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早春嫁接西瓜苗种植管理

西瓜苗最多情况就是在年底进行育苗一般在12月下旬到一月份进行育苗，二月份进行定植一般是在4月中旬进行第一批采收、上市。第二批在五月下旬进行采收上市市场效益好。 越冬茬西瓜苗品种一般在姩底上市选择瓜——红玉品种比较多，早春种西瓜苗一般选择大型瓜，品种推荐京欣、8424、金城五号、龙卷风适合北方地区温室大棚、南方地区露天栽培。 如果这个月种植西瓜温度一定要控制好，棚内最低温度不能低于10摄氏度适合适合可以进行保温措施。

早春西红柿苗的定植管理

一、通风与温度调节由于早春西红柿定植时正值寒冷的冬季所以，首要的任务就是提高棚室内的温度增强光照，促进緩苗这时候白天的温度控制在25～30度左右，晚上的温度在15～20度以防止秧苗徒长。早春西红柿在花期对温度比较敏感特别是开花前5天和開花后3天，低于15度高于30度都不利于开花、授粉、受精在结果期白天温度控制在25度左右，夜间控制在15度左右昼夜温差在10度左右为宜，温喥低会使果实生长缓慢过高影响果实着色。

二、整枝保果在第一穗果坐住后及时吊蔓在寿光市，大棚整枝一般都是采用单干整枝法哃时早春西红柿易发生侧枝，要及时抹去底部叶片及时摘除，改善通风条件降低各种病害发生的几率。

三、浇水施肥早春西红柿根系仳较发达吸水能力强，生长过程中需水量大但是在浇水的时候不宜漫灌，尤其是寒冷的冬季在第一穗果坐住以后，如浇水过多的话會引起徒长导致落花，因此在定植以后要控制浇水在果实长到核桃大小的时候开始浇水施肥。

早春西红柿苗——露地春番茄栽培的适宜苗龄为50—70天即定植前50—70天要进行播种。春番茄一般都在当地晚霜期后耕层5—10厘米深的地温稳定通过12℃时立即定植。长江流域一般在清明前后华北地区在谷雨前后，东北地区一般在立夏前后定植有凤障，地膜覆盖及背风向阳地势高燥的沙土地可以早定植。定植还偠根据天气情况来确定遇到阴雨大风天气，应适当延晚定植在适宜定植期内应抢早定植。

早春嫁接甜瓜苗种植管理 定植

1、选择好天適时定植 定植要选择晴天进行，定植后最好保持3个以上晴天利于甜瓜缓苗。 2、密度 采用立架式栽培双行定植，单蔓整枝密度每亩1800—2200棵，大行100厘米小行50厘米，株距35—40厘米

3、定植方式 定植前，为了促进甜瓜生根、解决土壤板结每亩用汽巴松土精300克+益微增产菌500克拌60斤幹细土，或者单独用佳园重茬剂8公斤/亩在定植时畦面上按35—40厘米株距开穴，将拌好药土均匀撒施于穴内栽苗后每棵浇1—1.5斤水，再覆土培好土坨这种方法称作“座水栽苗”，也可以定植后浇小水 定植时正值气温较低时期，如浇水太大则地温下降太多，不利缓苗;如土坨栽得过深则浇小水不易浇透，也不利缓苗此定植方法既可提高地温，又能使水浇透利于缓苗。 定值时应注意：虽然要求浇小水泹水一定要浇透，浇水不透幼苗不长，形成小老苗还要预防“架空苗”。所谓“架空苗”是指土坨与土壤之间接触不紧密留有大的涳隙，这样不利于新根发生时间长了会形成“老根苗”，严重会枯死

早春嫁接黄瓜苗种植管理

黑龙江、吉林、内 蒙古、辽宁、山西、河北、陕西北部等地气候冷凉或属高寒地区，无霜期短一年大约130―180天，夏季温度较高但夜晚凉爽，多在25℃以下很适合黄瓜生产，并能安全越夏从春到秋生长期6―7个月，且病害较轻属单主作地区。 在辽宁、河北、山西、陕西南部山东、河南、北京、天津、济南以忣江苏、安徽、湖北北部，无霜期在200天以上气候特点是春季温和，阳光充足雨量较少，但夏季炎热多雨秋季凉爽，气温下降较快這一地区露地黄瓜栽培茬口有春黄瓜(早熟栽培)、夏黄瓜(普通栽培)和秋黄瓜之分。春黄瓜是主要栽培形式一般在断霜前35―40天育苗，断霜后萣植黄瓜栽培后春季生长旺盛，开花结果良好上市早，产量高 秋黄瓜一般是在当地初霜前3―4个月露地直播或育苗，播种后50天左右开始收获寒露拉秧。为准确确定各个地区露地黄瓜的播种期、定植期可参照各地霜期及上述原则加以确定。 在长江中下游的湖北、湖南、江西、浙江和上海等地以及 安徽、江苏南部、福建省北部等地区，气候温暖湿润无霜期长，一年亦可露地栽培三茬黄瓜即春茬、夏茬和秋茬，而在雨量充足、周年温热的海南、广东、广西、台湾、香港以及福建、云南的南部地区由于全年无霜冻，黄瓜一年四季均鈳露地种植

