谷氨酸棒杆菌分枝菌酸的提取、纯化及结构分析--《江南大学》2012年硕士论文
谷氨酸棒杆菌分枝菌酸的提取、纯化及结构分析
【摘要】：谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)是微生物工业发酵生产氨基酸的主要菌株,其细胞壁中都存在一种特殊的脂肪酸——分枝菌酸。分枝菌酸的存在大大降低了细胞壁的通透性,与氨基酸分泌密切相关。因此,研究分枝菌酸结构特点,对改造这些菌株的通透性具有重要意义。本论文针对三种野生菌株(C. glutamicum ATCC 13032、B. lactofermentum ATCC 14047和B. flavum ATCC 14067)和两种生产菌株(IWJ-1和VWJ-1)研究了分枝菌酸的分离提纯方法和结构多样性。主要结果如下:
1)优化了细菌分枝菌酸的分离提纯方法,建立了适用于分枝菌酸的薄层层析检测方法。纯化了上述五种菌株中的分枝菌酸,并用薄层层析进行了分析比较。
2)采用ESI/MS分析比较了上述五种菌株中分枝菌酸的结构。发现这些菌株均含有二十多种分枝菌酸,它们在碳链长度(22-38个碳)和饱和度(0-3个双键)方面存在差异;不同菌株所含分枝菌酸的组成比例也不同。通过对含量最高的三种结构分枝菌酸(m/z 495.4、521.4和547.5)进行ESI/MS/MS分析,发现其两条脂肪酸链的长度相似(14-18个碳),且双键大多位于主链上。
3)考察了细菌生长温度对其分枝菌酸结构的影响。发现当温度升高时,短链分枝菌酸的相对强度增加,且饱和分枝菌酸的比例增加。
4)研究了细菌生长不同阶段分枝菌酸组成的变化规律。发现短链饱和分枝菌酸(m/z 355.2、411.2和439.3)的相对强度随培养时间的延长先降低后升高,饱和分枝菌酸(m/z 495.3)的相对强度随时间先升高后降低,而有些非饱和分枝菌酸(m/z 437.2和547.3)只出现在稳定期。
5)考察异烟肼添加对细菌分枝菌酸结构的影响。发现异烟肼添加可以提高细胞生长速率。添加6mg/L异烟肼时,短链分枝菌酸(m/z 315.2、383.3、411.3、439.4和467.4)和饱和的分枝菌酸(m/z 383.3、411.3、439.4、467.4和537.4)的相对强度明显变小,而非饱和分枝菌酸(如m/z 521.4和547.4)相对强度明显增大。
【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：TQ922.1【目录】：
摘要3-4Abstract4-7第一章 引言7-15 1.1 谷氨酸棒杆菌细胞壁结构7-8 1.2 细胞壁对氨基酸分泌的影响8
1.2.1 细胞膜与氨基酸分泌8
1.2.2 分枝菌酸与氨基酸分泌8
1.2.3 细胞壁对细胞物理行为的重要性8 1.3 分枝菌酸的结构及合成过程8-12
1.3.1 分枝菌酸的结构9-10
1.3.2 分枝菌酸的合成过程10-12 1.4 分枝菌酸的分离纯化方法和结构分析方法12-13
1.4.1 薄层层析色谱（TLC）的原理与应用12
1.4.2 ESI/Q-TOF 质谱仪的原理与应用12-13 1.5 立题背景与意义13 1.6 课题研究内容和研究目标13-15第二章 实验材料与方法15-22 2.1 实验材料15-17
2.1.1 菌株及引物15
2.1.2 培养基及用途15
2.1.3 主要仪器15
2.1.4 主要试剂15-17 2.2 分子生物学基础实验操作17-18
2.2.1 基因组的提取17
2.2.2 50 μl PCR 反应体系17
2.2.3 1%琼脂糖凝胶电泳17-18
