[发明专利]鸡β肌动蛋白基因内含子1的用途有效
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GTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGG实施例2：哺乳动物表达载体的构建全长鸡β肌动蛋白基因的5’侧翼调控元件是来自Dr.N Fregien(ATCC37507)(Fregien N和Davidson N，1986)。它是通过限制性酶定位测序和定性，并且与公布的序列相匹配(Kost等人，1983)。1.494kb鸡肌动蛋白基因启动子片段通过Pst I和Hind III消化，并通过SDS凝胶纯化。该1.494kb Pst I/Hind III启动子片段进一步通过HinfI消化以获得1.006kb内含子1，并利用磷酸化Pst I/HinfI衔接子修饰，以使该内含子1(SEQ No：1)在5’端有Pst I并在3’端有Hind III。天然的基于鸡β肌动蛋白启动子的表达载体(图1)(SEQ ID NO：3)是通过将含有内含子1的全长鸡β肌动蛋白基因5’侧翼调控元件的1.272kbXho I/Hind III片段插到SalI/HindIII开启的基于pBR322的载体骨架而构成，以形成对照(肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA)(SEQ ID NO：3)，该载体骨架带有EcoRI/NotI位点，随后有polyA位点。对照质粒，p肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA(图1)是天然的基于鸡β肌动蛋白启动子的表达载体。它是通过用全长鸡β肌动蛋白基因启动子的1.272kb XhoI/HindIII片段(SEQ ID No：2)插到SalI/HindIII开启的pBR322载体骨架而构成，该骨载体架上有EcoRI/NotI多位点接头，随后为polyA位点。内含子1修饰的质粒pMH1(内含子1-肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA)(图2)(SEQ ID No：4)是通过将1.006kb SalI/PstI衔接子修饰的内含子1插到紧邻肌动蛋白启动子序列上游的SalI/PstI位点而构成。然后，将0.331kb间隔片段(无CMV启动子的CMV增强子)在正义方向上插到内含子1和肌动蛋白启动子之间的PstI位点。内含子1修饰的质粒pMH2(肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-内含子1)(图3)(SEQ ID No：5)是通过将PstI/HindIII衔接子修饰的1.006kb内含子序列插到紧邻polyA信号序列下游的PstI/Hind III位点而构成。然后，将0.331kb间隔片段(无CMV启动子的CMV增强子)在感觉方向上插到内含子1和肌动蛋白启动子之间的PstI位点。内含子1修饰的质粒pMH3(内含子1-肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-内含子1)(图4)(SEQ ID No：6)是通过将包含pMH1(SEQ IDNo：5)的肌动蛋白启动子的PvuI/NotI片段与包含pMH2(SEQ ID No：4)的pBR322骨架的PvuI/NotI片段相结合而构成。内含子1修饰的质粒pMH4(pCMV启动子-内含子1-多位点接头-polyA)(图5)(SEQ ID No：7)是通过将带有SalI/PstI位点的PCR扩增的0.82kb CMV启动子序列与PstI/HindII修饰的内含子1片段结合而构成。然后，将它插到SalI/HindIII开启的pBR322载体骨架的SalI/Hind III位点，该载体骨架上带有EcoRI/NotI接头，随后为polyA位点。内含子1修饰的质粒pMH5(pCMV启动子-内含子1-多位点接头-polyA-内含子1)(图6)(SEQ ID No：8)是通过将包含pMH4(SEQ ID No：7)的肌动蛋白启动子的PvuI/NotI片段与含有pMH2(SEQ ID No：5)的pBR322骨架的PvuI/NotI片段相结合而构成。内含子1修饰的pMH6的质粒(p内含子1-CMV启动子-内含子-1-多位点接头-polyA-内含子1)(图7)(SEQ ID No：9)是通过将SalI修饰的1.006kb内含子1序列在正义方向上插到pMH5(pCMV启动子-内含子1-多位点接头-polyA-内含子1)的CMV启动子上游的SalI位点而构成。内含子1修饰的质粒pMH7(p内含子1-PGK启动子-多位点接头-polyA)(图8)(SEQ ID No：10)，是通过将带有PstI/HindIII位点的0.572kb PCR扩增的PGK启动子序列插到PstI/HIndIII开启的pBR322载体骨架，该载体骨架带有EcoRI/NotI连接，随后有polyA位点。然后，将带有衔接子修饰的SalI/PstI位点的内含子1序列插到紧邻PGK启动子上游的SalI/PstI位点。富含GC的DNA片段修饰的质粒pMH8(p富含GC的片段-肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA)(图9)(SEQ ID No：11)是通过将带有SalI/PstI位点的合成的1.337kb富含GC的片段(SEQ ID No：13)插到紧邻pBR322载体骨架的肌动蛋白启动子序列上游的SalI/PstI位点，该载体骨架带有EcoRI/NotI连接，随后有polyA位点。富含GC的DNA片段(SEQ ID No：13)修饰的质粒pMH9(p肌动蛋白启动子-多位点接头-polyA-富含GC的片段)(图10)(SEQ ID No：12)是通过将PstI/HindIII衔接子修饰的合成的1.337kb富含GC的片段(SEQ IDNo：13)插到polyA信号序列下游的PstI/HindIII位点而构成。实施例3：鸡β肌动蛋白基因内含子1的GC含量分析下面列出鸡β肌动蛋白基因内含子1(SEQ ID No：1)：CTGCAGTGACTCGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCG
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<font color="#&具有增强药物动力特性的杂合肽[技术摘要]&本发明涉及源自各种反转录病*包膜(gp41)蛋白序列的增强肽序列，所述蛋白序列能够增强与其相连的核心肽的药动特性。本发明部分上基于以下发现：由增强肽序列和其相连接的核心肽所组成的杂合多肽具有增强了的药动特性，例如增加了半衰期。本发明进一步涉及通过将增强肽序列同核心肽相连，达到增强任何核心肽药动特性的方法。本发明所使用的核心肽包括任何在药物学上有用的肽，例如，用作或预防制剂的药物学上有用的肽。系<font color="#&免疫或血液增强、抑制肿瘤形成或生长以及或预防、症状或治疗症状的方法[技术摘要]&本发明涉及施用乳脂或乳脂类似物，任选地和至少一种其他因子，优选乳铁蛋白或金属离子乳铁蛋白，优选铁乳铁蛋白，优选牛乳铁蛋白，优选铁牛乳铁蛋白，或其金属离子功能性变体或功能性片段，以抑制肿瘤形成或生长，维持或改善白细胞计数、红细胞计数或骨髓细胞计数中的一种或多种，减轻恶病质、粘膜炎和贫血，*激免疫系统，以及或预防和症状和疗法的副作用。通过使用膳食(作为食品或食品增补剂)、保健食品或药物组合物可以实施本发明的方法和用途。还提供了用于本发明方法的组合物。电6&利用含有巨细胞病*增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子制造负链RNA病*载体的方法话7&纳米半导体粒子增强蛋膜纤维基复合材料的制备方法08&通过信号序列和分泌增强子生产可溶的天然形式的重组蛋白质29&一种具有高透光率的纳米纤维增强复合树脂的制备810&具有增强的逃出内体能力的重组BCG菌株|11&一种角蛋白晶须增强生物相容性同质复合膜及其制备方法612&增强了药动学性质的杂合多肽613&一种角蛋白晶须增强的天然蛋白质复合膜及其制备方法914&对虾非特异免疫增强剂寡肽的制备与应用215&增强低免疫原性抗原的免疫原性的药物组合物316&含有蛋白质的内部增强的**食品肠衣317&能增强眼细胞中明胶酶A活性的有机小分子118&具有增强的体内红细胞**素活性的融合蛋白619&经卵内喂养增强卵生物种的发育订购本套资料光盘请记录此编号：CC1102668本套资料包括专利技术全文资料19份，全部包括在一张光盘内。本套资料共收费230元全国市区范围可免费货到付款。订购电话：028-(分机)& 在线订购QQ: 值班电话：/ （周一至周六18：00以后，周日及法定节假日全天）& 以上所有技术资料集成在一张光盘内，是PDF格式的电子图书（非视频或录像)，光盘自带浏览器，所有Windows电脑均可查看，可以快递光盘也可以通过QQ、旺旺或电子邮件传送。化工、材料、类的资料包括原材料的配方配比，制造工艺，质量标准和工艺流程等，机械、设备、装置类的资料包括详细的设计方案，设计原理，附带有设计的结构原理图纸和图解说明，所有资料均包括技术发明人的姓名、联系地址、权利要求等信息，是企业和个人了解市场，开发技术、生产产品不可多得的参考资料。 售后服务：&&& 本部拥有85年至目前各行业的技术资料，实用技术，期刊，调研报告超过2000万项，凡购此套资料的客户，我们均免费更新至购买当日，因此你订购的资料条数会比你现在看到的更多，并且我们还将为你提供一年的免费更新服务。如果你在此没有找到你需要的技术资料，也请告诉我们，我们将根据你的需求为你量身订制。如果你急需资料，可以向以下账户汇款，资料通过QQ、旺旺或电子邮件在线传送(光盘随后寄出)中国工商银行 卡号：2882304 户名：游明洪&中国农业银行 卡号：3043214 户名：游明洪& 中国建设银行 卡号：0604641 户名：游明洪& 全国市区范围可免费货到付款。订购电话：028-& 在线订购QQ: 手机或订购：/ （周一至周六18：00以后，周日及法定节假日全天） 更多资料
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主营产品：[真核细胞常见表达载体]&1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。插入外源基因的克隆位点包括Sal1&[表达载体&载体&启动子&真核细胞&基因&克隆&目的基因&抗性基因]
1、pCMVp-NEO-BAN载体
特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent ProteinVector)
特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达。
用途:该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin,增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达。
用途:pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。
4、pSV2表达载体
特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。
5、CMV4 表达载体
特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。
其他常用克隆Vector：
pBluscript II KSDNA 15ug
pUC18DNA 25ug
pUC19DNA 25ug
pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA片段的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。
保存液: TEBuffer
TE Buffer组成:
10mM .HCL(Ph 8.0)
克隆外源DNA片断.
