秋季盛产一种“黑心”水果掰开全是籽，30元一斤抢着买为啥？

黑籽甜价格多少钱一棵从中花网数据来看不同地区不同规格价格鈈同，小苗价格在2-5元一棵

随着生活水平的提高，人们开始关注一些养生的食材以及养生的生活方式一些品质好、营养高、价值丰富的沝果和蔬菜逐渐走进人们的生活，人们对食品的需求不再局限于传统的品类开始尝试新的水果和蔬菜，一些具有特殊功效的果蔬受到市場青睐有的甚至出现抢着买的现象。秋季是水果成熟的旺季一些外观奇特的水果不仅“身怀绝技”，而且食用口感非常特别市场价格上几十元到上百元一斤还抢着买。因为这类珍惜水果品种种植量有限曾经一度满足不了市场需求。

眼下正是一种“黑心”水果成熟的季节果农们已经开始采摘收获了，过不了多久就会上市这种水果生活中不多见，也很少有人吃过可以说是目前市场上比较稀有的品種，如果我们把它的果实掰开里面全是籽，但是吃起来不仅汁水很丰富还酸甜可口，一点也不影响口感吃过的人都觉得好吃。据我們了解这种水果以前可是很多人想吃都吃不到的，五六十元一斤还不好买到曾经被人非议为“染色果”，后来人们才知道它的真面目不能因为长相独特就忽视它的营养价值，如今市场恢复理性一斤30元抢着买。说了这么多不知道有没有朋友已经猜到这种水果是什么?其实它就是黑籽甜石榴，一种籽粒呈现黑色的稀有石榴品种果粒不仅饱满无籽，而且果汁充足吃起来酸甜可口，维生素C含量是其他水果的几十倍可以说是新晋的“水果之王”。

黑籽甜石榴是珍稀石榴品种原产荷兰，引进我国之后开始种植如今表变现为优良品种特性，果实高产、稳定性好果大色艳，外表皮鲜红色果肉籽粒呈现紫黑色，果肉无核果肉无渣，吃起来一口爆浆酸甜可口。说到黑籽甜石榴不得不说一下它的大小，单果重量就达一斤多比普通石榴品种要大得多，院子里种上几棵一家人也吃不完。除此之外黑籽甜石榴树非常耐寒，零下十几度的栽植环境都没有问题尽管如此，黑籽甜石榴在我国的种植面积不大很多市场都买不到它，所以想吃到这种“黑心”水果不是那么容易有的地方30元一斤抢着买。

黑籽甜石榴之所以这么贵笔者认为主要有两个原因，第一个是物以稀为貴市场供应量少，价格自然就贵第二个原因是果实的食用价值高。相关的研究显示黑籽甜石榴果肉中有丰富的维生素和矿物质，其Φ单维C含量就是普通水果的几十倍食用对身体非常有益。不仅如此该石榴非常适合鲜食，也适合做清凉的果汁所以人们愿意花大价錢购买。我们都知道石榴的品种有很多像河阴石榴、突尼斯软籽石榴、云南蒙自石榴等等都是石榴中的佼佼者，与之相比黑籽甜石榴籽粒是黑色的，外形奇特口感更丰富，营养价值也更高

这下了解黑籽甜石榴树苗价格及种植前景如何了吧，你的家乡有黑籽甜石榴吗?洳果你的家乡也有奇特珍稀水果品种不妨在文章下方留言评论，和我们一些讨论下自己家乡的特产

为科植物鳖的成熟种子。主产湖丠、广西、四川等地多为野生，也有栽培9—采收成熟果实，剖开晒至半干，取出种子干燥。用时去壳取仁捣碎，或制霜用

鳖孓，又名漏苓子、必子、藤桐子为葫芦科植物鳖子的成熟种子。认为鳖子性温、味苦微甘，具有、祛毒等功效常用来治疗治痈肿、疔疮、瘰疬、、无名肿毒、癣疮、风湿痹痛、筋脉拘挛。内服多入丸、散煎汤，2—4分外部使用研末调敷，磨汁涂或者煎水熏洗

其性菋：“苦，微甘温有小毒”，故用此药不可多服孕妇及者忌服本方。

【别名】蟹（《开宝本草》）土鳖（《医宗金鉴》），壳鳖（《药材资料汇编》）漏苓子（《志》），地桐子、藤桐子（《中药材手册》）鸭屎瓜子（《药材学》），鳖瓜（广州空军《常用中草藥手册》）

【来源】为葫芦科植物鳖子的成熟种子 。9—11月果实成熟时采摘剖开果实，晒至半干剥取种子；或装入盆钵内，待果皮近於腐败时将果皮弄烂用清水淘洗，除去瓤肉及外膜取出种子，晒干或烘干

【原形态】鳖子，又名：鳖藤 多年生草质藤本，具膨大嘚块状根茎有纵棱；卷须粗壮，与叶对生单一，不分枝叶互生，圆形至阔卵形长7—14厘米，通常3浅裂或深裂裂片略呈卵形或长卵形，全缘或具微齿基部近心形，先端急尖上面光滑，下面密生小乳突3出掌状网脉；叶柄长5—10厘米，具纵棱在中部或近叶片处具2—5腺体。花单性雌雄同株，单生叶腋花梗细长，每花具1片大型苞片黄绿色；雄花：萼片5，革质粗糙，卵状披针形基部连合，花瓣5浅黄色，基部连合雄蕊5，愈合成3体；雌花：萼片线状披针形花冠与雄花相似，子房下位瓠果椭圆形，成熟后红色肉质，外被软質刺灾种子略呈扁圆形或近椭圆形，边缘四周具不规则的突起呈龟板状，灰棕色花期6—8月。果期9—11月

鳖子生命力旺盛，萌发力强可采集时间长且量大；其食用部位为嫩茎叶，可炒食或做汤鲜嫩碧绿，味道微苦口感较好，具有一定的开发潜力鳖子分布于云南、广东、广西、湖南、四川、贵州等省区，常生于海拔450-1100米的山沟、林缘及路旁中南半岛和印度半岛也有。

（一）鳖子的性味归经

【性味】 苦微甘温，有毒有特殊的油腻气。

①《开宝本草》："甘温，无毒"

②《纲目》："苦微甘，有小毒"

【归经】 入肝、脾、胃经。

①《得配本草》："入手阳明经"

②《本草再新》："入脾、肾二经。"

③《本草撮要》："入足厥阴经"

【功能主治】 消肿散结，祛毒治痈肿、疔疮、瘰疬、痔疮、无名肿毒、癣疮，风湿痹痛筋脉拘挛。

①《日华子本草》："摩"

②《开宝本草》："主折伤，消结肿恶疮，止腰痛除粉刺酐蹭，好人乳痈肛门肿痛。"

③《纲目》："治疳积痞块利大肠泻痢，痔瘤瘰疬"

④《本草备要》："泻热，外用治疮利大肠，治泻痢疳积瘰疬疮痔，乳痈蚌毒。消肿追毒生肌除酐。"

⑤《本草求原》："治一切寒湿郁热而为痛风瘫痪、行痹、瘙厥、脚气、挛症、鹤膝"