2.2.4 PCR 产物的纯化回收18 2.3 谷氨酸棒杆菌中分枝菌酸的提取18-19
2.3.1 谷氨酸棒杆菌中总分枝菌酸的提取18-19
2.3.2 谷氨酸棒杆菌中游离态分枝菌酸和结合态分枝菌酸的提取方法19 2.4 分枝菌酸薄层层析检测条件优化19-20
2.4.1 展层剂的选择19
2.4.2 上样量的选择19-20
2.4.3 展层次数的选择20
2.4.4 显色剂的选择20 2.5 分枝菌酸ESI/MS 检测20 2.6 分枝菌酸与脂肪酸的DEAE 分离20 2.7 考察不同温度下分枝菌酸的结构变化20-21 2.8 考察添加异烟肼对分枝菌酸的影响21 2.9 分枝菌酸合成的关键基因pks, pccB, fadD32 测序21 2.10 考察不同培养时间下分枝菌酸的结构变化21-22第三章 结果与讨论22-42 3.1 分枝菌酸的薄层层析检测22-25
3.1.1 展层剂的确定22-23
3.1.2 上样量的确定23
3.1.3 展层次数的确定23-24
3.1.4 显色剂的确定24-25
3.1.5 五种菌株的TLC 检测结果25 3.2 五种菌株分枝菌酸的ESI/MS 分析25-31
3.2.1 纯化的分枝菌酸ESI/MS 结果25-29
3.2.2 分枝菌酸的ESI/MS/MS 检测分析29-31 3.3 游离态分枝菌酸与结合态分枝菌酸的分析结果31-33 3.4 不同因素对分枝菌酸结构的影响33-40
3.4.1 不同温度下分枝菌酸的结构变化33-35
3.4.2 不同培养时间的分枝菌酸结构变化35-36
3.4.3 添加INH 时分枝菌酸的结构变化36-40 3.5 分枝菌酸与脂肪酸的DEAE 分离40-42第四章 结论和展望42-44 4.1 结论42 4.2 展望42-44致谢44-45参考文献45-51附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文51
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京公网安备75号谷氨酸棒杆菌高产琥珀酸的代谢工程改造--《天津大学》2013年博士论文
谷氨酸棒杆菌高产琥珀酸的代谢工程改造
【摘要】：本文围绕琥珀酸的生物合成，以野生型谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum ATCC13032为出发菌株进行系统代谢工程改造，构建了一系列能够在厌氧和好氧条件下高效生产琥珀酸的突变株。通过中心碳代谢的比较分析和单基因敲除分析对琥珀酸厌氧合成的途径进行了鉴定。采用干实验基元模式分析和湿实验代谢通量分析相结合的方式鉴定出基因靶点并进行改造，通过发酵和通量分析验证靶点预测的准确性。利用两阶段高密度发酵的方式来提高琥珀酸的浓度。另一方面，通过引入枯草芽孢杆菌的乙酸利用途径减少好氧条件下乙酸的积累。同时过表达柠檬酸合酶减少丙酮酸的积累，增加TCA循环的通量。最后，通过分批补料的培养方式评价好氧生产琥珀酸的可行性。得到的主要结果如下：
对C. glutamicum ATCC13032进行了厌氧生产琥珀酸的途径鉴定。比较C.glutamicum ATCC13032和自然界中分离的琥珀酸生产菌株的中心代谢途径，通过理性分析得到潜在的影响琥珀酸合成的基因靶点。通过单基因敲除和厌氧发酵，证明了野生型C. glutamicum ATCC13032在厌氧条件下利用TCA还原臂合成琥珀酸。采用组合敲除策略，敲除乳酸脱氢酶、乙酸激酶、磷酸转乙酰酶、丙酮酸氧化还原酶和乙酰辅酶A转移酶后，突变株C. glutamicum SAZ1的乙酸产量显著降低，琥珀酸得率为0.99mol (mol glucose)-1。