进行基因表达.
使用M13、T7和T3引物进行测序.
存在的问题
细胞的生命活动是一个复杂的调控过程，有些生命活动的机理还不完全清晰，由于插人的目的基因不同，载体构建栗用的顺式组件不同，组装的空间位置不同，采用的表达系统不同，目的基因表达水平和阳性克隆筛选率都会有很大差异。另外，由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性，所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达。再者，细胞生长状态的差异，转染方法的不同培养时阉的长短，筛选药物浓度的高低，对表达量都有很大影响。所以，需要综合评价一个表达载体和表达系统，排除一些不定因素，筛选出最佳组合
趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建。许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中，大大提高了目的基因的表达量，另外一些强的组成型启动子，如SV40早期启动子+PHTLv，已应用于大规模生产的细胞系中。
应用以GS为筛选标志的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能，是目前研究的重点。以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体。在同一启动子操纵下，筛选基因或报告基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用，表达出两种蛋白，因而在理论上可认为，通过了筛选或表达了报告基因的克隆必为阳性克隆，即表达目的基因的克隆，有报道说这种双顺反子的共表达率为90％。这就大大提高了筛选率，简化了实验过程。
将强启动子、增强子和可扩增的筛选标志组装在同一载体上，构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中，是当今构建研究发展方向。
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等你回答的问题：罗非鱼肌动蛋白基因启动子与生长激素基因的克隆及在真核细胞中的活性表达--《南京农业大学》2009年硕士论文
罗非鱼肌动蛋白基因启动子与生长激素基因的克隆及在真核细胞中的活性表达
【摘要】：
罗非鱼是世界性主要养殖鱼类,养殖范围已遍布105个国家和地区,是联合国粮农组织(FAO)向全世界推广养殖的优良品种。由于它具有味美、无脊间刺、易加工的优点,在许多国家正被作为海洋捕捞鱼类的替代品。随着世界海洋渔业资源量的减少,罗非鱼在国际水产品贸易中的地位越来越重要,交易量(额)逐年上升。
通过转基因技术可以培育出生长快速、抗逆罗非鱼,为此我们通过分子生物学手段获得了两个构成转基因表达载体的重要元件：肌动蛋白基因启动子和生长激素基因。所以本研究内容包括两部分：
以尼罗罗非鱼基因组DNA为模板,使用高保真PCR方法分离得到1675bp的β-actin基因启动子,且已知的典型调控序列并未发生变化。通过序列测定并与其他鱼类及人类β-actin基因启动子相比较,发现尼罗罗非鱼β-actin基因启动子调控区具有典型的启动子特征,含有TATA Box、CArG和CCAAT Box 3个重要的顺势作用元件。同时成功构建了CMV启动子缺失的含有p-actin基因启动子及EGFP基因的重组表达载体pEGFP-β-actin,并通过脂质体转染将重组表达载体pEGFP-β-actin转到NIH293T细胞中。荧光显微镜观察到NIH293T细胞中发出绿色荧光,结果表明尼罗罗非鱼β-actin基因启动子能够驱动EGFP的表达,证实在真核细胞水平尼罗罗非鱼β-actin基因启动子具有较好的表达活性。
从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脑垂体中分离其总RNA,经反转录合成为第一条cDNA链,再以第一条cDNA为模板,经过RT-PCR,克隆得到全长785bp的生长激素基因,序列分析表明：GH开放阅读框为615bp,共编码204个氨基酸；其中含有17个氨基酸的信号肽和187个氨基酸的成熟GH序列。同时我们将其插入到载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)报告基因融合,重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序进行鉴定。通过脂质体转染分别将pEGFP-GH重组表达载体、pEGFP-N1转到293T细胞中,以检测尼罗罗非鱼GH基因表达的活性。结果显示,阳性对照组pEGFP-N1,有荧光表达的细胞占90%以上;pEGFP-GH可见绿色荧光,但是有荧光表达的细胞较少,强度较弱。上述实验现象表明,所获得的尼罗罗非鱼GH基因具有较好的表达活性,能够在真核细胞中表达。