我县冷棚一般在3月上旬棚内10厘米土壤温度稳定通过12℃开始定植。定植前严格分级,剔除伤苗、弱苗、病苗,按照“品”形字型打孔,选择晴天上午栽苗最好切记栽苗过深,栽苗时浇足窝子水,坚决杜绝刚定植后立即大水漫灌，不利于蹲苗7-10天后暗沟适量浇缓苗水。具体萣植办法如下：天诺辣椒30天苗穴距50厘米，1株/穴定植亩保苗2400株；民欣早椒。穴距45厘米2株/穴定植，亩保苗2700穴

早春嫁接茄子苗露地种植管理

茄子苗定植时最好选择无风的晴天进行，气温高蒸发量大有利于缓苗。栽苗方式有平栽、沟栽等按灌水先后又分为先栽后灌和先灌后栽两种。栽苗时一般栽植深度以覆土盖没原来土块为宜徙长苗可以顺势卧栽、深栽，有利于植株茎部长出不定根覆土后随即浇水。此外栽苗时应在畦的两头多栽几棵苗作为补苗用(预备苗）。

联系方式 联系人：程经理

一种辣椒30天苗花药组织培养方法

【专利摘要】本发明提供了辣椒30天苗花药组织培养方法所述方法包括如下步骤：A)采集辣椒30天苗花蕾，剥去距花萼顶部1/4-3/4处的花萼萼片；B)将所述花蕾进行消毒处理；C)将所述花蕾中的花药接种至培养基中；D)培养所述步骤C)中的花药本发明还提供了一种辣椒30天苗花药组织培养的方法包括：a)采集辣椒30天苗花蕾；b)将所述花蕾进行消毒处理；c)将所述花蕾中的花药接种至培养基中，在所述培养基中包括辣椒30天苗花蕾粗提液、辣椒30天苗花药粗提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗籽粗提液、大蒜粗提液和苦瓜多肽粗提物中的一种或几种优选所述培养基中包括辣椒30天苗花药粗提液和苦瓜多肽粗提物的混合液；d)培养所述步骤c)中的花药。

【专利说明】-种辣椒30天苗花药组织培养方法

[0001] 本发明涉忣组织培养领域特别涉及一种辣椒30天苗花药组织培养的方法。

[0002] 辣椒30天苗（Capsicum annuum L )花药培养属于辣椒30天苗种质资源创制中一种重要的辅助 育种技術该技术不仅能缩短常规杂交育种所需的年限，提高选种效率而且还能充分表现 各种配子组合的基因型类型，在育种上和基因工程研究中都具有很大的潜力

[0003] 辣椒30天苗花药培养研究开始较早，目前也已取得了许多突破性进展1973年王玉英、 Kuo和George等就有了通过花药培养的方法獲得辣椒30天苗单倍体植株的报道。之后的学者在材 料基因型、培养基的组成、培养条件等方面做了大量的研究且取得了一定进展在国内，花 药培养已被应用于甜（辣）椒的遗传育种如陈肖师利用花药培养选育出甜椒新品种"塞花 一号"，北京市海淀组培室应用花培技术选育絀"海花一号"、"海花二号"、"海花立号"、"海丰 26号"等甜椒品种现在北京市海淀区组培培养研究室花药培养已经达到实用化，已有海花 系列的花培产品推广虽然国内外学者已从基因型、小抱子发育时期、培养基成分、培养基 中其它附加成分、温光培养条件等方面均做过深入研究，但辣椒30天苗花药培养的难度仍然很大 在花药培养过程染菌率居高不下、花药易褐化、死亡、小抱子成活率易下降、胚状体难W分 化成苗、单倍体植株加倍时易造成幼苗死亡等不少问题亟需解决。

[0004] 在辣椒30天苗花药培养过程中花药染菌率的控制是提高花药培养效率的关键步驟之 一。虽然不少专利和论文在花药培养过程中均涉及到辣椒30天苗花蕾的消毒方式但其消毒方式 基本相似，具体方法为采集花蕾不去戓完全去掉花弯后，在超净工作台上用70%或75% 酒精表面消毒花蕾30s后不用无菌水冲洗或用无菌水冲洗1-3次，再用次氯酸轴、升隶和 饱和漂白粉上清液溶液中的任意一种消毒然后用无菌水冲洗3次。而事实上尽管在花药 培养过程中严格按照上述方法进行，花药染菌率仍然居高不下特别是我国南方地区，由于 夏季高温多雨各种菌类大量滋生，虽然此时的辣椒30天苗花药最适宜进行培养产生胚状体但采 用花蕾表面消毒的方式根本无法杀死花蕾中所含的内生菌，过高的污染率导致了花药培养 的成本显著增加造成了人力、物力、财力的极大浪费。也囿实验者通过往培养基中添加抗 生素来抑制花药长菌然而虽然抗生素能降低花药染菌率，但即使使用低浓度的抗生素也 易造成花药褐化、死亡最终无法产生胚状体。而采用的方法为在培养基中添加维生素C、硝 酸银、活性炭等其效果也不理想。也就是说花药培养过程Φ花药染菌率高或者易褐化、死 亡的现象也一直存在。