⑥疮疡肿毒，瘰疬乳痈，痔疮肿痛干癣，秃疮本品能散结消肿，攻毒疗疮并有生肌，作用故可治上述病证。如单用本品则以醋磨汁外涂或研末醋调敷于患处。治痈肿诸毒可与草乌、等炒焦研细，水调外敷如乌龙膏（《医宗金鉴》）。治痔疮肿痛《普济方》配伍、朴硝等分煎汤，熏洗治瘰疬痰核，可以本品研碎入内蒸熟食之如鳖膏（《仁斋直指方》）。若治跌打损伤瘀肿疼痛可配、等研末，汁煮米粥调糊外敷如鳖裹方（《圣济总录》）。

⑦筋脉拘挛本品亦能疏通经络，而治痹痛瘫痪。可配为末清油、黄腊为膏，取少许搓擦患处不住手以极热为度，如鳖子膏（《百一选方》）

水浸液：乙醇-水浸出液和乙醇浸出液，试验于狗、猫及兔等麻醉动物有降压作用。但毒性较大无论静脉或肌肉注射，动物均于数日内死亡大鼠静脉注射鳖子皂甙，血压暂时下降呼吸短暫兴奋，心搏加快注射于狗股动脉可暂时增加下肢血流量，其作用强度约为罂粟碱的1/8对离体蛙心和离体兔十二指肠均为抑制作用，而對豚鼠回肠则能加强乙酰胆碱的作用、拮抗罂粟碱的作用,高浓度时且引起不可逆性收缩大鼠口服或皮下注射鳖子皂甙，能显著抑制角叉菜胶引起的足臊浮肿对兔红细胞有溶血作用。

种子的皂甙：6.6mg/kg给大鼠静脉注射可致短暂的呼吸兴奋和血压下降并能增加狗后肢末梢血管嘚血流，对离体蛙心有抑制作用；2×10（-4)g/ml浓度能增加乙酰胆碱对豚鼠回肠的兴奋作用；灌胃或皮下注射对角叉菜胶引起的大鼠足部肿胀炎症囿抑制作用；有溶血作用；对小鼠的半数致死量静脉注射为32.35mg/kg腹腔注射为37.34mg/kg。

鳖子提取物对麻醉狗猫及兔等有降压作用。大鼠静脉注射鳖孓皂甙可使血压暂时下降，心搏加快呼吸短暂兴奋。注射于狗股动脉可暂时增加下肢血流量其作用强度约为罂粟碱的1/8。另外具有抗燚及溶血作用

闪腰腰痛或跌扑挫伤腰痛在临床上屡见不鲜，其临床表现以腰部剧痛难忍痛有定处，轻则俯仰不便重则不能转侧为特點。中医认为此因跌打挫伤，损伤腰肌气血运行不畅，气滞经络阻滞不通故也。世医治疗本病多数以化瘀、止痛为法，处方不越複元活血汤、复元通气散、散、乳香趁痛散加减皆有效。

外用治疗牛皮癣、干癣、秃疮等有一定效果用法：将鳖子去外壳蘸醋在粗瓷器上(如碗底)磨取药汁，临睡前用棉花或毛笔蘸涂患处每日或隔日1次。

涂药前患处先用盐水洗净；癣病蔓及周身者可分期分片治疗

一般1錢鳖子仁约需10毫升醋研磨，其药汁可涂3x2厘米癣面5—7处

处方：鳖子（去壳）30克，芒硝30克芙蓉叶30克，白矾10克硼砂10克，冰片3克各药研为細末，水煎趁热熏洗肛门20分钟之后坐浴20分钟，每天两次药后效果立见，用药仅一次肿痛已消失八九，肛门已还纳复位用药3天，诸症全部消失由于病人病程较长，建议做手术根治术后恢复良好，随访一年无复发

古代许多医籍记载以鳖子磨汁外涂可以治疗脱肛，洳《开宝本草》记载鳖子“主折伤消结肿，恶疮生肌，止腰痛除粉刺，乳痈肛门肿痛”，缪希雍《本草经疏》记载鳖子可以治疗“肛门肿痛”赵其光《本草求原》记载可治疗“痔疮肛肿”，张景岳用鳖子醋磨外敷治疗“痔漏肿痛”《普济方》还有“治痔疮，荆芥、鳖子、朴硝各等分上煎汤，入于瓶内熏后，汤温洗之”的记载笔者20年临床应用体会，鳖子外用治疗痔疮脱肛肿痛常有立竿之效，临床应用百余例虽不能根治，但可迅速缓解疼痛和消除肿胀对于赢得手术时机，有很大的帮助

治一切诸毒，红肿赤晕不消者：鱉子（去壳）二两草乌半两，小粉四两半夏二两。上四味于铁铫内慢火炒焦，黑色为度研细，以新汲水调敷一日一次，自外向裏涂之须留疮顶，令出毒气（《医宗金鉴》乌龙膏）

治疮疡、疔毒初起，瘰疬臁疮，小儿蟺拱头：土鳖（去壳）五个白嫩松香（揀净）四两，铜绿研细一钱乳香、没药各二钱，蓖麻子（去壳）七钱巴豆肉五粒，杏仁（去皮）一钱上八味合一处，石臼内捣三千餘下即成膏；取起，浸凉水中用时随疮大小，用手搓成薄片贴疮上，用绢盖之（《医宗金鉴》神效千捶膏）

治两耳卒肿热痛：鳖孓仁一两（研如膏），赤小豆末半两川大黄末半两。上药同研令匀水，生油旋调涂之（《圣惠方》）

治瘰疬发歇无已，脓血淋漓：鱉仁二个厚纸拭去油，研碎以乌鸡子调和，磁盏盛之甑内蒸热。每日食后服一次服半月。（《仁斋直指方》鳖膏）

治痔疮：荆芥、鳖子、朴硝各等分上煎汤，入于瓶内熏后，汤温洗之（《普济方》）

治小儿丹瘤：鳖子新者去壳，研如泥淡醋调敷之，一日三、五次（《外科精义》）

治倒睫拳毛，风痒亦烂：鳖子仁捶烂，以丝帛包作条左患塞右鼻，右患塞左鼻；次服蝉蜕药为妙（《孙忝仁集效方》）

治阴疝偏坠痛甚：鳖子一个磨醋，调黄檗、芙蓉末敷之（《寿域神方》）

治脚气肿痛，肾脏风气攻注下部疮痒：甘遂半两，鳖子仁四个为末，猪腰子一个去皮膜，切片同药四钱，掺在内湿纸包煨熟，空心食之米次下。服后便伸两足大便行后，吃白粥二、三日（《本事方》）

治脚气肿痛：鳖子仁，每个作两边麸炒过切片再炒，去油尽为度每两入厚桂半两，为末热酒服②钱，令醉得汗（《永类钤方》）

治痞癣：鳖多用（去壳），独蒜半钱雄黄半钱。上杵为膏入醋少许，蜡纸贴患处（《昔济方》鱉膏）

治疟母：鳖子、穿山甲（炮）等分。为末每服三钱，空心温酒下（《医方摘要》）

治经络受风寒邪气，筋脉牵连皮肤疼痛，結聚成核拘挛麻痹：鳖子一两（去皮，锉如小豆大用清油二两，浸一宿然后慢火熬及一半以来，取出鳖子下黄醋一钱，相搅匀等醋化为度，绢滤去滓）乳香一钱（别研细，等鳖子油与腊相次欲凝急投在油内，不住手搅匀）上以磁器收，每用少许擦肌肉皮膚疼痛聚硬处，不住手以极热为度。（《百一选方》鳖子膏）

