一种用磷酸钙法高效转染HEK 293T细胞方法的建立
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3秒自动关闭窗口重组腺病毒(adenovirus)能否用293T细胞包装(重组,腺病毒)
03:40:01&&&来源：&&&评论：&&
[重组腺病毒(adenovirus)能否用293T细胞包装(重组,腺病毒)] 请教各位老师，重组腺病毒(adenovirus)能用293T细胞包装吗？它和用293A细胞包装有何不同？ 关键词:[重组 腺病毒]…
请教各位老师，重组腺病毒(adenovirus)能用293T细胞包装吗？它和用293A细胞包装有何不同？
回复可以，293细胞是转染腺病毒(adenovirus)E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用Ca3(PO4)2转染效率可高达50%。蛋白表达水平高，转染后2-3天用碱性分析可较容易地检测到表达的蛋白。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外（分泌的或膜）蛋白的便捷方式。此细胞系人腺病毒(adenovirus)滴度高。室温不贴壁，37℃几日后重新贴壁。
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慢病毒载体在眼科基因治疗的应用
日 14:59:04 Monday&&
作者：李伟，高玲&&&&作者单位：（410011）中国湖南省长沙市，中南大学湘雅二医院眼科
　　随着分子生物学技术的进步和基因遗传学的发展，慢病毒载体系统不断地得到改良及优化，并以其特有的优势，逐渐成为眼科基因治疗的良好载体之一，由于其来源特殊，其生物安全性也备受关注。目前慢病毒已应用于多种眼科疾病的基因治疗研究中，并取得较好成果，为许多疾病的治疗带来了希望，但是我们要将其真正应用于临床，还任重而道远。
【关键词】& 慢病毒;基因治疗;病毒载体;眼科疾病
　　Lentiviral vectors for gene therapy of ocular diseases
　　Wei Li, Ling Gao
　　Department of Ophthalmology, Xiangya the Second Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China
　　Correspondence to: Wei Li. Department of Ophthalmology, Xiangya the Second Hospital, Central South University, Changsha 410011, Hunan Province, China.
　　Abstract?The capacity of efficiently transfecting nondividing cells, shuttling large genetic payloads, and maintaining stable long?term transgene expression attributes the lentiviral vectors to the forefront of gene delivery vehicles for research and therapeutic applications in a clinical setting. However, now their biosafety is of major concern because of their special source. We discussed the development of lentiviral vectors and described the key features of them that made them such useful tools for gene therapy, and outlined the major breakthroughs in the potential use of such vectors for treating chronic ocular disease.
　　KEYWORDS:ocular diseases
&&& 随着医学技术的发展，采用药物、手术、激光等方法虽然可以有效治疗糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）、年龄相关性黄斑变性（age?related macular degeneration, AMD）的晚期并发症如视网膜新生血管、玻璃体积血和牵引性视网膜脱离等，却无法纠正其原发基因缺陷，从而大幅度地改善患者的视功能。尤其是先天性遗传性疾病如视网膜色素变性、Best&s病和Stargardt&s病的治疗缺乏确切的疗效。随着基因遗传学研究的深入和分子生物学技术的进步，基因治疗成为目前国内外研究热点，也为这些疾病的治疗带来了曙光。基因治疗成功的关键之一在于载体的选择，目前慢病毒载体以其特有的优势已逐渐成为广为关注的热点。