基于基因组尺度规模的谷氨酸棒杆菌模型，构建了一个精简的中心碳代谢网络模型，通过基元模式分析和突变株C. glutamicum SAZ1的代谢通量分析，鉴定出三个基因靶点：回补反应、乙醛酸循环和柠檬酸合酶。根据预测依次改造并发酵验证。进一步过表达琥珀酸输出蛋白得到突变株C. glutamicum SAZ2（pEpycgltAsucE，pXaceAB），琥珀酸得率为1.43mol (mol glucose)-1。它的通量分布与最佳通量分布更为接近。通过胞内代谢物测定分析，发现是由于胞内的琥珀酸含量下降，从而减轻了对乙醛酸循环的抑制作用。采用高密度厌氧发酵，琥珀酸产量达到930mM （110g L-1），得率为1.32mol (mol glucose)-1，生产率为9.48mM h-1。
失活琥珀酸脱氢酶复合体、乙酸和乳酸生成途径，过表达丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，引入来自于枯草芽孢杆菌的乙酸利用途径，过表达自身的柠檬酸合酶后，突变株C. glutamicum ZX1(pEacsAgltA)在好氧条件下的琥珀酸得率为0.61mol (mol glucose)-1。在分批补料好氧培养过程中，琥珀酸浓度达到241mM （28g L-1），得率为0.63mol (mol glucose)-1。通过引入外源阿拉伯糖利用途径，突变株能够在好氧条件下利用阿拉伯糖为唯一碳源生产琥珀酸。
【关键词】：
【学位授予单位】：天津大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2013【分类号】：TQ922.1【目录】：
中文摘要3-4ABSTRACT4-11第一章 文献综述11-29 1.1 琥珀酸的理化性质、功能、用途及市场需求11-12
1.1.1 琥珀酸的理化性质11
1.1.2 琥珀酸的功能、用途及市场需求11-12 1.2 琥珀酸的合成12-14
1.2.1 化学法合成琥珀酸12
1.2.2 生物法合成琥珀酸12-14 1.3 产琥珀酸菌株构建的国内外现状14-22
1.3.1 琥珀酸曼氏杆菌和琥珀酸放线杆菌14
1.3.2 大肠杆菌14-16
1.3.3 谷氨酸棒杆菌16-21
1.3.4 钝齿棒杆菌21
1.3.5 廉价原料的利用21-22 1.4 生物合成琥珀酸的最大理论得率22-23 1.5 代谢工程、系统代谢工程与合成生物学23-27
1.5.1 代谢工程、系统代谢工程与合成生物学23-25
1.5.2 代谢通量分析25-26
1.5.3 基元模式分析26
1.5.4 基元模式指导代谢工程改造26-27 1.6 选题背景27 1.7 研究思路27-29第二章 谷氨酸棒杆菌厌氧合成琥珀酸的途径鉴定29-59 2.1 实验材料29-34
2.1.1 菌株和质粒29-30
2.1.2 主要仪器30-31
2.1.3 主要实验试剂31-32
2.1.4 培养基32-33
2.1.5 主要溶液33-34 2.2 实验方法34-44
2.2.1 菌株培养与发酵34
2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化34-35
2.2.3 大肠杆菌基因组的提取35-36
2.2.4 大肠杆菌碱裂法提取质粒36
2.2.5 谷氨酸棒杆菌基因组的提取36-37
2.2.6 谷氨酸棒杆菌质粒提取37
2.2.7 谷氨酸棒杆菌电转感受态细胞的制备与转化37-38
2.2.8 PCR 扩增38-39
2.2.9 琼脂糖凝胶电泳39-40