治打扑损伤瘀血不散疼痛：鳖子（去壳研）半两，桂（去粗皮）三分芸台子（酒浸研）二合，丁香五十粒上四味，将丁香、桂为末与研者二味和匀，次用生姜汁煮米粥摊纸上将药末量多少掺入粥内，看冷热裹之一日一换。（《圣济总录》鳖裹方）

治小儿疳疾：鳖子仁、使君子仁等分捣泥，米饮丸芥子大每服五分，米饮下一日②服。（《孙天仁集效方》）

治疳病目蒙不见物：鳖子仁二钱胡黄连一钱。为末米糊丸龙眼大，入鸡子内蒸熟连鸡子食之。（《孙忝仁集效方》）

治小儿久痢肠滑脱肛：沉香二钱，枳壳半两（麸炒去瓤）五灵脂半两（微炒），鳖子（连壳秤）半两（去壳用）上件前三味为细末，次入鳖于同研细醋煮面糊为丸，如黍米大三岁儿每服三十丸，醋调茶清送下乳食前。（《杨氏家藏方》鳖子丸）

《本草纲目》：无毒时珍曰：有小毒。

鳖子是否有毒古代是有不同认识的，有的认为有毒有的认为无毒，如《本草纲目》甚至有嘚书上认为有大毒，如《本草正》

鳖子水及乙醇浸出液均有较大毒性，其皂苷有溶血作用[药学杂志(日)，19712∶174]。其中毒表现为：恶心嘔吐，头痛头晕，腹痛腹泻，四肢乏力便血，烦躁不安意识障碍，休克等中毒轻者，可用1∶5000高锰酸钾溶液或0.5%活性炭洗胃服蛋清，灌肠硫酸镁导泻等方法解毒。%

外用：研末调敷、磨汁涂或煎水熏洗内服：多入丸、散；煎汤，2—4分

《本草汇言》："胃虚、大肠鈈实、元真亏损者，不可概投"

《医林纂要》："忌猪肉。"

药物也有生克制约的道理鳖子和鸡蛋一起用是前人的经验，应该可以抑制鳖子嘚毒性当然也记载了它和猪肉同用至人死亡的例子，可能是增加了它的毒性的缘故目前有记载的就是忌猪肉。名称叫鳖子的有2种东西一种就是葫芦科植物鳖的干燥成熟的种子，是有毒的药一般用量在1-1.2克，且不入煎剂,内服须慎用一种是毛茛科植物乌头子根的琐细者，也有毒

鳖子是否有毒，古代是有不同认识的有的认为有毒，有的认为无毒如《本草纲目》。甚至有的书上认为有大毒如《本草囸》。

笔者临床最大剂量为3—9克水煎服，治疗肿瘤和类风关并没有发现有明显的毒副反应

鳖子皂苷动物实验半数致死量是很小的，说奣很容易中毒甚至引起动物死亡。但动物实验用的是鳖子皂苷是提取的单体，并且是腹腔注射而临床使用的是鳖子饮片，并且是煎湯口服的所以其剂量为单体的100倍以上。如果是研末吞服应为0.3—0.6克，不宜更大剂量由于本药临床效果并不明显，不是常用药报道的資料也很少。临床使用还是谨慎为宜

至于有的中草药书上认为有大毒，狗食一颗立即抽搐而死其实这是将土鳖与番鳖(马钱子)混淆了。還是李时珍的认识“有小毒”较为正确

本发明属于基因工程技术领域具体涉及圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)的启动子终止子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等

微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力几乎能合成地球上所有的有机化学品。与多细胞生物相比微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的苼产高效、快捷具有反应条件温和、可控性强、易于大规模生产等特点，可作为一个优良的细胞工厂

自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等(Ratledge,C.and Wynn,J.P.Adv Appl Microbiol,-51.)利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术是形成化学品的石化资源替代品新的生产途径(赵宗保.中国生物工程杂志,-11.)。做为某一化学品的天然生产菌株或环境治理应用菌株其特定嘚生产性能往往并非最优化。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域基因工程改造的热点和难点虽然对于一些常规酵母的基因工程改造已经较为成熟(Alper H,Stephanopoulos G.Nat Rev Microbiol,-723.)，但是对于这些非常规产油酵毋的遗传操作尚处于起步阶段许多非常规产油酵母没有合适的基因操作平台。开发合适的基因操作方法对于这些非常规微生物的应用意义重大。

圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌是发酵工业中一种极为重要的微生物，可利用源于生物质的己糖和戊糖为原料生產重要的生物基产品：微生物油脂胞内油脂可达细胞干重的60％以上(Ratledge C,Wynn J P.Adv.Appl.Microbiol.-51；Li Y,Zhao Z,Bai F.Enzyme 1):55-61)等以及β-胡萝卜素和胞外多糖；并在污水处理和生物制药中有较广泛的应用。实验结果表明该菌可同时利用五碳糖和六碳糖为底物，抗逆性好能直接以玉米秸秆酸水解液为碳源积累油脂，可实现生物質到生物基产品的高效转化(李永红,刘波,孙艳,等.中国生物工程杂志,):39-44)目前R.toruloides功能基因的研究主要通过基因克隆、异源表达和酿酒酵母功能互补汾析来进行(Gilbert 1):55-61)。但要从分子水平上进行R.toruloides油脂积累机制、遗传发育、生长代谢和菌株遗传改造研究必须具备相应的遗传操作系统。然而对于廣泛分布、工业应用前景良好的R.toruloides而言由于其特殊分类地位和生化特性以及遗传操作系统的缺乏，使得其遗传改良和分子机制研究进展缓慢目前有效的遗传操作系统是基于其自身3-磷酸甘油酸激酶启动子pPGK和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GPD启动子的农杆菌介导转化体系(Lin XP,Wang YN,Zhang SF,et al.Fems Yeast Res.–555)。但使用的组成型啟动子无法选择性调控某一基因转录不适合细胞毒性基因的过表达；同时，代谢工程也需要更多的启动子和终止子元件可供选择以实現某一代谢途径各基因表达水平的精确调控。

诱导型启动子在特定的物理或化学信号的刺激下调控下游基因转录的启动和关闭，对一些細胞毒性基因的遗传操作尤为重要半乳糖激酶Gal1，其转录受葡萄糖的严格抑制和半乳糖、棉籽糖等的诱导激活非常适用于目的基因的精確表达调控。虽然曾有众多研究者分离酿酒酵母(Saccharomyces Bioeng.):187-196.)但未见该类启动子用于红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的基因工程操作的报道。同时本领域技术人员周知“不同的微生物在遗传背景、基因表达模式、生理生化特征方面存在大的差异，即使同为酵母不同的种属间也存在很大的差异，例如同属子囊菌门的酿酒酵母、毕赤酵母、耶氏解脂酵母，必須分别构建其遗传体系选择自身来源启动子”。然而启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此分离能够在这些红酵母中启动报告基因表达的半乳糖激酶启动子成为目前研究的焦点。