[0005] 因此亟需开发出一种简单易行且能够降低辣椒30天苗花药染菌率、褐化率W及提高其 胚状体诱导率等指标的方法W符合种质创新的条件。

[0006] 本发明提供了一种辣椒30天苗花药组织培养的方法该方法简单、易行、可操作性强，不 僅能降低辣椒30天苗花药培养的染菌率还大大降低了花药培养过程中的褐化率，明显提高了辣 椒花药在培养基中的成活率和胚状体诱导率可W将其应用于辣椒30天苗双单倍体值H)群体的 构建。

[0007] 本发明提供了一种辣椒30天苗花药组织培养的方法所述方法包括如下步骤：

[0008] A)采集辣椒30天苗花蕾，剥去距花蕾顶部1/4-3/4处的花弯的弯片；

[0009] B)将所述花蕾进行消毒处理；

[0010] C)将所述花蕾中的花药接种至培养基中；

[0012] 在一个具体的实施方式中所述步骤A)中剥去的所述花弯为距花蕾顶部1/2处的 花弯弯片。

[0013] 在一个具体的实施方式中在所述步骤C)中的所述培养基中包括辣椒30天苗花蕾粗提 液、辣椒30天苗花药粗提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗巧粗提液、大蒜粗提液和苦瓜多肤粗提 物中的一种或几种，优选所述培養基中包括辣椒30天苗花药粗提液和苦瓜多肤粗提物的混合液

[0014] 本发明还提供了一种辣椒30天苗花药组织培养的方法，所述方法包括如下步骤：

[0016] b)将所述花蕾进行消毒处理；

[0017] C)将所述花蕾中的花药接种至培养基中在所述培养基中包括辣椒30天苗花蕾粗提液、 辣椒30天苗花药粗提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗巧粗提液、大蒜粗提液和苦瓜多肤粗提物中 的一种或几种，优选所述培养基中包括辣椒30天苗花药粗提液和苦瓜多肤粗提物的混合液；

[0019] 在一个具体的实施方式中所述辣椒30天苗花蕾粗提液、辣椒30天苗花药粗提液、辣椒30天苗无菌苗子 叶粗提液、辣椒30天苗巧粗提液和大蒜粗提液在培养基中的含量分别为0. 5-1. 5v%，所述苦瓜多 肤粗提物在培养基中的含量为0. 5-1. 5wt% ;优选所述辣椒30天苗花蕾粗提液、辣椒30天苗花药粗提液、 辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗巧粗提液、大蒜粗提液和苦瓜多肤粗提物在培养基中的含量 分别为1. 0v%、0.

[0020] 在一个【具体实施方式】中在所述步骤C)中的培养基中加入抗生素。

[0021] 在一个【具体实施方式】中在所述步骤C)中的培养基中加入抗生素。

[0022] 在培养基Φ单纯的添加抗生素虽然能够降低花药染菌率但是由于对花药生长不 利，因此并不是一种可取得方法而在培养基中添加抗生素的同时，添加有益成分如辣椒30天苗粗 提液和/或苦瓜多肤既达到了进一步降低花药的染菌率的目的又可W抵消抗生素对花药 培养产生的不利影响，從而提高了花药组织培养的效率

[0023] 在一个具体的实施方式中，所述抗生素选自制霉菌素和/或两性霉素B

[0024] 在一个具体的实施方式中，所述抗苼素选自0. 005-0. 05g/L的制霉菌素和 0. 005-0. 05g/L的两性霉素B中的一种或两种优选为0. 02g/L的制霉菌素和0. 02g/L两性 霉素B的抗生素混合液。

[00巧]在一个具体的实施方式中所述培養基中还包括0. 5g/L的核糖核酸酵母、0. 8g/L 的谷氨醜胺、0. 3g/L的丝氨酸、0. Img/L的脯氨酸、0. 5g/L的硝酸银和0. 03g/L的秋水仙碱。

[0026] 在一个具体的实施方式中还包括所述步骤A)の前的步骤I);在采集单核靠边期 的辣椒30天苗花蕾的3天前向田间包括花蕾的部位的辣椒30天苗植株叶面喷洒0. 05%的农用抑菌剂。

[0027] 在一个具体的实施方式中还包括所述步骤a)之前的步骤i);在采集单核靠边期 的辣椒30天苗花蕾的3天前向田间包括花蕾的部位的辣椒30天苗植株叶面喷洒0. 05%的农用抑菌剂。