2.2.10 PCR 产物以及 DNA 片段切胶回收40-41
2.2.11 DNA 的酶切、去磷酸化和连接41-42
2.2.12 谷氨酸棒杆菌基因敲除原理42
2.2.13 菌体浓度的测定42
2.2.14 发酵液中有机酸的测定42-44
2.2.15 葡萄糖浓度测定44 2.3 结果与讨论44-56
2.3.0 琥珀酸合成途径中关键基因的选择44-47
2.3.1 ldhA 基因敲除47-48
2.3.2 pDsacB 敲除载体构建48-51
2.3.3 mdh 基因敲除51-52
2.3.4 pyc 基因敲除52-53
2.3.5 ppc 基因敲除53-54
2.3.6 pckA 基因敲除54-55
2.3.7 aceA 基因敲除55-56 2.4 单基因敲除对琥珀酸合成的影响56-57 2.5 小结57-59第三章 失活乙酸生成途径对琥珀酸合成的影响59-70 3.1 实验材料60-61
3.1.1 质粒和菌株60-61
3.1.2 实验仪器61
3.1.3 主要实验试剂61
3.1.4 主要培养基61
3.1.5 主要溶液61 3.2 实验方法61-62 3.3 结果与讨论62-69
3.3.1 pta-ackA 操纵子的敲除62-63
3.3.2 pqo 基因的敲除63-65
3.3.3 cat 基因的敲除65-66
3.3.4 aceE 基因的敲除66-67
3.3.5 敲除乙酸途径对乙酸和琥珀酸合成的影响67-69 3.4 小结69-70第四章 基元模式分析与最佳琥珀酸合成途径的鉴定70-78 4.1 实验材料和方法70-71 4.2 结果与讨论71-77
4.2.1 代谢网络的构建71-75
4.2.2 最佳琥珀酸合成途径的鉴定75-77 4.3 小结77-78第五章 通量分析比较指导代谢工程改造78-112 5.1 实验材料78-80
5.1.1 菌株和质粒78-79
5.1.2 主要仪器79
5.1.3 主要实验试剂79-80
5.1.4 主要培养基80
5.1.5 主要溶液80 5.2 实验方法80-86
5.2.1 实际代谢通量分析80-83
5.2.2 发酵条件83-84
5.2.3 谷氨酸棒杆菌总 RNA 的抽提以及分析84
5.2.4 定量 PCR 分析84-85
5.2.5 酶活力测定85-86
5.2.6 胞内代谢物测定86 5.3 结果与讨论86-111
5.3.0 靶点鉴定86-89
5.3.1 过表达回补途径对琥珀酸的影响89-95
5.3.2 乙醛酸循环重构对琥珀酸合成的影响95-97
5.3.3 gltA 基因过表达对琥珀酸合成的影响97-101
5.3.4 sucE 基因过表达对琥珀酸的影响101-106
5.3.5 高密度厌氧发酵生产琥珀酸106-110
5.3.6 同一发酵罐两阶段生产琥珀酸110-111 5.4 小结111-112第六章 好氧条件下琥珀酸生产菌株的构建112-132 6.1 实验材料114-115
6.1.1 菌株和质粒114
6.1.2 主要实验仪器114-115
6.1.3 主要实验试剂115
6.1.4 主要培养基115
6.1.5 主要溶液115 6.2 实验方法115-117
6.2.1 摇瓶培养115
6.2.2 发酵罐培养115-116
6.2.3 乙酰辅酶 A 合成酶活力测定116
6.2.4 胞内乙酰辅酶 A 的测定116-117 6.3 实验结果与讨论117-131
6.3.1 琥珀酸好氧生产菌株 C. glutamicum △sdhCAB 的构建及表征117-119
6.3.2 琥珀酸好氧生产菌株 C. glutamicum ZX1 的构建及表征119-120