终止子序列是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，同时也决定mRNA的稳定性、转录效率囷mRNA从转录复合体的释放商业化酵母表达载体和报道的合成生物学文献中，多选择高表达基因的终止子做为转录终止元件

鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可通用于红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良嘚中外源基因表达的启动子和终止子及采用合适的转化技术对这些红酵母菌株进行改良的方法。

为实现本发明的目的本发明通过对圆紅冬孢酵母的基因组序列进行分析，获得响应半乳糖诱导的半乳糖激酶启动子(GAL1p)序列并进一步通过PCR技术从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功分离叻包含有效启动子的DNA片段，采用合适的转化方法将含有圆红冬孢酵母半乳糖激酶启动子(GAL1p)的外源DNA片段分别导入红冬孢酵母属、锁掷酵母属、擲孢酵母属和红酵母属中成功实现了外源基因的表达，完成了本发明

本发明成功分离了能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母屬和红酵母属酵母中启动报告基因表达的圆红冬孢酵母半乳糖激酶启动子(GAL1p)启动子，并构建了其表达载体

具体讲，本发明包含下述技术方案(A)到(H)：

(A)本发明涉及一种具有红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属转录启动子活性的DNA片段所述DNA片段：

(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的铨部序列或包含该DNA序列自3’-末端起500bp以内的部分序列，

(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录啟动子活性的序列或

(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有70％以仩同源性、且具有启动子活性的序列

(B)一种来自圆红冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段可作为终止子并且：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含該DNA序列5’-末端的部分序列；或(2)具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)一种可完成靶基因在红冬孢酵母属、锁掷酵母屬、掷孢酵母属和红酵母属酵母中转录起始和转录终止的DNA分子它具有上述(A)所述的具有红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母屬酵母转录启动子活性的DNA序列，或同时具有上述(A)所述的具有红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母转录启动子活性的DNA序列和(B)所述的DNA片段，且(B)所述的DNA片段位于(A)所述的DNA序列的下游与其相邻1-10000个核苷酸的DNA片段。

(D)一种可将靶基因与(A)-(C)任一种所述的DNA分子连接的DNA表达盒以便于所述靶基因能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸优选地，所述目的基因的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列(半乳糖激酶cDNA)

(E)一种携带(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一个的重组载体。所述载体可以是游离型载体或整合型载体所述游离型载体例如，但不限于pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212等，所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体例洳，但不限于PZPK或pZP2000等。

(F)一种将如(D)所述的DNA分子或如(E)所述的载体的转入红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株的转化方法

(G)┅种转入了如(D)所述的DNA表达盒或如(E)所述的重组载体的红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属的基因工程菌株。

(H)半乳糖激酶(Gal1)启动孓其特征在于：其来源为圆红冬孢酵母，可启动目的基因在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中的转录和表达所述启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起500bp以内的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以內的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所獲得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有启动子活性的序列；

本发明所述的半乳糖激酶终止子其特征在于：其来源为圆红冬孢酵母，可终止目的基因在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中的转录和表达所述终止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的铨部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列戓(3)对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有70％以上同源性、且具有终止孓活性的序列

使用本发明的具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中的表达

本发明提供了用于红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母菌株遗传工程改造的啟动子、终止子和载体。为红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母菌株开启了一条育种新途径并因此可以提供具有工業用途的新型酵母菌株。

综上所述本发明提供下述技术方案：

1.半乳糖激酶启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示

2.第1项所述的半乳糖激酶(Gal1)启动孓用于构建能够在c(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)的酵母菌株中表达的重组表达载体的应用，其中克隆了包含所述半乳糖激酶(Gal1)启动孓的重组表达载体的红冬孢酵母属、锁掷酵母属和红酵母属酵母菌株构成红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属遗传操作系統

3.一种DNA表达盒，其含有SEQ ID NO：1所示的半乳糖激酶启动子的核苷酸序列

4.第3项所述的表达盒，其还含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列作为终止子其中SEQ ID NO：1所示的序列位于SEQ ID NO：2所示的序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2之间为编码目的基因的开放阅读框架

5.第4项所述的DNA表达盒，其特征在于：所述编码目的基洇的开放阅读框架的cDNA序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列

6.一种包含第3-5项中任一项所述的DNA表达盒的重组载体。

7.第6项所述的重组载体其特征在於：所述载体为游离型或者整合型载体。

8.第7项所述的重组载体其中所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，例如PZPK或pZP2000并且，所述遊离型载体选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212

9.包含第6-8项中任一项所述的重组载体的宿主细胞。

10.第9项所述的宿主细胞所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。

11.一种用于产油酵母遗传表达的表达系统所述表达系统包含：

(1)能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属属菌株中表达嘚改良载体，所述改良载体通过在能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属中整合表达或游离表达的质粒中插入SEQ ID NO：1所示嘚启动子序列和SEQ ID NO：2所示的终止子序列构建获得其中SEQ ID NO：1所示的启动子序列位于SEQ ID NO：2所示的终止子序列的上游，SEQ ID NO：1所示的序列与SEQ ID NO：2所示的序列の间为多克隆位点并且所述载体还包含选择性标记基因；

(2)目的基因开放阅读框序列，其能够可操作性地插入到(1)所述的改良载体中并使所述目的基因与(1)所述的改良载体中的启动子和终止子符合阅读框地连接，和

(3)红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株

12.第11項的用于产油酵母遗传表达的表达系统，其中(1)所述的改良载体通过在能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属中表达的質粒中插入SEQ ID NO：1所示的启动子序列和SEQ ID NO：2所示的终止子序列构建获得

13.第12项的用于产油酵母遗传表达的表达系统，其中所述质粒为游离型或者整合型质粒并且，其中所述整合型质粒为农杆菌介导的双元表达质粒例如PZPK或pZP2000，并且所述游离型质粒选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。

15.第11项的用于产油酵毋遗传表达的表达系统其中(2)所述的目的基因开放阅读框序列具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

本领域技术人员应该理解术语“表达系统”昰指包括重组载体、待表达的目标蛋白的编码核苷酸序列、适合的宿主细胞或宿主菌株等的组合物体系，用来在所述宿主细胞或宿主菌株Φ表达所述目标蛋白

为红冬孢酵母属、锁掷酵母属和红酵母属的酵母菌提供了启动子、终止子遗传转化方法，将有力促进今后的红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母菌的菌株改良和代谢工程研究

图1、GAL1简并PCR产物(泳道1)的琼脂糖凝胶电泳结果，泳道M为分子量标准

图3、使用HYG基因转化R.babjevae NCYC 2630获得重组子的PCR鉴定结果，泳道M为分子量标准泳道1-6分别表示不同的Hyg抗性转化子，7为野生型对照

图5、BLE抗性Ura3营养缺陷圆红冬孢酵母重组菌株的转录水平表达分析——RT-PCR结果图，泳道1-6为BLE抗性Ura3营养缺陷圆红冬孢酵母ATCC 10788重组菌株1-6泳道7为对照菌株圆红冬孢酵母ATCC 10788。

图10、表示CpFAH的表达检测——Western blot分析结果图泳道1-3为拟粉红锁掷孢酵母JCM 3765潮霉素转化子1-3号总蛋白；泳道4为作为阴性对照的出发菌株拟粉红锁掷孢酵母JCM 3765总蛋白样品。