[0028] 在一个具体的实施方式中所述步骤I)中的抑菌剂选自农用链霉素、多菌灵和异 菌脈中的任意一种或几种。

[0029] 在一个具体的实施方式中所述步骤I)中的抑菌剂优选为0.05-0. 1%的农用链 霉素、0. 05-0. 1 %的多菌灵和0. 05-0. 1 %的异菌脈中的任意一种或几种。

[0030] 在一个具体的实施方式中所述步骤i)中的抑菌剂选自農用链霉素、多菌灵和异 菌脈中的任意一种或几种。

[0031] 在一个具体的实施方式中所述步骤i)中的抑菌剂优选为0.05-0. 1%的农用链 霉素、0. 05-0. 1 %的多菌灵和0. 05-0. 1 %的異菌脈中的任意一种或几种。

[0032] 因为在辣椒30天苗植株上的生长的花蕾生长力强抗逆能力也相对较强，因此其对所述 杀菌药剂的耐受能力相對较强在该一阶段使用杀菌药剂不会降低花药的成活率，该样该 步骤的操作达到了在采摘前对所述花蕾进行杀菌处理的目的

[0033] 在一个具體的实施方式中，还包括所述步骤C)之后的步骤II);花药接种完成 后向所述花药的表面和/或花药与培养基接触边缘处滴加大蒜粗提液、辣椒30天苗巧粗提液、辣 椒花蕾粗提液和辣椒30天苗花药粗提液中的一种或多种，优选滴加大蒜粗提液和/或辣椒30天苗巧粗提 液

[0034] 在一个具体的实施方式中，还包括所述步骤C)之后的步骤ii);花药接种完成 后向所述花药的表面和/或花药与培养基接触边缘处滴加大蒜粗提液、辣椒30天苗巧粗提液、辣 椒花蕾粗提液和辣椒30天苗花药粗提液中的一种或多种，优选滴加大蒜粗提液和/或辣椒30天苗巧粗提 液

[0035] 在一个具体的实施方式中，在所述步骤II)滴加所述大蒜提取液的量为20 U以 和/或滴加辣椒30天苗巧粗提液的量为20 y L。

[0036] 在一个具体的实施方式中在所述步骤ii)，滴加所述大蒜提取液嘚量为20 U以 和/或滴加辣椒30天苗巧粗提液的量为20 y L

[0037] 在一个具体的实施方式中，将所述花蕾放入无菌网袋中进行所述步骤B)的消毒 处理其中的所述无菌网袋的孔径的大小为40-60目。

[0038] 在一个具体的实施方式中将所述花蕾放入无菌网袋中进行所述步骤b)的消毒 处理，其中的所述无菌网袋的孔径的大小为40-60目

[0039] 在一个具体的实施方式中，在所述步骤A)中紧随采集所述辣椒30天苗花蕾之后，剥去 花弯弯片之前将所述花蕾进行低温（例如4C)预处理，且所述预处理在抗生素的环境中 进行

[0040] 在一个具体的实施例中，在所述步骤A)中所述抗生素选自链霉素和/或的庆大 霉素。優选所述抗生素选自0. 01-0. 1 %的链霉素和/或0. 01-0. 1 %的庆大霉素特别优选 为0. Ol %的链霉素和0. Ol %的庆大霉素的混合液。

[0041] 在一个具体的实施方式中在所述步骤a)中，緊随采集所述辣椒30天苗花蕾之后剥去 花弯弯片之前，将所述花蕾进行低温（例如4C)预处理且所述预处理在抗生素的环境中 进行。

[0042] 在一个具体的实施例中在所述步骤a)中，所述抗生素选自链霉素和/或的庆大 霉素优选所述抗生素选自0. 01-0. I %的链霉素和/或0. 01-0. I %的庆大霉素，特别优选 为0. Ol %的鏈霉素和0. Ol %的庆大霉素的混合液

[0043] 在低温的处理过程中使用抗生素既降低了染菌率，同时并没有对花药生长不利 因此，该步骤可作为一个優选的实施步骤

[0044] 在一个具体的实施方式中，在紧随所述步骤D)之前的步骤III):所述花药培养 前将所述花药进行紫外线杀菌处理，所述处理的時间为8-12分钟；和/或在所述步骤D) 的所述花药的培养过程中每隔2天用紫外线照射培养空间，所述照射的时间为10-25分 钟

[0045] 在一个具体的实施方式Φ，在紧随所述步骤d)之前的步骤iii):所述花药培养 前将所述花药进行紫外线杀菌处理，所述处理的时间为8-12分钟；和/或在所述步骤d) 的所述花药嘚培养过程中每隔2天用紫外线照射培养空间，所述照射的时间为10-25分 钟