本研究成功获得了尼罗罗非鱼β-actin基因启动子和GH基因,同时通过细胞转染首次在真核细胞中有力的证实了其具有一定的生物活性；为进一步验证尼罗罗非鱼β-actin基因启动子和GH基因的生物活性,本试验还尝试将其转染到不同的真核细胞中,如Vero细胞(非洲绿猴肾细胞),仍然能够观察到有荧光发出,但强度要比在293T细胞中弱,这可能与细胞的特性有关。总之,本试验成功获得了有生物活性的尼罗罗非鱼β-actin基因启动子和GH基因,为将来进行转基因尼罗罗非鱼研究提供了两个重要的元件。
此外,本人还对太湖鲢鱼mtDNAD-loop区遗传多样性进行了研究,结果表明,太湖鲢鱼的mtDNAD-loop个体序列变异程度较大,遗传多样性较为丰富。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：S917.4【目录】：
ABSTRACT8-10
第一章 文献综述10-20
1. 启动子克隆方法的研究进展10-15
1.1 启动子及其结构模型10-11
1.2 启动子克隆的几种方法11-14
1.2.1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子11-12
1.2.2 利用PCR技术克隆启动子12-14
1.3 启动子克隆的意义14-15
2. 鱼类生长激素基因的研究进展15-20
2.1 鱼类生长激素的结构特征和功能15-17
2.2 鱼类生长激素的分离及活性检测17
2.3 我国鱼类生长激素基因的研究现状17-18
2.3.1 鱼类生长激素基因克隆18
2.3.2 鱼类转生长激素基因18
2.4 鱼类生长激素基因研究展望18-20
第二章 β-actin基因启动子与GH基因克隆与活性研究20-40
2. 实验材料20
3. 实验步骤20-29
3.1 尼罗罗非鱼采血方法20-21
3.2 罗非鱼脑垂体总RNA的提取及检测21-22
3.3 基因组DNA的提取及检测22-23
3.4 RT-PCR扩增23-24
3.5 PCR扩增24-25
3.6 DNA的纯化和回收25
3.7 克隆25-28
3.8 质粒DNA的提取28-29
3.9 阳性克隆的鉴定29
4. 细胞转染29-32
4.1 材料与试剂29-30
4.2 pEGFP-β-actin启动子表达质粒构建30
4.3 pEGFP-GH融合蛋白表达质粒构建30
4.4 细胞转染30-31
4.5 EGFP与293细胞31-32
5. 实验结果32-37
5.1 尼罗罗非鱼β-actin基因启动子功能验证结果32-34
5.1.1 尼罗罗非鱼β-actin启动子序列32-33
5.1.2 pEGFP-β-actin启动子表达质粒构建33-34
5.1.3 pEGFP-β-actin启动子在293T细胞中的启动表达34
5.2 GH基因与EGFP基因融合表达载体的构建及在真核细胞中表达34-37
5.2.1 罗非鱼脑垂体组织总RNA的完整性及纯度鉴定34-35
5.2.2 RT-PCR扩增结果35-36
5.2.3 pEGFP-GH构建与鉴定36
5.2.4 pEGFP-GH转染293T细胞及表达产物的检测与细胞内定位36-37
5.2.5 RT-PCR检测GH基因RNA水平表达37
6. 讨论37-40
6.1 尼罗罗非鱼β-actin基因启动子功能验证结果讨论37-38
6.2 GH基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在真核细胞中表达结果讨论38-40
第三章 太湖鲢鱼mtDNA D-loop区遗传多样性40-46
2. 材料和方法40-41
2.1 材料40
2.2 基因组DNA的提取40
2.3 mtDNA D-loop区的PCR扩增40-41
2.4 PCR产物纯化与目的片断的克隆及测序41
2.5 数据处理41
3. 结果41-44
3.1 PCR扩增及阳性克隆鉴定41-42
3.2 D-loop区序列多态性及核苷酸变异频率42-43
3.3 单倍型系统发育树构建43-44
4. 讨论44-46
4.1 太湖鲢鱼mtDNA D-loop序列多态分析44-45
4.2 太湖鲢鱼系统发育分析45-46
全文结论46-47
参考文献47-54
附录:试验试剂及配置54-57
攻读学位期间发表的学术论文57-58
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【参考文献】
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朱世华;杨迎春;沈锡权;邹记兴;郑文娟;余红卫;黄勃;;[J];动物学报;2006年03期
李思发,吕国庆,Ｌ.贝纳切兹;[J];动物学报;1998年01期