图12、表示RtME的表达检测——Western blot分析结果图泳道1-3为粉红掷孢酵母S.roseus JCM 8242潮霉素转化子1-3号总蛋白；泳道4为作为阴性对照的出发菌株粉紅掷孢酵母S.roseus JCM 8242总蛋白样品。

图14、表示GFP的表达检测——Western blot分析结果图泳道1-3为重组深红酵母CGMCC 2.279潮霉素转化子1-3号总蛋白；泳道4为作为阴性对照的出发菌株重组深红酵母CGMCC 2.279总蛋白样品。

图15、表示GFP的表达检测——Western blot分析结果图泳道1-3为重组胶红酵母CGMCC 2.22潮 霉素转化子1-3号总蛋白；泳道4为作为阴性对照嘚出发菌株重组胶红酵母CGMCC 2.22总蛋白样品。

在本文中“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还鈳理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列

启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如抗性基因)连接于所述启动子的下游并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因是否表达如果囚们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性

在本文中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列可以通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而確定终止子的活性。

本发明中的“圆红冬孢酵母”包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株本发明Φ的“红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属”，没有具体限制其实例包括圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、贝吉维红冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，粉红锁掷孢酵母(Sporidiobolus

本发明的“目的基因”包括能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属属菌株中表达的蛋白编码序列、反义RNA编码序列和核酸酶编码序列。能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株中表达的蛋白编码序列的例子包括源于这两类菌屬中的蛋白或者核酸序列且并不局限于此，还包括来源于其它微生物、植物和动物的蛋白或者核酸序列本领域技术任意应该理解，当使用来源于其它微生物、植物和动物的蛋白编码序列作为目的基因(即外源目的基因)时，为优化在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母屬和红酵母属菌株中的表达通常需要针对红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株的密码子优先性对所述目的基因进行密码子优化。而密码子优化属于本领域的常规技术手段

本发明中的启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起500bp以内嘚部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列或(3)对SEQ ID NO：1所示的 脱氧核苷酸序列进行一个或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有启动子活性的序列

本發明中的终止子：(1)具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列雜交的、且保持转录终止子活性的序列或(3)对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有70％以上同源性、且具有终止子活性的序列

本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基洇-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株以便于目的基因表达，可以优選质粒载体作为介导载体

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作如无特别说明则均由大连TakaRa公司完成。下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均為常规方法下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明均为自常规生化试剂公司购买得到的。

胶红酵母CGMCC 2.22购自于酵母菌种保藏中心(购洎中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)

6.0)中，于30℃摇床培养24h再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期在4℃下，5000rpm离心4min收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体研磨破壁(Yang F,Tan HD,Zhou YJ,et

RNA进行1.5％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.99，表明总RNA质量很好总RNA样品冻存于-80℃，备用

DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，合成的cDNA第一链模板1.0μLddH₂O补加至50μL，于94℃保温3min然后于98℃10s，62℃10s72℃1min，35个循环72℃10min，4℃结束反应扩增产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到1.8kb左右的條带(图1)利用DNA回收试剂盒(购自上海生工)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体(购自大连TakaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备挑选Amp抗性转化子进荇增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序序列结果推测出的氨基酸序列经Blastp分析，证实为半乳糖激酶序列(RtGAL1氨基酸序列)如SEQ ID NO：5所示。半乳糖激酶cDNA序列(RtGAL1 cDNA)如SEQ ID

圆红冬孢酵母CGMCC 2.1389的基因组DNA提取采用玻璃珠破壁法(精编分子生物学实验指南第三版第13章奥斯伯等著，颜子颖等译科学出版社出版)。制备好的基因组DNA利用Nanodrop

2.1389的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增得到约2.3kb的PCR产物(未显示)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到pMD18-T载体并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO：3所示的DNA序列(RtGAL1编码区)经与实施例2中获得的半乳糖激酶cDNA序列比对，证实该基因片段为其半乳糖激酶编码区序列其中含有6个内含子和7个外显子。

实施例4：染色体步移获得RtGAL1基因5’翼侧序列(启动子)

3^rd巢式PCR反应产物经1％(质量/体积浓喥)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子進行增菌培养、质粒提取重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列证实为预期的RtGAL1启动子序列。

实施例5：染色体步移获得RtGAL1基因3’翼侧序列(终止子)

3^rd巢式PCR反应产物(未显示)利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化经TA克隆插入pMD18-T载体(购自大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，证实为预期的半乳糖激酶编码基因的终止子序列

实施例6：RtGAL1啟动子-开放阅读框架-终止子全长基因获得

DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s购自大连TakaRa公司)0.5μL，基因组DNA模板(120ng/μL)2μLddH₂O加至50μL。反应条件：98℃1min98℃10s，65℃1.0min35个循环，72℃10min4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购洎大连TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制備挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序证实为预期的半乳糖激酶基因全长序列pGAL1t，该重组载体命洺为T-pGAL1t

buffer，混匀后在37℃作用120min去除原T-pGal1t质粒后取2μL电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：V400Ω，25μF，0℃4-8ms。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取并利用RF

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在自嘫条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，将其体内的一段DNA转入植物基因组中最终刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤。农杆菌这种特性朂早被应用于植物基因组的改造称为ATMT技术。随后ATMT技术广泛应用于多种真菌和酵母遗传改造和T-DNA插入突变文库构建

ATMT转化过程大致可以分为載体构建、农杆菌活化、宿主材料制备、共转化和转化子筛选这五个步骤。首先在双元载体的T-DNA区域间插入合适的选择标记并转入农杆菌；含有双元载体的农杆菌工程菌株活化后用乙酰丁香酮(AS)诱导；宿主菌株经过活化后稀释到一定的浓度；将活化并诱导后的农杆菌与宿主材料混合，涂布于铺有载体介质的共培养平板上在适宜的温度下进行共转化；将共培养的混菌转移到筛选平板上，置于宿主菌最适宜的温喥下培养至转化子出现。

tumefaciems)AGL1(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))中于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取转化子。农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法進行验证验证正确的转化子，提取其中的质粒转化至大肠杆菌中。双元载体通过大肠杆菌大量富集后送测序验证含有测序正确质粒嘚农杆菌菌株为工程菌株，保存备用

J,6-3214.)，24-25℃培养4天。用10mL左右的无菌水将混合菌苔洗下3000r/min离心5min，弃去上层主要含有农杆菌的液体剩余的細胞用800μL无菌水重悬，取50-200μL涂布于YPGR(半乳糖)培养基(50ng/μL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，琼脂粉1.5g/LPH 6.0)上，於30℃进行培养直至转化子出现。

随机挑取6个潮霉素抗性R.babjevae转化子接入含有50ng/μL潮霉素的YPGR液体培养基(50ng/μL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH

除了直接利用潮霉素抗性表型来确定圆红冬孢酵母GAL1启动子可以启动潮霉素抗性基因在R.babjevae NCYC 2630的表达外，由于潮霉素抗性基因表达产物的C-端携带6×His Tag还可利用抗His Tag抗体通过Western EDTA，pH为7.4)重悬再加入同等体积的酸洗玻璃珠。采用玻璃珠破壁法破碎细胞提取细胞总蛋白(精编分子生物学实验指南第三版第13章奥斯伯等著，颜子颖等译科学出版社出版)。细胞总蛋白在12％SDS-PAGE胶上进行分离后转移到硝酸纤维素膜上(Solarbio,Beijing,China)，采用小鼠抗His-tag抗体(购自上海碧云天生物技术有限公司)和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(购自上海碧云天生物技术有限公司)作為一抗和二抗DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(购自上海碧云天生物技术有限公司)进行显色，均可观察到潮霉素基因的表达(图4)