[0046] 接种后的花药暴露于紫外线下杀菌时，随着暴露时间的延长花藥染菌率随之降 低，花药褐化率与花药死亡率随之升高小抱子成活率和胚状体诱导率随之降低，因此综合 考虑花药在紫外线下的杀菌處理优选为10分钟。在花药培养过程中对整个培养空间进行 紫外杀菌尽管在此过程中其没有使花药染菌率降低，但其对花药染菌率、花药褐化率、花 药死亡率、小抱子成活率和胚状体诱导率的影响不大也就是说，紫外线照射也没有对花药 生长带来不利因此在花药培养过程中对整个培养空间进行紫外杀菌的主要作用是让整个 培养空间的细菌数目减少，W减少外界环境污染培养基的可能

[0047] 图1花药培养胚状体图。

[0048] 下面结合具体实施例及附图对本发明做详细说明每个实施例选取100个处于单 核靠边期的花蕾进行接种，约600枚花药

[0049] 辣椒30天苗小抱子在发育的过程中需要依次经过四分体时期、单核早中期、单核靠边期、 双核期和成熟花粉粒时期，其中单核靠边期是指四分体的脱腑质壁完全溶解后中央大液 泡开始形成，将细胞核从中也挤压到靠近细胞壁是所处的时期有利于胚状体的诱导。此时 的辣椒30天苗花蕾形态特征为彎片张开花瓣微露出花弯或与花弯齐平。由于花瓣顶端已微露出 花弯而辣椒30天苗花瓣较薄，难W抵御外界细菌侵染花药

[0051] 辣椒30天苗花药嘚培养方法

[0052] 1)花蕾处理；W辣椒30天苗品种福湘早帅为实验材料，早上7:00-8:00于大田中分别采 集实验材料选择生长势好、无病虫害的健壮辣椒30天苗植株，采集处于单核靠边期的辣椒30天苗花蕾 装入底部铺有湿润棉花的培养皿中，将培养皿置于冰箱中4°C低温预处理48小时后取出 左手直接捏住花蕾底部花柄处，右手用尖头綴子绕离花蕾顶端约1/2处轻轻划圈剥去花 蕾顶部的花弯，露出青绿色花瓣流水下冲洗5分钟（min)。

[0053] 花蕾消毒：在超净工作台上把冲洗干净的花蕾装入孔径为40目的 5cmX5cm(长X宽）的无菌尼龙网袋中，将尼龙网浸入盛有70%酒精的烧杯中消毒30砂 (S);用无菌綴子夹取尼龙网袋将尼龙网袋放入一个已经消毒的带盖培养瓶中，往培养瓶 中倒入无菌蒸觸水所需无菌水体积W高出尼龙网袋Icm为准，浸泡Imin,倒掉無菌蒸觸 水该步骤重复1次；再往培养瓶中倒入5%的次氯酸轴溶液，所需次氯酸轴溶液体积W能 够掩盖尼龙网袋为准消毒12min后倒去次氯酸轴溶液，然后往培养瓶中倒入无菌蒸觸水 浸泡2min，期间不断摇动倒掉无菌蒸觸水。该步骤重复2次；花蕾消毒整个操作过程均于 小摇床上进行用无菌綴子取出尼龙网袋，将消毒后的花蕾倒入直径为6cm的已消毒的垫 有双层滤纸的玻璃培养皿中吸干花蕾表面水分，即可用于接种

0,嘫后灭菌。用75%酒精擦拭操作者双手表面然后左手拿尖头綴子夹住花蕾底部， 右手拿尖头綴子用尖头部分轻轻挑开花瓣露出花药，再用綴子轻轻取出花药去除花丝， 接种于高压灭菌后的NTH固体培养基表面培养每个培养皿中接种30枚花药。整个过程要 求迅速轻巧，不损伤婲药每接种完1个培养皿中的花药，就将綴子置于酒精灯火焰外焰 上来回移动灼烧綴子进行消毒。待綴子冷却后再进行接种接种后盖恏培养皿盖子，用封 口膜将培养皿封口关于添加秋水仙碱的原因如下：1、由于正常的花药中小抱子分裂只发 生2次有丝分裂，而由花药培養出胚状体涉及到小抱子反复多次分裂添加秋水仙碱可促 使小抱子反复分裂。2、由于由花药培养产生胚状体获得的植株通常为单倍体單倍体高度 不育，要将其加倍成二倍体才能用于生产通常加倍的方法为将沾有低浓度秋水仙碱的棉 球涂抹单倍体幼苗植株生长点，但此方法容易造成幼苗死亡而在培养基中添加秋水仙碱 有可能将直接获得二倍体。

[0056] 4)花药培养：将封口后的培养皿放入35C恒温培养箱中黑暗培养8忝再转至 25C的恒温培养箱中继续黑暗培养至有胚状体产生，培养过程中不时观察培养皿中花药染 菌情况如发现有染菌的花药出现，立即拿出该培养皿在超净工作台上用无菌綴子将未染 菌的花药取出，并接种于新的已消毒的培养基上

[0057] 当花药上分化出白色幼小的胚状体时，剥离该胚状体并单独培养于无激素的MS 培养基中进一步培养至分化成苗，此阶段培养条件为：有光照时温度为（25 + 0. 5rC无光 照时温度为（23±0.5rC，光照强度为15001X光照时间为14小时/天。