　　1慢病毒载体分类、生活周期及发展[1? 4]
　　慢病毒载体可以分为灵长类来源和非灵长类来源两大类，灵长类来源的包括人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV ）、猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）来源的载体，而非灵长类来源包括马免疫缺陷病毒（equine infectious anemia virus, EIAV）、猫免疫缺陷病毒（feline immunodeficiency virus, FIV）、牛免疫缺陷病毒（bovine immunodeficiency virus, BIV）来源的载体。其中对HIV?1型载体系统的研究最为广泛和深入，下面就以其为例介绍一下其生活周期。HIV?1基因组长约9.7 kb，在5&端有帽结构，3&端有多聚(A)尾。除了具有逆转录病毒[5]的基本结构基因长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)、gag（衣壳蛋白）、pol(病毒复制酶)、env(外膜糖蛋白)外，基因组还含有非常复杂的调控机制，包括 tat、 rev、 nef、 vif、 vpr、 vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV?1表达的蛋白一部分构成病毒颗粒的组成部分(如Vif、Vpr、Vpx)，一部分参与病毒基因的调节(如Tat、Rev)，此外有些病毒蛋白与细胞相互作用启动病毒增殖(如Vpu、Nef)。这一独特性对于HIV?1与宿主间长期相互作用及产生慢性活动性感染具有决定性作用。慢病毒首先要通过其病毒衣壳糖蛋白与细胞膜上特异性的受体结合发挥作用。灵长类慢病毒的主要受体为CD4和辅助受体，后者分两类：一类是CC型辅助受体（CC chemokine receptor），如CCR1、CCR2、CCR3、CCR5；另一类是CXC型辅助受体（CXC chemokine receptor），如CXCR4。病毒通过与CD4及辅助受体中的任何一个相互作用感染辅助T淋巴细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、树枝状细胞和郎罕细胞。一旦与细胞受体结合，病毒膜和细胞膜融合。随之病毒颗粒结合的基质和衣壳蛋白分解，核蛋白复合物被转运到细胞内，在胞浆中开始逆转录，以单链RNA为模板合成双链线性DNA。一旦线性病毒DNA的合成完成，在3&端和5&端的病毒整合酶特异性的切割和催化下，将之整合到宿主基因组中，成为宿主永久的遗传成分。这种整合的病毒双股DNA即前病毒。当前病毒被活化而发生自身转录时，LTR起着启动和增强其转录的作用。在宿主RNA聚合酶的作用下，病毒的DNA转录为RNA并分别经拼接、加帽或加尾形成HIV的mRNA或子代病毒RNA。mRNA在宿主细胞核糖体上翻译蛋白质，经进一步酶解、修饰等形成病毒结构蛋白gag、pol或调节蛋白rev、tat和nef等；子代RNA则与病毒结构蛋白装配成核衣壳，在从宿主细胞释出时获得包膜，成为具有传染性的子代病毒。目前供研究用的慢病毒载体的转移质粒结构中不含gag/pol，后者由包装质粒提供。因此，转移质粒一旦整合到宿主细胞，它就无法直接产生gag/pol，不能产生新的子代病毒，从而保证了其生物安全性[6]。慢病毒载体还通过与不同的包膜蛋白结合可以改变其与细胞亲和性或转导细胞方式，如水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV?G）可以与细胞表面普遍存在的磷脂成分（磷脂酰肌醇、磷脂丝氨酸及GM3神经节）结合而进入细胞内，使慢病毒载体有很广的宿主范围[7]；利用狂犬病毒?G蛋白包膜的马免疫缺陷病毒可使其具备逆向转运的能力，这一优势可使其应用于大脑或脊髓神经细胞，在该神经支配的肌肉处注射后，其可通过逆向转运而到达神经终末端的靶细胞，这一优势使其在脑和脊髓等神经系统的基因治疗的应用中有了新的价值[8]。