6.3.3 副产物乙酸的再利用120-123
6.3.4 柠檬酸合酶过表达对琥珀酸合成的影响123-125
6.3.5 琥珀酸输出蛋白过表达对好氧琥珀酸合成的影响125-129
6.3.6 分批补料培养129
6.3.7 好氧条件下利用阿拉伯糖生产琥珀酸129-131 6.4 小结131-132第七章 结论与展望132-137 7.1 结论和创新点132-135
7.1.1 结论132-134
7.1.2 创新点134-135 7.2 展望135-137参考文献137-148发表论文和参加科研情况148-149致谢149
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京公网安备75号香菇发菌棒里面有好多小飞虫咋办_百度知道
香菇发菌棒里面有好多小飞虫咋办
可以使用敌菇虫。菇虫净，或者高效氯氰菊酯喷洒杀虫药物
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出门在外也不愁食用菌废菌棒再利用
核心提示：食用菌在菌丝发菌的过程中，杂菌污染防不胜防。严重的时候，污染率能达到5%，甚至10%，如果种一万个菌棒，还没等到出菇，就得淘汰掉五百到一千个。菇农
& & 食用菌在菌丝发菌的过程中，杂菌污染防不胜防。严重的时候，污染率能达到5%，甚至10%，如果种一万个菌棒，还没等到出菇，就得淘汰掉五百到一千个。菇农们面对这种污染严重的菌棒，一般都是一扔了事。&
& & 废菌棒里面有大量的杂菌，菌棒的套袋破损之后，这些有害物质会散发到周围环境中，并随着空气、雨水、河水等到处漂移，造成更大范围的污染，导致来年食用菌种植的污染程度加大。如果不能从根本上解决废菌棒的污染问题，食用菌种植将进入一种恶性循环状态。图片
& & 如果将这些污染的废菌棒再回收利用，不但节省了原材料，减少环境污染，而且直接降低了菇农的生产成本。以下介绍利用废菌棒栽培食用菌降低成本以供菇农参考。
& & 1 废菌棒营养成分分析
& & 从废菌棒外表看，这些花花绿绿的斑块，就能想象得出，培养料里面有多少杂菌了。这种被污染的菌棒里边主要的营养成分是以纤维素、木质素或者半纤维素形式存在的，在污染过程中并没有太多的变化。这些营养价值在感染过程中还没全部消耗，也就是说，从营养的角度来看，被污染的废料的确可以用来再次种植食用菌。不过这并不表示这些废菌棒可以拿过来就直接往上面接种。面对这些废菌棒，需要解决的第一个问题是彻底灭菌。
& & 2 灭菌
& & 对菌棒造成污染的，通常会有多种杂菌，比如绿霉菌、木霉菌、黄曲霉菌等等，它们对菌棒的污染，远远超出了我们肉眼能够看到的范围。这些污染的菌它会产生很多的孢子，这些孢子如果再继续做食用菌栽培的时候，会成为二次污染源。
& & 其实，对于栽培食用菌来讲，即便是用新料，灭菌也是必不可少的环节，只是方式不同而已。废菌棒的灭菌必须经过发酵和高温处理才能完全杀菌。
& & 2.1 发酵处理
& & 处理废菌棒要先撕掉套袋，然后把散料重新堆积起来发酵。发酵周期必须达到20天以上。发酵时根据气温高低灵活采用是否用塑料薄膜覆盖。发酵到第7天的时候需要翻堆，翻堆的目的一是增加辅料一并发酵，二是将表层温度不高的料翻到底层。发酵的过程会产生60-80℃的高温，它可以杀死很多的有害菌。发酵过程中如果出现杂菌丝长出堆料表面，可用生石灰覆盖。
& & 发酵还能够带来另外一个好处，那就是在发酵过程中产生的一些微生物，能够对木质素、纤维素等复杂的大分子物质进行降解，从中分解出葡萄糖、氨基酸等营养成分，更加有利于食用菌的菌丝吸收利用，这是发酵过程非常重要的一个方面。
& & 2.2 高温杀菌