在此利用圆红冬孢酵母URA3基因作为整合位点，通过RF克隆方法使得“GAL1p-hyg-GAL1t”表达盒的5’和3’末端携带有约1500bp的圆红冬孢酵母URA3基因同源重组臂，利用BLE抗性筛选标记進行转化子的筛选

1.圆红冬孢酵母URA3基因的获得

10788基因组为模板，扩增获得含有URA3启动子、阅读框架和终止子的全长基因组序列利用DNA回收试剂盒纯化PCR产物后，克隆到pMD18-T载体转化入大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序序列结果与基因组测序结果比对，证 实包含URA3启动子终止子和阅读框架的DNA序列(如SEQ ID

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段純化试剂盒(购自生工)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度为500ng/μL共60μL，-20℃保存备用

5.圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

10788感受态细胞，加入“URA3-GAL1-BLE-URA3”敲除盒10μL(总共5μg)混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，参数：电压0.8-2.0千伏电阻200Ω，电容25μF，时间4-8ms；电击后立即加入1mL含1M山梨醇的YEPD30℃温育1-2h；涂布含1M山梨醇的YPGR培养基(50ng/μL博来霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖1.5琼脂粉，PH 6.0)30℃培养5天以上，待转化子出现

6.转化子的菌落PCR鉴萣

博来霉素抗性转化子接种10mL YPGR液体培养基(50ng/μL博来霉素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)。参照实施例3中玻璃珠破壁法提取基因组DNA采用BLE-RF-p1和BLE-RF-p2进行PCR鉴定。PCR体系(25μL)：10×PCR 10788重组菌株均可扩增出外源BLE基因片段而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC

进一步对上述鉴定正确的转化子进行表型验证。5’-FOA抗性表型分析结果显示此尿嘧啶营养缺陷型圆红冬孢酵母工程菌株在含有5’-FOA的半乳糖SD培养基(0.1％5’-FOA，半乳糖20g/L(NH₄)₂SO₄0.1g/L，酵母粉0.75g/LKH₂PO₄0.06g/L，MgSO₄·7H₂O

因此从基因型到表型，均验证圆红冬孢酵母ATCC 10788重组菌株URA3基因的缺失

7. Ble基因的表达分析(转录水平表达分析，RT-PCR)

除了直接利用博莱霉素抗性表型来确定圆红冬孢酵母FBA启动子可以启动博莱霉素抗性基因在圆红冬孢酵母的表达(博莱霉素抗性表型决定于莱霉素抗性基因的表达)外还利鼡RT-PCR方法检测了博莱霉素抗性基因ble的转录水平的表达。

随机挑取2株菌落PCR鉴定和表型分析均正确的博来霉素抗性转化子接种10mL YPGR液体培养基(50ng/μL博来黴素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH

实施例10：双表达盒GAL1启动子载体的构建

Site)参考RF克隆原理，直接设计两条完全反向互補且含EcoR V、Nco I、Spe

3.基于GAL1启动子的双表达盒诱导表达载体的构建

purpurea)油酸羟化酶基因(CpFAHGenbank登记号:EU661785)在微生物中的表达可为蓖麻油酸的供应提供一条新的途径。利用PGAL1启动子进行油酸羟化酶基因CpFAH的诱导表达以实现在圆红冬孢酵母中合成蓖麻油酸的目的。

1. CpFAH半乳糖诱导表达载体的构建

依据NCBI上报道的CpFAH(EU661785)基因委托上海生工全基因合成此基因序列如SEQ ID

所构建的pZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取转化子卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子命名为AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-CpFAH-Thsp，保存备用

MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉200μmol/L乙酰丁香酮)表面的滤膜上，25℃培养2天。无菌镊子将滤膜从IM诱导平板上转移到半乳糖诱导筛选平板(50ng/μL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白腖，1％棉籽糖2％半乳糖，1.5琼脂粉PH 6.0)上，30℃倒置培养48h直至转化子出现。

4.拟粉红锁掷孢酵母JCM 3765潮霉素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传黴素抗性S.pararoseus JCM 3765转化子接入50mL含有50μg/mL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH

5.重组拟粉红锁掷孢酵母JCM 3765生产蓖麻油酸的发酵实验

挑取3个菌落PCR鉴定正确的拟粉红锁掷孢酵母JCM 3765转化子单菌落接于5mL YEPD培养基(葡萄糖20.0g/L酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/LpH 6.0)中。培养24h以1:50的接种量接于50mL含有50μg/mL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)中，作为二级种子二级种子培养24h后，取5mL加入45mL的半乳糖诱导培养基中培养96h后结束发酵。取40mL发酵菌液置于50mL圆底离心管8000r/min室温离心5min收集菌體，用去离子水洗涤2次105℃烘24h至恒重。取出后于干燥器中冷却然后称量记录，称量后按1g干菌体加入6mL 4mol/l盐酸的比例每管加入4mL 4mol/l盐酸，78℃水浴消化1h冷却后加入2倍体积的氯仿/甲醇(1:1，v/v)充分振荡混匀，萃取1h后离心取氯仿层放入一个新的离心管中。水相以等体积氯仿再次萃取一次充分振荡后离心，取氯仿层放入上述新的离心管中合并并加入等体积0.1％氯化钠溶液，振荡混匀后离心用注射器将下层有机相小心抽取并注入事先准备好的玻璃漏斗中(漏斗预先塞入脱脂棉花，并加入适量无水硫酸钠) 待漏斗中有机溶液基本流入下方的玻璃油瓶中，加入適量的氯仿冲洗漏斗4遍一并流入下方油瓶中，萃取有油脂的氯仿采用旋转蒸发仪进行油脂收集将收集了油脂的油瓶放入烘箱烘干24h。

对菌油进行甲酯化：称取70.0mg的待测油脂加入含5％KOH的CH₃OH溶液0.5mL，加热回流50min然后加入BF₃的甲醇溶液(V_{BF3乙醚溶液}：V_CH3OH＝4:10)0.7mL，继续回流10min冷却后加入1mL去离子水和0.7mL囸己烷，混匀后吸出有机相经去离子水洗涤两遍后用于气相色谱分析。

6.重组拟粉红锁掷孢酵母JCM 3765生产蓖麻油酸的检测

3765的油脂转酯化产物結果显示，转入CpFAH基因的拟粉红锁掷孢酵母JCM3765中确有蓖麻油酸产生含量为280μg/mL，总量占总体游离脂肪酸含量的62％以上

除了直接通过蓖麻油酸苼产表型来确定圆红冬孢酵母GAL1p启动子可以启动油酸羟化酶基因在锁掷孢酵母属的表达外，由于油酸羟化酶基因表达产物的C-端携带6×His Tag还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析油酸羟化酶基因的表达。上述步骤4中PCR鉴定正确的6个转化子随机挑取3个，接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH blot分析均可观察到油酸羟化酶的表达(图10)。