　　第一代慢病毒载体来源于HIV，将HIV的 env基因分裂或删除，插入外源性异种病毒启动子如猿猴病毒40（simian virus,SV40），而引入VSV?G包膜，提高了病毒滴度以及对多种组织的侵袭力，从而拓展了逆转录病毒的应用范围，但是因其结构与原始病毒很相近，很难应用于临床[9?11]。第二代慢病毒则将质粒一分为三，删除了病毒基因组的大部分致病成分，保留了病毒携带目的基因转染、逆转录及转基因长期表达的遗传特性,同时减少了辅助蛋白表达的副作用和免疫反应，其主要包含三种不同结构的质粒，分别是转移质粒(transfer vectors)，辅助质粒(helper plasmids)，包膜表达质粒(envelop expression plasmids),这种最小化系统已应用于HIV,ELAV和FIV来源的载体[1]。而目前应用最为广泛的第三代HIV?1来源的慢病毒载体，则采用四质粒系统，质粒一（如pMDL/pRRE）携带了两个结构基因 gag/pol编码序列及Rev效应元件(Rev responsive element,RRE);质粒二(如RSV?Rev)包含了病毒蛋白表达调节子rev 的序列;质粒三（如pRRL.SIN?18）是载体质粒;质粒四（如pMD.G）表达结构基因 env。该系统减少了辅助质粒和载体质粒的同源性，将其必需的三个结构基因 gag/pol和& rev编码序列隔离，分散在不同的质粒上，并除去反式激活因子tat，从而既保证了病毒的转染效率，又减少了产生复制型病毒的可能性，增加了载体系统的安全性[3,4]（图1? 6）。
　　2慢病毒载体的优势[12?14]
　　慢病毒载体与以往的逆转录病毒载体不同，它能同时感染分裂和非分裂细胞，包括造血干细胞、神经干细胞和处于终末分化的神经元等，而且较腺病毒载体的免疫反应小、可重复应用，其转移基因片段容量大，可达10kb，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体，并且能长期而稳定地表达，有报道可长达2a。它可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的&管家基因&的启动子。这些特点吸引了越来越多的学者的关注，并逐渐扩展到基因治疗的许多领域。
　　3慢病毒载体的包装与纯化
　　目前慢病毒载体包装多采用人胚胎肾上皮细胞293T细胞系，它是由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，因此所有含有SV40复制起始点与启动子区的质粒均可以在293T细胞中复制、表达[15]。该细胞生长快，贴壁疏松，可通过多个质粒的磷酸钙共沉淀法或脂质体转染法转染，通过观察报告基因的表达水平确定其转染效率。慢病毒包装后面临的一个难题就是不易获得较高的病毒滴度，而病毒滴度是细胞转染成功的关键，因此不同的慢病毒纯化技术相继产生，有研究证明：通过低温超速离心纯化浓缩技术,可将慢病毒滴度提高至109～1010 TU/mL[16,17]；另外通过肝素亲合质谱法纯化VSV?G包膜的慢病毒，可以得到53％的有感染性的病毒，同时去除94％的杂质[18]。另一方面有学者试用不同的包装细胞系来提高病毒产量，如293 EBNA?1 cells（来源于293细胞，并表达EB病毒核抗原?1）、293SF?PacLV（来源于293SF细胞），采用无血清培养基悬浮培养，收集原液中病毒滴度可达106~1010TU/mL[19,20]。这些技术的发展都为慢病毒在临床的应用带来希望。
　　4慢病毒载体的生物安全性
&&& 因为慢病毒载体的转基因可在靶细胞持久地表达，其安全性也受到瞩目，其中最令人关注的是：在包装病毒时能否通过基因重组产生具有复制能力的逆转录病毒(replication competent retrovirus ,RCR) 。最新一代的慢病毒载体(第3 代)将HIV?1 基因组中约60 %成分去除,因此父代病毒无法复制,载体本身只是将目的基因转移到靶细胞内的工具。而且利用逆转录机制构建自我失活(self?inactivating ,SIV)的HIV?1 来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题[21,22]。以HIV?1 为基础的第3代慢病毒载体系统的安全性甚至超过了目前临床试验正在使用的致癌性逆转录病毒载体。另外，越来越多的研究者关注如何使慢病毒载体携带的外源基因根据机体的需要进行有效调节，即一方面要求转基因处于无副作用的治疗剂量下恰当表达，另一方面要求通过人为的适时的中止表达，来达到治疗效果，且保证了治疗的安全性和可靠行，目前这种可调节的表达系统正在发展中，一些已经成功转入慢病毒载体系统，如应用最多、前景最好的四环素调节系统[23]。
　　5慢病毒载体在眼科应用的途径
　　目前慢病毒载体在眼科的应用途径主要为视网膜下间隙注射、玻璃体腔内注射、结膜下注射、前房注射等。眼后节疾病特别是视网膜疾病，主要采用视网膜下间隙注射途径，也有采用玻璃体腔内注射转染后的细胞如视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）和M&ller细胞治疗外层视网膜疾病;另外几种途径主要用于眼前节疾病[18,24?27]。
　　6慢病毒载体在眼科的应用领域
　　6.1慢病毒载体治疗遗传性视网膜变性性疾病&