项方,邹记兴,邓凤姣,刘思阳,隋阳;[J];动物学杂志;2004年05期
李青青,张亚平;[J];动物学研究;2004年05期
陶峰勇,王小明,郑合勋,方盛国;[J];动物学研究;2005年02期
生书晶;陈菁;刘树滔;陈躬瑞;饶平凡;;[J];福建轻纺;2006年11期
曾润颖,刘小青,杨丰;[J];高技术通讯;2001年05期
徐斌,张培军,李德尚;[J];海洋与湖沼;1997年02期
朱作言,许克圣,李国华,谢岳峰,何玲;[J];Science B1986年14期
乌尼尔夫,芒来;[J];畜牧与饲料科学;2005年05期
【共引文献】
中国期刊全文数据库
陈勇;;[J];安徽农学通报;2007年22期
陈献忠;王正祥;;[J];安徽农学通报(上半月刊);2010年21期
刘志亮;齐兴柱;骆剑;朱晓平;彭艳辉;尹绍武;;[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年07期
林谦;;[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年13期
程超;明庆磊;耿兴平;;[J];安徽农业科学;2006年06期
陈万光;张海艳;;[J];安徽农业科学;2006年17期
刘学芳;平富强;赖松家;;[J];安徽农业科学;2007年02期
伍革民;郗正林;许晓风;;[J];安徽农业科学;2007年05期
程超;费杭良;;[J];安徽农业科学;2007年22期
白玉;;[J];安徽农业科学;2007年24期
中国重要会议论文全文数据库
周志刚;石鹏君;姚斌;何夙旭;苏永全;;[A];饲用酶制剂开发与应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
皇甫加清;张耀光;周传江;蒲德永;;[A];中国南方十六省（市、区）水产学会渔业学术论坛第二十六次学术交流大会论文集（下册）[C];2010年
谭围;王中铎;郭昱嵩;刘楚吾;刘丽;;[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会（第三卷）[C];2010年
周立斌;刘晓春;马细兰;林浩然;;[A];经济发展方式转变与自主创新——第十二届中国科学技术协会年会（第三卷）[C];2010年
郭昱嵩;王中铎;刘楚吾;陈志明;刘筠;;[A];中国海洋学会2007年学术年会论文集（下册）[C];2007年
张卫东;廖力;蒋立琴;徐淼锋;陈其文;;[A];中国植物病理学会2008年学术年会论文集[C];2008年
申泰铭;解庆林;李艳红;;[A];2007中国环境科学学会学术年会优秀论文集（上卷）[C];2007年
高春生;;[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
何云;王成章;高永革;李和平;胡喜峰;王彦华;张春梅;;[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
严家彬;李新辉;吴淑勤;杜合军;;[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库
张琴;[D];中国海洋大学;2010年
陈彩芳;[D];中国海洋大学;2010年
赖晓芳;[D];中国海洋大学;2010年
卞晓东;[D];中国海洋大学;2010年
郝振林;[D];中国海洋大学;2010年
贺厚光;[D];苏州大学;2010年
曾卫军;[D];华东师范大学;2011年
周茜;[D];南开大学;2010年
高山;[D];南开大学;2010年
陈霄;[D];浙江大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
张燕;[D];华中农业大学;2010年
陈秀荣;[D];华中农业大学;2010年
于艳梅;[D];华中农业大学;2010年
李炫丽;[D];华中农业大学;2010年
胡佳;[D];华中农业大学;2010年
龚文杰;[D];华中农业大学;2010年
呼光富;[D];华中农业大学;2010年
陈龚莉;[D];华中农业大学;2010年
王萍萍;[D];华中农业大学;2010年
徐娟;[D];郑州大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
胡小龙;;[J];安徽大学学报(自然科学版);1987年01期
江兴亮;[J];安徽师大学报(自然科学版);1998年04期
张智清,姚立红,侯云德;[J];病毒学报;1990年02期
李伍举,吴加金;[J];病毒学报;1997年02期
陈松林,邓文涛,刘宪亭,陈细华,龙华;[J];动物学报;1995年03期
张春光,赵亚辉;[J];动物学报;2000年04期
李思发,吕国庆,Ｌ.贝纳切兹;[J];动物学报;1998年01期
