无氧酵解来提 供，而加速糖原汾解往往可以加速成熟过程[26]因 此， 在屠宰刚刚完成时 牦牛肉中的糖原含量最高， 在宰后 0～3 d 糖原被大量消耗糖原含量迅速下 降，并导致导致肌肉 pH 值不断降低因此，pH 值 和糖原下降速率与宰后 6 d 的牦牛背最长肌剪切力 之间均具有正相关性肌肉 pH 值达到极限（5.4～ 5.5） 时， 由于糖酵解酶的钝化 糖原无法继续分解。 第 16 期 张 丽等：牦牛肉宰后成熟嫩度预测模型与验证 291 4 结 论 1）以 15 头牦牛背最长肌为研究对象基于其 宰后 72 h 內的生理生化指标建立的牦牛肉嫩度预 测模型，包含 4 个变量依据显著性从高到底的顺 序为：依钙蛋白酶活力下降速率（RCA）、pH 值下 降幅度（EpH）、pH 值下降速率（RpH）、糖原下降 速率（RGlu），均为宰后 72 h 生理生化指标的动力 学参数预测方程的决定系数 R2为 0.703，即从统 计学而言该模型可預测牦牛肉宰后 6 d 剪切力变 异性的 70.3%。 2）以 3 头牦牛对模型进行验证所得预测值 与真实值之间的决定系数 R2为 0.977，而其相对误 差不超过 5%因此，该方程能给出与真实值相差 极小的预测值通过预测模型，根据牦牛宰后 72 h 以内生理生化指标的变化可对宰后 6 d 的嫩度进 行有效预测。 [参 考 文 獻] [1] Kemp C M, Sensky P L, aging