　　视网膜变性性疾病是一组遗传异质性视网膜病变，可由许多基因突变引起。这些疾病主要以光感受器细胞、色素上皮细胞进行性变性和凋亡为主要特征，现在逐渐上升为主要致盲病。猴免疫缺陷病毒来源的慢病毒被首次应用于转导色素上皮来源的因子（pigment epithelium?derived factor,PEDF）至RCS大鼠动物模型中，改善了视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞的神经营养功能，从而达到治疗目的，也证明了神经营养性基因治疗可以应用于视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）[28]。但是通过视网膜下腔注射的HIV、EIAV等来源的慢病毒载体主要在RPE表达，在视网膜内层细胞包括感光细胞和神经节细胞的表达非常局限。视网膜变性不仅仅涉及RPE的病变，同时还伴有光感受器的变性和凋亡，因此还需要关注光感受器的功能改善，而后者必须建立在对感光细胞高转染效率的基础之上。目前已证明启动子在转基因的特异性表达中发挥关键作用，通过更换或者插入特异性的启动子可以提高其在特定细胞的表达水平，如利用视紫红质启动子不仅可以使其在感光细胞特异表达，而且较巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子还能明显提高其表达水平[29]。Nicoud等[30]联合利用光感受器细胞特异性表达的启动子如光感受器间维甲酸结合蛋白（interphotoreceptor retinoid?binding protein,IRBP）增强子联合视紫红质Rhodopsin启动子或磷酸二酯酶启动子，证明EIAV能够在光感受器细胞专一强效表达。同时，也有许多学者关注于利用视网膜干细胞移植来治疗该类疾病，但是视网膜干细胞移植功能的重建一直是一个难题，其受到许多因素的影响，尤其是其移植后分化整合问题。目前慢病毒以它的安全有效长期稳定表达的优势逐渐成为干细胞转基因研究的焦点，已有许多研究将其应用于胚胎干细胞、造血干细胞等，通过体外基因修饰，调节特定基因的表达水平，提高干细胞移植的成功率，从而达到治疗疾病的目的，提示慢病毒载体有可能应用于视网膜干细胞的转基因治疗，为视网膜变性性疾病的治疗开辟新道路[31?33]。
　　6.2慢病毒载体用于眼部新生血管性疾病&
　　眼部新生血管可以发生在影响不同的组织，如视网膜、角膜。早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity,ROP）、年龄相关性黄斑变性(age?related macular degeneration,AMD）、增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）、视网膜血管阻塞性疾病等的病理改变各不相同，但是都具有病理性新生血管的共同点。虽然目前光动力学治疗、手术治疗等在一定程度上可延缓病情的发展，但是最终预后均不理想。随着基因组学和蛋白组学的发展，已发现许多启动和抑制血管发生的基因，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管内皮抑素（Endostatin）和金属蛋白酶组织抑制剂?1（tissue inhibitor of metalloproteinase?1,TIMP?1）等。动物体内实验发现：应用慢病毒载体能有效转导某些抗新生血管基因至眼部组织中，抑制新生血管的形成，而且这种基因治疗较其他抗新生血管治疗的方法更长效[34]。
　　6.3慢病毒载体在其他眼科疾病的应用&
　　角膜移植后的排斥反应一直困扰着眼科医师，长期的药物治疗给患者带来了巨大的负担，因此希望通过基因治疗能够从根本上解决问题，但是一直未找到合适的载体。近来研究证明通过慢病毒转染，转基因可以在角膜内皮细胞较为长期且稳定表达，为角膜移植术后排斥反应的控制带来新的希望。研究发现玻璃体腔注射慢病毒在睫状体转染效率相对较低，而通过前房注射慢病毒，鼠类，猫动物模型及人的小梁网上都可以成功转导外源基因[35,36]。众所周知，小梁网与青光眼的治疗密切相关，控制着房水的排出，是调控眼压的重要因素，提示在今后的青光眼基因治疗中慢病毒载体可能成为一有利工具。另外，Cobrinik等[37]利用慢病毒载体来研究RB基因在视网膜母细胞瘤形成过程中的作用，为以后进一步探索视网膜母细胞瘤的发生机制及其基因治疗奠定了基础。
　　总之，慢病毒载体产生至今，随着生物工程技术的进步，其系统也在不断更新和优化，一方面提高了转染效率，另一方面又提高了其生物安全性，不断地渗透入眼科基因治疗的各个方面，但是在应用于临床之前，我们还将面临着许多工作，如进行大量的动物实验进行多方面、较长期的安全检测；对治疗性基因的表达进行恰当的调节等。希望通过不懈努力，慢病毒载体可以真正应用于临床眼科基因治疗中，为更多患者带来希望。
【参考文献】
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