徐斌,张培军,苗宏志,李德尚,森山俊介,川内浩司;[J];动物学报;1998年02期
;[J];动物学杂志;1975年02期
项方,邹记兴,邓凤姣,刘思阳,隋阳;[J];动物学杂志;2004年05期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
杜智恒,白秀娟;[J];经济动物学报;2004年03期
李辉,帅素容,邢晋祎,赵中权;[J];湖北农业科学;2005年05期
俞沛初,华修国,郭传甲;[J];上海交通大学学报(农业科学版);2005年03期
许盛海;束婧婷;程金花;鞠慧萍;黄军;陈国宏;;[J];中国畜牧兽医;2007年02期
孙国凤;;[J];生物技术通报;1988年08期
朱作言;何玲;谢岳峰;李国华;;[J];水生生物学报;1990年02期
范必勤，王斌，江金益;[J];江苏农业学报;1995年03期
李吉涛;牟玉莲;张莉;杨述林;李奎;冯书堂;;[J];广西农业生物科学;2006年S1期
冯浩;傅永明;吴慧;刘筠;刘少军;;[J];生命科学研究;2011年02期
杜启艳;陈丽丽;南平;常重杰;;[J];水产科学;2007年04期
中国重要会议论文全文数据库
李辉;帅素容;赵中权;张仕华;;[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
段明;张堂林;胡炜;汪亚平;李钟杰;朱作言;;[A];中国鱼类学会2008学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
阎萍;张森;梁春年;包鹏甲;曾玉峰;郭宪;裴杰;褚敏;;[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
郑凯迪;黄颖颖;李云;;[A];中国鱼类学会2008学术研讨会论文摘要汇编[C];2008年
帅素容;李学伟;李辉;朱砺;赵中权;刘海峰;龚铭鑫;李燕琼;;[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
李辉;帅素容;邢晋祎;赵中权;;[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集（上册）[C];2004年
叶春;李英;施鹏;张建之;张亚平;;[A];中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2003年
罗军;武永厚;刘长国;刘文;;[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
孙少华;李雪梅;魏学蕊;李玉;常泽军;;[A];第四届中国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2001年
颜其贵;冯迎春;林涛;冯婷;于辉;李华;;[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集（下册）[C];2008年
中国重要报纸全文数据库
张昊华;[N];健康报;2006年
钟实;[N];中国渔业报;2007年
刘晓春?通讯员
罗永巨;[N];广西日报;2008年
彭德倩;[N];解放日报;2008年
何永进;[N];东方城乡报;2008年
苏雪;[N];中国渔业报;2008年
;[N];科技日报;2004年
农实;[N];科技日报;2007年
中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
何杰 朱志祥
张首领;[N];江苏农业科技报;2008年
冯沈萍;[N];中国农机化报;2002年
中国博士学位论文全文数据库
刘滨;[D];中国海洋大学;2008年
张焱如;[D];内蒙古农业大学;2005年
高春生;[D];西北农林科技大学;2008年
龙章富;[D];四川大学;2003年
孙维斌;[D];西北农林科技大学;2003年
王辉;[D];中国协和医科大学;1999年
范武江;[D];上海海洋大学;2011年
赵文明;[D];扬州大学;2008年
刘慧娟;[D];吉林大学;2010年
冉宇靓;[D];中国协和医科大学;1999年
中国硕士学位论文全文数据库
宋凯;[D];吉林农业大学;2008年
陶勇;[D];扬州大学;2001年
许盛海;[D];扬州大学;2007年
郝羽;[D];广东海洋大学;2011年
敖金霞;[D];东北农业大学;2003年
赵中权;[D];四川农业大学;2005年
丁洁;[D];四川大学;2007年
黄军;[D];扬州大学;2007年
林涛;[D];四川农业大学;2008年
殷雪;[D];四川大学;2004年
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