& & 被感染的废菌棒里面杂菌太多，发酵的温度在60-80℃之间，能够杀死大多数的杂菌。但是有一些耐热杂菌还是能够存活下来。所以，发酵之后再经过高温灭菌，才能达到彻底杀菌的目的。高温灭菌一般采用上锅蒸杀。就是把这些经过发酵的废料装到大锅里，进行高温灭菌。蒸料的温度达到100℃时保温10个小时以上，这样才能充分杀死杂菌和虫卵，消除污染隐患。
& & 3 选择合适的品种
& & 经过两次灭菌处理之后，曾经的污染棒又变成了可以利用的培养料，这些培养料二次利用的时候，应该选择什么样的品种呢？
& & 3.1 不能种植原来种植的品种
& & 因为在某一个食用菌生长的过程当中，它为了让自己的子实体长得更大，菌丝会分泌一种物质限制自身的生长密度，这种物质会长期存在于在培养料当中，造成二次种植同样品种时产量下降。所以，培养料二次利用再种食用菌的时候，一定要选择不同的品种，这有点类似于种庄稼需要倒茬一样。而且，二次栽培的品种，在对营养的要求上，还必须得下一个台阶。所以不能种植原来种植的品种。
& & 3.2 最适合的品种是种植平菇
& & 平菇是食用菌当中比较容易种植的品种，因为它对培养料的适应性比较强，一般的豆粕、玉米芯、酒糟、棉籽皮、木屑都可以种植，所以它的适应料比较广。
& & 虽然平菇对营养要求不是非常严格，但是，没有了杂菌的培养料还是不能直接用来种植平菇。因为之前接种的菌丝生长消耗了部分营养，之后感染了杂菌，杂菌菌丝的生长又消耗了部分营养，剩下来的就没法满足平菇生长的需要了。
& & 3.3 添加辅料
& & 虽然平菇的菌丝不太挑食，但是如果长期营养不足，它们的长势不好，就会影响产量。
& & 食用菌培养料里面的营养成分，大体上可以归为碳素营养和氮素营养两大类。感染棒再利用当中，就是碳和氮的比例降低了，所以添加辅料的目的就是把碳、氮营养补充回来。
& & 3.3.1 添加玉米芯
& & 经过试验，添加玉米芯能够补充绝大部分的碳素营养。用玉米芯补充碳素营养是一个既省钱又有效的好办法。
& & 添加之前，要先把玉米芯粉碎成颗粒状，然后浸湿。在培养料发酵的第七天利用翻堆的时机将浸湿的颗粒状玉米芯添加进去。添加时先将堆料上层翻到底层，然后撒一层玉米芯，覆一层堆料，再撒一层玉米芯，在覆一层堆料。这样的目的一是玉米芯吸水性好，在料当中有足够的水分，发酵效果会更好；二是玉米芯当中也有少量的绿霉，在发酵过程中，把绿霉杀死。
& & 虽然玉米芯的成本低，但也不是加得越多越好，一般来讲，按培养料重量20%的比例来添加就可以了。如果是平菇废菌棒再利用，添加的玉米芯比例要提高到30-40%。
& & 3.3.2 添加其它辅料
& & 在培养料发酵完成以后，需要添加另外几种辅料：尿素、磷酸二氢钾、生石灰。尿素是一种速效氮源，用它来补充氮素营养；磷酸二氢钾和生石灰，一方面可以补充钾、钙等平菇所需的矿物质元素，另一方面是平衡培养料的酸碱度。因为食用菌的生长，通常需要稍稍偏酸一点的环境，但是也不能太酸。
& &根据试验每1000Kg培养料，添加0.3Kg尿素、0.7Kg磷酸二氢钾、1Kg生石灰。在添加的时候，要先把尿素和磷酸二氢钾溶化在水里，然后把水浇拌到培养料上，生石灰粉直接撒上去，搅拌均匀后装袋，装袋完成后进锅灭菌，经过10个小时的高温之后，这些蒸透了的菌袋要尽快运到消过毒的接种室，等放凉了，就可以用来接种平菇了。
& & 用废菌棒生产一袋平菇的成本也就一块多钱，而且平菇的产量比较高，利润就不言而喻了。
& & 用这种废菌棒再利用技术，不但解决了环境污染问题，而且找到了废物再利用的途径，为菇农创造出更多利润。&
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