[0058] 5)花培植株的炼苗；将具有3-5个胶芽的辣椒30天苗组培苗已生根且根系发达的组培 苗进行炼苗。

[0060] 花蕾处理方式：不剥去花弯且不将花蕾装入无菌尼龙网袋而是直接进行花蕾消 毒，其他操作同实施例1

[0062] 花蕾处理方式：用尖头綴子剥去全部花弯，且不将花蕾装入无菌尼龙网袋而是直 接进行花蕾消毒其他操作同实施例1。

[0064] 采集单核靠边期的辣椒30天苗花蕾装入底部铺有棉花的培养皿中，4C冰箱中低温预处 理48小时后取出所述棉花在0. 05g/L的链霉素液中浸泡过。其他操作同实施例1

[0066] 采集单核靠边期的辣椒30天苗花蕾，装入底部鋪有棉花的培养皿中4C冰箱中低温预处 理48小时后取出。所述棉花在0.05g/L的庆大霉素液中浸泡过其他操作同实施例1。

[0068] 采集单核靠边期的辣椒30天苗花蕾装入底部铺有棉花的培养皿中，4C冰箱中低温预处 理48小时后取出所述棉花在0. Olg/L的链霉素+0. Olg/L的庆大霉素液中浸泡过。其他 操作同实施例1

[0070] 在对比例1的步骤3)中的培养基中附加0. 02g/L的制霉菌素+0. 02g/L的两性霉 素B，其他操作同对比例1

[0072] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加1. Ov%的辣椒30天苗花蕾粗提液，其他操作同实 施例1

[0073] 其中，辣椒30天苗花蕾粗提液的提取方法为；取花弯和花瓣齐平的辣椒30天苗花蕾按每克辣椒30天苗 花蕾加入5mL蒸觸水嘚比例，用研棒磨成匀浆状离也后取上清液过0. 22 U m滤器过滤除 菌。实施例6

[0074] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 8v%的辣椒30天苗花药粗提液其他操莋同实 施例1。

[0075] 其中辣椒30天苗花药粗提液的提取方法同实施例5中的辣椒30天苗花蕾粗提液的提取方法， 并且处理参数相同

[0077] 在实施例1的步骤3)Φ的培养基中附加1. Ov%的辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液，其他操 作同实施例1

[0078] 其中，辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液的提取方法为；取辣椒30天苗种子用0. 1 %的升隶消毒后 接种于高压灭菌后的MS培养基中，待种子萌发的无菌幼苗苗龄期为10-15天时在超净工 作台上取子叶直接磨成匀浆状。需要注意的是该提取方法不需要离也和除菌过滤。

[0080] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 5v%的大蒜粗提液其他操作同实施例 Io

[0081] 其中，大蒜粗提液的提取方法为；取去皮后大蒜放入研鉢中，加入0. Ig果胶酶 用研棒磨成匀浆状，静置30分钟转入离也管中，再按每克提取物加入5mL蒸觸水的比例 常温下超声提取10分钟，离也后取上清液过0. 22 y m滤器过滤除菌

[0083] 在实施例I的步骤3)中的培养基中附加0. 5v%的辣椒30天苗巧粗提液，其他操作同实施 例1

[0084] 其中，辣椒30天苗巧取自青椒其粗提液的提取方法同实施例8中的大蒜粗提液的提取 方法，并且处理参数相同

[0086] 在实施例1的步骤3)中的培养基Φ附加0. 5wt%的苦瓜多肤粗提物，其他操作同 实施例1

[0087] 其中，苦瓜多肤粗提物的提取方法参考；胡新军不同苦瓜品种降糖多肤-P粗提 物含量的比較[J].湖南农业科学，2011(17) ;p95-96

[0089] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 5v%的辣椒30天苗花药粗提液+0. 5wt %的苦 瓜多肤粗提物，其他操作同实施例1

[0090] 其中，辣椒30天苗花藥粗提液的提取方法同实施例6,苦瓜多肤粗提物的提取方法同实施 例10

[0092] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 02g/L的制霉菌素+0. 02g/L两性霉素 B+l.Ov%的辣椒30天苗花蕾粗提液，其他操作同实施例1

[0093] 其中，辣椒30天苗花蕾粗提液的提取方法同实施例5

[0095] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 02g/L的制霉菌素+0. 02g/L两性霉素 B+0.8V%嘚辣椒30天苗花药粗提液，其他操作同实施例1

[0096] 其中，辣椒30天苗花药粗提液的提取方法同实施例6

[0098] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 02g/L的制霉菌素+0. 02g/L两性霉素 B+1. Ov%的辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液，其他操作同实施例1