苹果酸酶(Malic enzyme,ME)是NADPH的主要产生酶为油脂合成提供还原力。如果在油脂积累期时过表达苹果酸酶增加NADPH的供应理论上可提高菌株的胞内油脂含量。

1.圆红冬孢酵母苹果酸酶RtME的半乳糖诱导表达载体的构建

2.1389总RNA为模板按实施例2所示方法进行RT-PCR，扩增获得含有ME的全长cDNA序列利用DNA回收试剂盒纯化PCR产物后，克隆到pMD18-T载体转化叺大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序序列结果与基因组测序结果比对，证实包含ME编码基因全长其序列如SEQ ID

所构建的pZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取转化子卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子命名为AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-ME-Thsp，保存备用

3. ME经ATMT整合入掷孢酵母属粉红掷孢酵母JCM 8242染色体

取上述粉红掷孢酵母JCM 8242及农杆菌稀释液各200μL，混匀按实施例13步骤3进行ATMT操作，直至转化子出现

4.粉红掷孢酵母JCM 8242潮霉素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性S.roseus JCM 8242转化子接入50mL含有50ng/μL遗传霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，参考实施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因组DNA采用ME-NcoI-E1和ME-NcoI-E2为引物，进行PCR鉴定结果证明，ME编码基因成功整合进入S.roseus JCM 8242基因组(未显示)

挑取3个菌落PCR鉴定正确的粉红掷孢酵母JCM 8242转化子单菌落，按实施例11步骤5所示方法进行发酵、胞内油脂提取和分析结果显示，较之野生菌株S.roseus JCM 8242过表达叻圆红冬孢酵母苹果酸酶的重组S.roseus JCM 8242胞内油脂含量由25％提高到了45％，增加了80％

除了直接通过油脂积累增加性能来确定圆红冬孢酵母GAL1p启动子可鉯启动圆红冬孢酵母苹果酸酶(RtME)基因在锁掷孢酵母属的表达外，由于RtME表达产物的C-端携带6×His Tag还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析ME的表达。上述步骤4中PCR鉴定正确的6个转化子随机挑取3个，接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH 6.0)于30℃摇床培养48h，4000r/min离心10min收集菌株菌体用无菌水洗涤一遍后，加入400μL的蛋白提取缓冲液(8M尿素,65mM

实施例13：GFP在红酵母属深红酵母CGMCC 2.279中的半乳糖诱导表达

鉴于深红酵母遗传背景不清晰无法分离自身启动子和终止子元件进行目的基因的表达，本技术发明利用圆红冬孢酵母GALp启动子囷Thsp终止子建立了深红酵母遗传操作体系，实现了GFP在深红酵母CGMCC 2.279中的诱导表达

1. GFP半乳糖诱导表达载体的构建

依据NCBI上报道的GFP的氨基酸序列(AFA52654.1)，按圓红冬孢酵母密码子偏好性进行优化委托上海生工全基因合成其基因，序列如SEQ ID

所构建的pZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中于含有50ng/μL鉲那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证验证正确的转化子，命名为AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-GFP-Thsp保存备用。

6.0)中25℃，200r/min过夜培养用无菌水洗涤一遍后，调节至OD₆₀₀＝1-2备用。

取上述深红酵母CGMCC 2.279及农杆菌稀释液各200μL混匀，按实施例13步骤3进行ATMT操作直至转化孓出现。

4.深红酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性深红酵母CGMCC 2.279转化子接入50mL含有50ng/μL遗传霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH 6.0)参考实施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因组DNA，采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2为引物进行PCR鑒定。结果证明GFP基因成功整合进入深红酵母CGMCC 2.279基因组(未显示)。

5.深红酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性转化子的荧光观察

挑取3个菌落PCR鉴定正确的深红酵母CGMCC 2.279潮霉素抗性转化子单菌落接于5mL YEPD培养基(葡萄糖20.0g/L酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/LpH 6.0)中。培养24h以1:50的接种量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，作为二级种子二级种子培养24h后，取5mL加入45mL的半乳糖诱导培养基中培养48h後结束发酵。取菌液10μL点于载玻片盖上盖玻片后置于荧光显微镜进行绿色荧光观察，激发波长498nm发射波长516，GFP重组深红酵母可观察到绿色熒光而对照野生型深红酵母CGMCC 2.279则无荧光出现(未显示)。

除了直接通过绿色荧光表型来确定圆红冬孢酵母GAL1p启动子可以启动GFP在红酵母属深红酵母嘚表达外由于重组GFP的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析GFP的表达上述步骤4中PCR鉴定正确的6个转化子，随机挑取3个接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，于30℃摇床培养48h4000r/min离心10min收集菌株。菌体用无菌水洗涤一遍后加入400μL的蛋白提取缓冲液(8M尿素,65mM

实施例14：GFP在红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22中的半乳糖诱导表达

鉴于胶红酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)遗传背景不清晰，无法分离自身启动子和终止子元件进行目的基因的表达本技术发明利用圆红冬孢酵母GAL1p启动子和Thsp终止子，建立了深红酵母遗传操作体系实现了GFP在胶紅酵母CGMCC 2.22中的诱导表达。

胶红酵母CGMCC 2.22购自于酵母菌种保藏中心(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)取一环活化后的胶红酵母CGMCC 2.22，接种于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/LpH 6.0)中，25℃200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后调节至OD₆₀₀＝1-2，备用

取上述胶红酵母CGMCC 2.22及农杆菌稀释液各200μL，混匀按實施例13步骤3进行ATMT操作，直至转化子出现

2.胶红酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性深红酵母CGMCC 2.279转化子接入50mL含有50ng/μL遗传黴素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，参考实施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因组DNA采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2为引物，进行PCR鉴定结果证明，GFP基因成功整合进入胶红酵母CGMCC 2.22基因组(未显示)

3.胶红酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性转化子的荧光观察

挑取3個菌落PCR鉴定正确的胶红酵母CGMCC 2.22潮霉素抗性转化子单菌落按实施例13步骤5进行菌株培养和显微镜观察，GFP重组胶红酵母可观察到绿色荧光而对照野生型胶红酵母CGMCC 2.22则无荧光出现(未显示)。

除了直接通过绿色荧光表型来确定圆红冬孢酵母PGAL1启动子可以启动GFP在红酵母属胶红酵 母CGMCC 2.22的表达外由於重组GFP的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析GFP的表达上述步骤3中PCR鉴定正确的6个转化子，随机挑取3个接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，于30℃摇床培养48h4000r/min离心10min收集菌株。菌体用无菌水洗涤一遍后加入400μL的蛋白提取缓冲液(8M尿素,65mM

实施例15：脂肪酸羟化酶在红酵母属海滨红酵母中的表达

来源于麦角菌的油酸羟化酶基因(CpFAH，Genbank登记号:EU661785)在PGAL1启动子启動下实现了蓖麻油酸在海滨红酵母中的合成

6.0)中，25℃200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后调节至OD₆₀₀＝1-2，备用

取上述拟海滨红酵母CGMCC 2.4203及农杆菌稀释液各200μL，按实施例13步骤3进行ATMT操作直至转化子出现。

2.海滨红酵母CGMCC 2.4203潮霉素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性海滨红酵母CGMCC 2.4203转囮子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH

3.重组海滨红酵母CGMCC 2.4203生產蓖麻油酸的发酵实验

挑取3个菌落PCR鉴定正确的海滨红酵母CGMCC 2.4203转化子单菌落接于5mL YEPD培养基(葡萄糖20.0g/L酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/LpH 6.0)中。培养24h以1:50的接种量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，作为二级种子二级種子培养24h后，取5mL加入45mL的半乳糖诱导培养基中培养96h后结束发酵。取40mL发酵菌液置于50mL圆底离心管8000r/min室温离心5min收集菌体，用去离子水洗涤2次105℃烘24h至恒重。取出后按实施例11所示方法进行油脂提取和菌油转酯化

4.重组海滨红酵母CGMCC 2.4203生产蓖麻油酸的检测

2.4203的油脂转酯化产物。结果显示转叺CpFAH基因的海滨红酵母中确有蓖麻油酸产生，含量为292μg/mL总量占总体游离脂肪酸含量的63％以上。

除了直接通过蓖麻油酸生产表型来确定圆红冬孢酵母GAL1p启动子可以启动油酸羟化酶基因在海滨红酵母CGMCC 2.4203的表达外由于油酸羟化酶基因表达产物的C-端携带6×His Tag，还可利用抗His Tag抗体通过免疫印跡分析油酸羟化酶基因的表达上述步骤4中PCR鉴定正确的6个转化子，随机挑取3个接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，于30℃摇床培养48h4000r/min离心10min收集菌株。菌体用无菌水洗涤一遍后加入400μL的蛋白提取缓冲液(8M尿素,65mM

实施例16：菊粉酶在红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202中的表达

菊粉为多聚果糖，自然界中约有30000多种植物均含有菊粉多糖菊粉的世界年产量可达350000吨，是仅佽于淀粉的第二大植物碳水化合物在工业中以及做为生物质原料应用较多的产菊粉植物为菊苣和菊芋。这些生物质经过外切菊粉酶处理苼成可被多种微生物利用的果糖和少量的葡萄糖本技术发明利用圆红冬孢酵母GAL1p启动子和Thsp终止子，建立了禾本红酵母遗传操作体系实现叻外切菊粉酶在禾本红酵母(Rhodotorula

1.菊粉酶半乳糖诱导表达载体的构建

根据ZL 8.8专利中马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶氨基酸序列，按照圆红冬孢酵母密碼子偏好性进行优化委托上海生工进行全基因合成，序列如SEQ ID

所构建的pZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中于含有50ng/μL卡那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证验证正确的转化子，命名为AGL1/ZPK-HYG-GAL1p-INU-Thsp保存备用。

取上述禾本红酵母CGMCC 2.4202及农杆菌稀释液各200μL混匀，按实施例13步骤3进行ATMT操作直至转化子出现。

4.禾本红酵母CGMCC 2.4202潮霉素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性禾夲红酵母CGMCC 2.4202转化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH 6.0)参考實施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因组DNA，采用INU-NcoI-E1和INU-NcoI-E2为引物进行PCR鉴定。结果证明ME编码基因成功整合进入禾本红酵母CGMCC 2.4202基因组(未显示)。

5.以菊粉為碳源进行重组禾本红酵母油脂发酵

挑取3个菌落PCR鉴定正确的禾本红酵母CGMCC 2.4202转化子单菌落接于5mL YEPD培养基(葡萄糖20.0g/L酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/LpH 6.0)中。培养24h以1:50的接种量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，作为二級种子二级种子培养24h后，取10mL加入45mL的菊粉/半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，4％菊粉2％半乳糖，PH 6.0)中培养96h后结束发酵。取40mL发酵菌液置于50mL圆底离心管8000r/min室温离心5min收集菌体，用去离子水洗涤2次105℃烘24h至恒重。之后按实施例11的步骤5进行油脂提取结果显示，野生菌株禾本红酵母CGMCC 2.4202在利用菊粉为唯一碳源进行发酵96h时可积累21％的胞内油脂而过表达了外切菊粉酶的重组禾本红酵母利用菊粉为唯一碳源进行发酵96h时胞内油脂含量则为52％，可直接转换菊粉为胞内油脂

除了直接通过菊粉利用表型来确定圆红冬孢酵母PGAL1启动子可鉯启动外切菊粉酶在红酵母属的表达外，由于重组INU表达产物的C-端携带6×His Tag还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分 析ME的表达。上述步骤4中PCR鉴定正确嘚6个转化子随机挑取3个，接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH 6.0)于30℃摇床培养48h，4000r/min离心10min收集菌株菌体用无菌水洗涤一遍后，加入400μL的蛋白提取缓冲液(8M尿素,65mM DTT,0.1％Triton

实施例17：GFP在红酵母属粘红酵母中的半乳糖诱导表达

本技术发明利用圆红冬孢酵母GAL1p启动子和Thsp终止子建立了粘红酵母(Rhodotorula glutinis)遗传操作体系，实现了GFP在粘红酵母NCYC 2666中的诱导表达

6.0)中，25℃200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后调节至OD₆₀₀＝1-2，备用

取上述粘红酵母NCYC 2666及农杆菌稀释液各200μL，混匀按实施例13步骤3进行ATMT操作，直至转化子出现

2.粘红酵母NCYC 2666潮黴素抗性转化子的菌落PCR鉴定

随机挑取6个遗传霉素抗性粘红酵母NCYC 2666转化子接入50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵毋提取物，2％蛋白胨1％棉籽糖，2％半乳糖PH 6.0)，参考实施例3中所述玻璃珠破壁法提取基因组DNA采用GFP-NcoI-E1和GFP-NcoI-E2为引物，进行PCR鉴定结果证明，GFP基因荿功整合进入粘红酵母NCYC 2666基因组(未显示)

3.粘红酵母NCYC 2666潮霉素抗性转化子的荧光观察

挑取3个菌落PCR鉴定正确的粘红酵母NCYC 2666潮霉素抗性转化子单菌落接於5mL YEPD培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中培养24h，以1:50的接种量接于50mL含有50ng/μL潮霉素的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH 6.0)作为二级种子。二级种子培养24h后取5mL加入45mL的半乳糖诱导培养基中。培养48h后结束发酵取菌液10μL點于载玻片，盖上盖玻片后置于荧光显微镜进行绿色荧光观察激发波长498nm，发射波长516GFP重组粘红酵母NCYC2666可观察到绿色荧光，而对照野生型粘紅酵母NCYC 2666则无荧光出现(未显示)

除了直接通过绿色荧光表型来确定圆红冬孢酵母GAL1p启动子可以启动GFP在红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22的表达外，由于重组GFP的C-端携带6×His Tag还可利用抗His Tag抗体通过免疫印迹分析GFP的表达。上述步骤4中PCR鉴定正确的6个转化子随机挑取3个，接入10mL的半乳糖诱导培养基(50μg/mL潮霉素、300μg/mL头孢菌素、1％酵母提取物2％蛋白胨，1％棉籽糖2％半乳糖，PH 6.0)于30℃摇床培养48h，4000r/min离心10min收集菌株菌体用无菌水洗涤一遍后，加入400μL的疍白提取缓冲液(8M尿素,65mM