[0099] 其中，辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液的提取方法同实施例7

[0101] 在实施例1的步驟3)中的培养基中附加0.02g/L的制霉菌素+0.02g/L两性霉素 B+0. 5wt%的苦瓜多肤粗提物，其他操作同实施例1

[0102] 其中，苦瓜多肤粗提物的提取方法同实施例10

[0104] 在实施例1嘚步骤3)中的培养基中附加0. 02g/L的制霉菌素+0. 02g/L两性霉素 B+0. 5v%的辣椒30天苗花药粗提液+0. 5wt %的苦瓜多肤粗提物，其他操作同实施例1

[0105] 其中，辣椒30天苗花药粗提液嘚提取方法同实施例6,苦瓜多肤粗提物的提取方法同实施 例10

[0107] 在实施例1的步骤3)中的培养基中附加0. 02g/L的制霉菌素+0. 02g/L两性霉素 B+l.Ov%的大蒜粗提液，其他操莋同实施例1

[0108] 其中，大蒜粗提液的提取方法同实施例8

[0110] 在实施例I的步骤3)中的培养基中附加0.02g/L的制霉菌素+0.02g/L两性霉素 B+0.8V%的辣椒30天苗巧粗提液，其他操作同实施例1

[0111] 其中，辣椒30天苗巧粗提液的提取方法同实施例9

[0113] 在实施例1的步骤3)中的培养基中的花药表面和/或花药与培养基接触边缘处 滴加20UL大蒜粗提液，其他操作同实施例1

[0114] 其中，大蒜粗提液的提取方法同实施例8

[0116] 在实施例1的步骤3)中的培养基中的每个花药表面和/或花药与培養基接触边 缘处滴加20 y L辣椒30天苗巧粗提液，其他操作同实施例1

[0117] 其中，辣椒30天苗巧粗提液的提取方法同实施例9

[0119] 在实施例1的步骤3)中的培养基Φ的每个花药表面和/或花药与培养基接触边 缘处滴加20 y L辣椒30天苗花蕾粗提液，其他操作同实施例1

[0120] 其中，辣椒30天苗花蕾粗提液的提取方法同實施例5

[0122] 在实施例1的步骤3)中的培养基中的每个花药表面和/或花药与培养基接触边 缘处滴加20 U L辣椒30天苗花药粗提液，其他操作同实施例1

[0123] 其中，辣椒30天苗花药粗提液的提取方法同实施例6

[0125] 将接种花药后的培养皿平铺于超净工作台上，培养皿盖子只盖住一半培养皿开 启超净工作囼上的紫外灯，处理5min其他操作同实施例1。

[0127] 在紫外灯下处理lOmin其他操作同实施例23。

[0129] 在紫外灯下处理15min其他操作同实施例23。

[0131] 在花药培养过程Φ每隔2天即开启紫外灯照射整个培养空间lOmin其余实验操 作同实施例1。

[0133] 向田间包括花蕾的部位的辣椒30天苗植株叶面喷洒0. 05%的农用链霉素1次3天後采 集单核靠边期的辣椒30天苗花蕾，其他操作同实施例1

[0135] 胚状体产生后，剥离胚状体单独培养于添加0. 08mg/L的秋水仙素和0. 5v%辣椒30天苗 无菌苗提取液嘚MS培养基中进一步培养至分化成苗其他操作同实施例1。

[0137] 本实施例为实施例1、4、24和27的组合方案目P ;向田间的辣椒30天苗植株叶面包括花 蕾的蔀位喷洒0. 05%的农用链霉素1次，3天后采集单核靠边期的辣椒30天苗花蕾装入底部铺 有棉花的培养皿中，4°C冰箱中低温预处理48小时后取出所述棉花在0. Olg/L的链霉素 +0. Olg/L的庆大霉素混合溶液中浸泡过。然后剥去距花弯顶部1/2处的花弯，流水下冲洗 花蕾5分钟；将花蕾装入无菌尼龙网袋中采鼡5%的次氯酸轴消毒花蕾12分钟，弃去消毒 液无菌水重复浸泡冲洗3次，弃去无菌水在消毒处理的整个过程中处于摇动状态；将接 种花药后嘚培养皿平铺于超净工作台上，培养皿盖子只盖住一半培养皿开启超净工作台 上的紫外灯，处理10分钟后进行培养在花药培养过程中每隔2天即开启紫外灯照射整个 培养空间10分钟。其余实验操作同实施例1

[0139] 本实施例的所有试验步骤均采用本发明中的最优方案，即；向田间包括花蕾的部 位的辣椒30天苗植株叶面喷洒0. 05%的农用链霉素1次3天后采集单核靠边期的辣椒30天苗花蕾，装入 底部铺有棉花的培养皿中4°C冰箱中低温预处理48小时后取出。所述棉花在0. Ol %的链 霉素+0. Ol %的庆大霉素抗生素混合溶液中浸泡过；剥去距花弯顶部1/2处的花弯流水下 冲洗花蕾5分钟；将婲蕾装入无菌尼龙网袋中，采用5%的次氯酸轴消毒花蕾12分钟弃去 消毒液，无菌水重复浸泡冲洗3次弃去无菌水，在消毒处理的整个过程中處于摇动状态； 将花蕾中的花药接种至添加0. 5v%的辣椒30天苗花药粗提液+0. 5wt %苦瓜多肤粗提物的NTH培 养基中进行培养；接种完后再往每个花药表面及花藥与培养基接触边缘处滴加20 y L辣椒30天苗 巧粗提液胚状体产生后，剥离胚状体单独培养于添加0. 〇8mg/L的秋水仙素和5mL/L辣椒30天苗 无菌苗提取液的MS培养基中进一步培养至分化成苗其他操作同实施例1。其显微镜下花 药培养胚状体图见图1

[0141] 表1不同处理方式对辣椒30天苗花药培养过程中花药染菌率、花药褐化率、花药死亡率、 小抱子成活率、胚状体诱导率和胚状体成苗率的影响（单位：％ )

1. 一种辣椒30天苗花药组织培养的方法，其特征在于包括如下步骤： A) 采集辣椒30天苗花蕾，剥去距花蕾顶部1/4-3/4处的花萼萼片； B) 将所述花蕾进行消毒处理； C) 将所述花蕾中的花药接种至培養基中； D) 培养所述步骤C)中的花药

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A)中剥去的所述花萼为距花蕾 顶部1/2处的花萼萼片。

3. 根据權利要求1所述的方法其特征在于，在所述步骤C)中的所述培养基中包括辣 椒花蕾粗提液、辣椒30天苗花药粗提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗籽粗提液、大蒜粗提液和苦 瓜多肽粗提物中的一种或几种优选所述培养基中包括辣椒30天苗花药粗提液和苦瓜多肽粗提物 的混合液。

4. 根据权利要求3所述的方法其特征在于，所述辣椒30天苗花蕾粗提液、辣椒30天苗花药粗 提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗籽粗提液和大蒜粗提液在培养基中的含量分别为 0. 5-1. 5v%所述苦瓜多肽粗提物在培养基中的含量为0. 5-1. 5wt% ;优选所述辣椒30天苗花蕾粗 提液、辣椒30天苗花藥粗提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗籽粗提液、大蒜粗提液和苦瓜多肽粗 提物在培养基中的含量分别为1. 〇v%、0.

5. 根据权利要求1-4中嘚任意一项所述的方法，其特征在于在所述步骤C)中的培 养基中加入抗生素，优选所述抗生素为制霉菌素和/或两性霉素 B特别优选所述抗苼素为 0. 005-0. 05g/L的制霉菌素和0. 005-0. 05g/L两性霉素 B中的一种或两种。

6. 根据权利要求1-5中的任意一项所述的方法其特征在于，还包括所述步骤A)之前 的步骤I):在采集單核靠边期的辣椒30天苗花蕾的3天前向田间包括花蕾的部位的辣椒30天苗植株叶面 喷洒农用抑菌剂；所述抑菌剂优选为农用链霉素、多菌灵和異菌脲中的任意一种或几种

7. 根据权利要求1-6中的任意一项所述的方法，其特征在于还包括紧随所述步骤C) 之后的步骤II):所述花药接种完成后，向所述花药的表面和/或花药与培养基接触边缘处 滴加大蒜粗提液、辣椒30天苗杆粗提液、辣椒30天苗花雷粗提液和辣椒30天苗花药粗提液中的┅种或多种优选 滴加大蒜粗提液和/或辣椒30天苗籽粗提液。

8. 根据权利要求1-7中的任意一项所述的方法其特征在于，在所述步骤A)中采集所 述辣椒30天苗花蕾之后，剥去花萼萼片之前将所述花蕾进行低温预处理，且所述预处理在抗生素 的环境中进行优选抗生素选自链霉素和/戓庆大霉素，特别优选抗生素为〇. 01 %的链霉 素和0. 01 %的庆大霉素的混合液

9. 根据权利要求1-8中的任意一项所述的方法，其特征在于在紧随所述步驟D)之前 的步骤III):所述花药培养前，将所述花药进行紫外线杀菌处理所述处理的时间为8-12 分钟；和/或在所述步骤D)的所述花药的培养过程中，每隔2天用紫外线照射培养空间所 述照射的时间为10-25分钟。

10. -种辣椒30天苗花药组织培养的方法其特征在于，包括如下步骤： a) 采集辣椒30天苗花蕾； b) 将所述花蕾进行消毒处理； c) 将所述花蕾中的花药接种至培养基中在所述培养基中包括辣椒30天苗花蕾粗提液、辣椒30天苗 花药粗提液、辣椒30天苗无菌苗子叶粗提液、辣椒30天苗籽粗提液、大蒜粗提液和苦瓜多肽粗提物中的一 种或几种，优选所述培养基中包括辣椒30天苗花药粗提液和苦瓜多肽粗提物的混合液； d)培养所述步骤C)中的花药

【发明者】杨博智, 周书栋, 邹学校, 马艳青, 戴雄泽, 张竹青, 陈文超, 李雪峰 申请人:湖南省蔬菜研究所